STERILISASI DALAM KULTUR

JARINGAN
 Macam-Macam Infestasi
• Organisme  Cendawan, bakteri, virus,
serangga
• Organisme tersebut pada umumnya terdapat
pada permukaan dan di dalam jaringan
tanaman
• Eksudat
• Kebanyakan bukan merupakan patogen,
akan tetapi kondisi in vitro menjadi
pendorong bagi pertumbuhan
mikroorganisme yang seringkali
memperbanyak diri dan tumbuh dengan
cepat, sehingga dapat membunuh eksplan
yang dikulturkan
 Infestasi Permukaan
• Dapat diatasi dengan pencucian dan perlakuan
kimiawi.
• Bagaimana memberikan perlakuan yang dapat
memusnahkan mikroorganisme tanpa merusak
jaringan eksplan.
• Apabila permukaan eksplan ditumbuhi oleh
rambut-rambut atau sisik, maka penetrasi bahan-
bahan kimia harus harus benar-benar
diperhatikan karena disinfestasi yang memadai
menghendaki adanya kontak antara bahan kimia
dengan mikroorganisme
• Pemberian pra-perlakuan atau penangan
tanaman induk dapat sangat mengurangi
infestasi mikroorganisme sehingga
mengurangi kepekatan bahan kimia yang
diberikan, yang pada gilirannya dapat
mengurangi kerusakan jaringan.
• Seringkali bagian tanaman disterilkan secara
menyeluruh kemudian bagian yang rusak atau
diperkirakan terinfestasi dipotong sehingga
diperoleh eksplan yang utuh dan bersih.
 Infestasi Endogen
• Organisme yang hidup di dalam jaringan
tanaman
• Sulit diatasi
• Pengendalian menggunakan pestisida dan
fungisida sistemik yang diberikan pada
tanaman induk sebelum pengambilan eksplan
atau diberikan langsung pada kultur.
• Eliminasi virus memerlukan perlakuan yang
lebih khusus
• Adakalanya dijumpai infestasi yang terjadi
setelah beberapa generasi pada kultur yang
nyata-nyata steril  agen infestasi menunggu
kondisi yang menguntungkan (infestasi laten).
• Infestasi dapat terjadi selama proses subkultur
atau dapat pula masuk melalui tutup wadah
kultur.
• Filosofi dasarnya adalah bahwa segala sesuatu
yang belum disterilkan secara spesifik adalah
sumber infestasi dan demikian pula halnya
dengan semua langkah kerja yang dilakukan.
 Eliminasi Virus
• Virus biasanya bersemayam di dalam sel-sel
jaringan dan ditransfer ke sel-sel baru selama
proses pembelahan sel  virus-virus tersebut
ditularkan ke progeni selama pembiakan vegetatif
• Virus-virus tersebut mungkin saja tidak
memperlihatkan gejala-gejala apapun selama
tanaman tumbuh di dalam kultur, namun gejala-
gejala tersebut muncul kemudian setelah tanaman
berada di lapangan
• Pendekatan utama dalam eliminasi virus
adalah penggunaan terapi panas.
• Pada kondisi pertumbuhan normal suatu
partikel virus dapat ditransfer ke jaringan-
jaringan baru seiring dengan pertumbuhan
ujung pucuk.
• Jika tanaman dapat ditumbuhkan pada suhu
tinggi, maka laju penggandaan virus dapat
diperlambat sehingga ujung pucuk dapat
tumbuh mendahului infestasi.
 Eksudat
• Bentuk lain kontaminasi selain organisme.
• Senyawa kimia yang dikeluarkan tanaman
(respon fisiologis)  akibat pelukaan
(pemotongan maupun perlakuan kimia).
• Ada yang berpengaruh terhadap
pertumbuhan kultur, ada yang tidak.
Cara mengatasi kontaminasi eksudat:
1. Pencucian bahan eksplan secara menyeluruh
sebelum dikulturkan.
2. Menghindari desikasi, menimalkan pelukaan.
3. Transfer eksplan ke medum segar sesering
mungkin padaminggu-minggu pertama kultur.
4. Menggunakan aditif kimiawi di dalam medium,
misal arang aktif dan polyvinylpyrrolidone (PVP).
Senyawa-senyawa antioksidasi seperti asam
askorbat, asam sitrat atau cysteine dapat
mengurangi atau menghindarkan produksi
sejumlah eksudat, terutama senyawa-senyawa
fenol.
5. Perendaman eksplan di dalam air steril dengan
suhu 50oC selama 5 – 15 menit telah berhasil
mengatasi eksudat fenol pada sejumlah tanaman asli
Australia.
6. Produksi eksudat berwarna gelap pada tanaman
Eucalyptus dapat dikurangi dengan menempatkan
kultur di dalam kondisi gelap selama beberapa hari.
7. Senyawa kimia lain yang tidak nampak namun
dapat memiliki pengaruh yang nyata adalah gas
etilen, gejala-gejalanya meiputi senesen dan
nekrosis pada daun.
 Disinfestasi Bahan Tanam
Metode Fisik >mengurangi jumlah populasi
mikroba
1. Perlakuan tanaman stok dengan kondisi
kering selama 3 - 4 minggu sebelum
pekerjaan kultur jaringan dimulai
Metode Fisik
2. Dibersihkan (pencucian, penyikatan, dll)
secara menyeluruh dan bagian-bagian yang
tidak akan dikulturkan dibuang.
3. Bahan tanaman selanjutnya dicuci dengan air
mengalir selama 20 menit sampai beberapa jam,
tergantung pada asal-usul bahan tanaman.
Metoda kimiawi >> menggunakan larutan natrium
hipoklorit (NaOCl), klorin, dll. Untuk meningkatkan
laju keberhasilan penggunaan klorin, dapat
ditempuh langkah-langkah berikut:
1. Tambahkan deterjen ke dalam larutan klorin,
misalnya beberapa tetes Tween 20 atau Triton.
2. Berikan tekanan rendah selama perlakuan
klorin. Hal ini dapat dilakukan menggunakan
desikator vakum yang dihubungkan ke pompa
air atau pompa jenis lain.
3. Kocok larutan klorin baik secara manual maupun
menggunakan penggojok (shaker) selama waktu
disinfestasi.
 Pemulihan Kultur yang
Terkontaminasi
Setiap kultur yang terinfestasi dapat diselamatkan dengan
menggunakan metoda sederhana berikut ini:
1. Buka wadah yang berisi kultur yang mengalami
infestasi dan isi dengan larutan natrium hipoklorit 0,5
– 1% w/v sampai batas bibirnya.
2. Biarkan selama 10 – 50 menit tergantung pada tingkat
keparahan infestasi atau kepekaan bahan tanaman.
3. Keluarkan kultur dari larutan klorin, potong bagian
bawahnya dan buang sisa-sisa daun.
4. Pindahkan ke medium kultur yang baru.
• Dapat pula eksplan tersebut dibilas dengan air
steril atau melewatkannya pada serangkaian
larutan natrium hipoklorit encer, misalnya 1% →
0,5% → 0,25% → 0,01% dan ditanam tanpa
dibilas terlebih dahulu dengan air steril >>
potongan tanaman yang akhirnya ditanamkan
pada medium steril membawa sejumlah klorin,
hanya tanaman yang tidak peka terhadap klorin
yang dapat diperlakukan dengan cara ini.
• Dengan metode pemulihan kultur yang
terinfestasi demikian, sebagian besar daun
kemungkinan mengalami pelunturan warna
(bleached).
 Sterilisasi Peralatan
• Dapat disterilkan dengan beberapa metode 
misalnya dengan iradiasi UV, penggunaan cairan
disinfestan atau lebih mudah dengan
menggunakan otoklaf atau menggunakan panas
kering pada suhu 180oC selama paling sedikit 3
jam.
• Untuk sterilisasi panas kering, peralatan seperti
skalpel, pinset dan gunting, cawan Petri, gelas
piala, dan lain-lain, pertama-tama dibungkus
sebelum disterilkan untuk menghindari
kontaminasi selama proses pendinginan.
 Teknik Sterilisasi
• Sumber utama kontaminasi adalah spora
cendawan yang membentuk bagian alam dari
atmosfir.
• Hendaknya diasumsikan bahwa agen kontaminan
berada di mana-mana  pakaian, kulit, rambut
dan juga nafas operator, jaringan tanaman,
peralatan, bagian luar wadah kultur, serta
permukaan bidang kerja
• Udara steril di dalam LAFC memungkinkan kita
secara bebas membuka tabung-tabung kultur dan
melakukan transfer steril
• Peralatan dapat disterilkan dengan
merendamnya di dalam alkohol 70 – 80%
diikuti dengan pembakaran menggunakan
sebuah lampu Bunsen atau lampu spiritus.
• Penggunaan pemutih merupakan alternatif
lain untuk mensterilkan peralatan yang
biasanya disterilkan dengan alkohol  Larutan
klorin encer (0,1 – 0,25 klorin tersedia) dapat
digunakan untuk tujuan ini
Berikut ini adalah hal-hal penting yang perlu
diingat sewaktu bekerja di depan LAFC:
1. Hindari setiap gangguan pada LAFC, karena
hal ini akan merubah pola aliran udara
sehingga dapat mengundang kontaminasi,
yakni dengan tidak meletakkan apapun antara
bidang kerja dengan sumber aliran udara.
2. Bekerja dengan jarak sebatas siku, mundur
sepraktis mungkin dari LAFC.
3. Tangan kanan hendaknya tetap bekerja di
sebelah kanan dan tangan kiri bekerja di
sebelah kiri daerah transfer. Hindarkan tangan
yang bersilang (berseliweran).
Ringkasnya, langkah-langkah berikut ini hendaknya
dilakukan ketika melakukan pekerjaan kultur
jaringan:
1. Semprot atau lap bagian dalam LAFC dengan etil
alkohol atau isopropil alkohol 70% sebelum
dihidupkan (sebaiknya gunakan alkohol 70%.
Alkohol 95% atau alkohol absolut dapat
menambat bakteri atau spora jamur tanpa
membunuhnya).
2. Hidupkan kabinet. Jika menggunakan lampu UV
(lihat Lampiran 6 untuk informasi lebih lanjut)
pastikan lampu ini dimatikan sebelum bahan
tanaman dimasukkan ke dalam kabinet.
3. Semprot semua wadah atau bahan-bahan
dengan etanol 70% sebelum dimasukkan ke
dalam LAFC.
4. Cuci tangan dan lengan Anda dengan sabun dan air, lalu usap
dengan etanol 70% sebelum melakukan manipulasi terhadap
tanaman. Penting untuk dicatat bahwa etanol tidak memiliki efek
residu; karenanya dianjurkan untuk menggunakan
Hexifoam4sebagai gantinya.
5. Jika menggunakan nyala api, bekerjalah dengan ekstra hati-
hati.
6. Atur bidang kerja Anda di dalam LAFC sehingga lalu-lalang
tangan yang berseliweran dapat dihindari.
7. Bila menggunakan Bacti-Cinerator, panaskan selama 10
menit untuk mendapatkan pijar api berwarna merah. Sterilkan
peralatan sebagai berikut: skalpel kecil selama 6 detik, pinset
kecil selama 8 detik, skalpel panjang selama 8 detik, dan pinset
besar selama 10 detik. Pastikan incinerator telah kembali
berpijar merah sebelum mensterilkan peralatan berikutnya.
Jangan memanaskan peralatan terlalu berlebihan. Lakukan
sterilisasi sesering mungkin.
8. Biarkan peralatan mendingin pada rak-rak
steril.
9. Jika bahan tanaman jatuh pada permukaan
LAFC, anggaplah telah terkontaminasi, dan
buanglah.
10. Setelah menyelesaikan pekerjaan transfer,
matikan LAFC, semprot atau lap dengan etanol
70%, dan tutup pintu depannya.