IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA

MIKROSKOPIS

Disampaikan oleh :
Tri Dyah A,S.ST.,M.Kes

Pemeriksaan Laboratorium Infeksi Bakteri

2021
 DOA BELAJAR

“Kami ridho Allah SWT sebagai Tuhanku, Islam

sebagai agamaku, dan Nabi Muhammad
sebagai Nabi dan Rasul, Ya Allah,
tambahkanlah kepadaku ilmu dan berikanlah
aku kefahaman”
 PEMERIKSAAN BAKTERI
• Mikroskopis :
1. Bakteri hidup :
a. Preparat tetes gantung, preparat tetes tegak
b. Mikroskop medan gelap
c. Pengecatan atau tanpa pengecatan

2. Bakteri mati :
a. Pembuatan preparat sediaan apus
b. Pengecatan

• Makroskopis : Pengamatan Koloni

 Smear Hidup Tidak Dicat
 Dalam sediaan ini microorganisme yang ada
masih hidup dan apabila bergerak dapat
kelihatan jelas
1. Tetesan tegak
a. Siapkan objek glass yang bersih
b. Ose yang sudah steril
c. Ose steril yang sudah dingin digunakan untuk
mengambil sampel / cultur bakteri, 1 ose utuh
d. Ose disterilkan lagi dan dikembalikan ketempatnya
e. Sediaan siap dilihat dengan mikroskop
f. Selesai pemeriksaan sediaan diberi desinfektan
2. Tetesan tegak dengan kaca penutup
Sama denga tetesan tegak, hanya sampel ditutupi dekglass
sebelum dilihat dibawah mikroskop

3. Tetesan gantung
a. Ambil sampel/cultur bakteri cair dengan ose yang sudah
steril
b. Letakkan pada tengah dekglass yang bersih dan beri
vaseline pada sisi ujung dekglass
c. Ose disterilkan dan dikembalikan ketempatnya
d. Objek glass cekung yang bersih ditutupkan pada dekglass
yang sudah terisi sampel
e. Obsjek glass dibalik dan dilakukan pengamatan
 Smear Hidup Dengan Dicat
 Dalam smear ini digunakan untuk pemeriksaan
protozoa, organisme masih hidup
 Pembuatan
a. Sediakan objek glass yang bersih
b. Setetes cat diletakkan pada permukaan objek glass
c. Ditambah seujung lidi sampel
d. Campur dengan baik
e. Tutup dekglass
f. Diamati dibawah mikroskop
 Smear Mati Dicat
 Smear dibuat dari bahan cair/padat yang lebih
dahulu dibuat suspensi dengan air garam, dan
dilakukan pengecatan
 Pembuatan
a. Sediakan objek glass yang bersih
b. Berikan tanda dengan spidol tentang letak sampel yang akan
diperiksa
c. Tambahkan satu ose sampel cair yang akan diperiksa pada area
yang ditandai
Apabila sampel padat, tetesi garam isotonis pada kaca objek
dan berikan sedikit sampel, campur baik-baik dan ratakan
dengan ose steril
d. Biarkan kering, dan dilakukan fixatie
 Pembuatan Preparat
Hasil pemeriksaan mikroskopis yang baik
Preparat yang dapat dilihat dengan baik ( tidak terlalu
tebal atau tipis)
Pengecatan preparat yang dilakukan secara benar

Ada beberapa cara pembuatan preparat

1. Preparat dengan bahan berasal langsung dari penderita
2. Preparat dari biakan cair
3. Preparat dari media pertumbuhan padat
 Pembuatan Preparat Smear

Bahan Preparat Dari Penderita

Bahan : sputum, pus, sekret vagina, discharge telinga, hidung, urin
( perlu disentrifuge , endapan dibuat preparat )

 Bahan diambil dengan ose steril/ kapas lidi

 Bahan digoreskan pada obyek glass.
 Panaskan obyek glass di atas nyala api spiritus
 Setelah kering tetesi formalin 1%, tunggu 5 menit ,
 Keringkan lagi, preparat siap dicat
 Pembuatan Preparat Smear
Dari sediaan Cair
1.Buat lingkaran dibawah kaca obyek
2.Taruhlah 1-2 ose suspensi
3.Ratakan pada area yang sudah ditandai
4.Biarkan kering
5.Fixatie

Sediaan padat
1.Buat lingkaran dibawah kaca obyek
2.Taruhlah 1-2 ose aquades steril
3.Ambil satu biakan bakteri, dan ratakan pada tetesan aquadest
4.Biarkan kering
5.Fixatie
 Fungsi Fixatie
1. Melekatkan sampel pada kaca objek
2. Mengawetkan sediaan
3. Mematikan organisme yang ada
4. Memudahkan bakteri/sel menggambil warna
 Metode fixatie

1. Dengan api bunsen

2. Dengan basa lemah (methyl alcohol, aceton,
formalin)
3. Dengan asam (asam cuka, asam kromat 1%)
4. Dengan garam (garam bichromat, sublimat)
 Jenis-Jenis Cat

Zat warna  Bersifat asam atau basa.

Zat warna asam

Bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif.
Zat warna basa
Bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan
mempunyai muatan positif.

Contoh zat warna asam :

Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin,
MalachiteGreen dll.

Contoh zat warna basa :

Eosin, Congo Red
 Klasifikasi Pengecatan Smear
 Jenis pengecatan
1. Pewarnaan Sederhana
• Pewarnaan positif
• Pewarnaan negatif
2. Pewarnaan diferensial
• Pewarnaan gram
• Pewarnaan acid fast
3. Pewarnaan khusus
• Pewarnaan endospora
• Pewarnaan flagel
 Pengecatan Sederhana

 Pengecatan yang hanya menggunakan satu

macam cat.
 Untuk mengetahui bentuk, susunan sel bakteri
 Positif : Safranin, metilen blue, basic fuchsin,
kristal violet
 Negatif : Tinta cina, tinta india
• Prosedur Pewarnaan negatif
Untuk mewarnai bakteri yang sulit terwarnai oleh zat warna basa.
Pewarnaan ini tidak mewarnai sel melainkan latar belakang.

Contohnya : Spirochaeta, treponema, leptospira

1. Siapkan 2 gelas benda bersih

2. Teteskan tinta cina pada ujung obyek
3. Ambil satu biakan bakteri dan campur dengan cat
4. Dengan obyek lain campuran tersebut dibuat hapusan
5. Keringkan dengan udara dan jangan difiksasi
6. Amati preparat dengan perbesaran kuat
7. Amati bentuk, susunan, warna dan latar belakang
 Contoh

Bacillus subtilis

Bacillus cereus
• Pewarnaan positif
Penggunaan mikroskop cahaya, umumnya sel bakteri susah diamati
dan tampak transparan. Pengunaan cat warna memberikan kontras
warna sel dan latar belakang sehingga bentuk, susunan warna sel
jelas, sesuai cat yang dipakai

Prosedur
1.Bersihkan obyek glas
2.Buat preparat smear dari biakan secara aseptik
3.Preparat smear dikeringkan dengan udara
4.Fiksasi diatas spirtus
5.Letakkan preparat diatas rak pengecatan dan beri 1-2 tetes cat
6.Cat dibiarkan 1-2 menit
7.Cuci dengan air mengalir, tiriskan
8.Amati dengan perbesaran kuat
 Contoh
Staphylococcus sp
Bacillus Subtilis
 Pengecatan Diferensial
Pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi.

Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan

peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan
lemak pada membran sel bakteri.

Untuk membedakan bakteri gram positif dan negatif berdasarkan

bentuk, susunan dan warna.
Gram negatif : dinding sel tipis dan terletak antara dua membran
Gram positif : dinding sel tebal dan membran sel selapis
 Pengecatan Diferensial
Pengecatan gram
A : Kristal violet : cat utama primer
B : Lugol iodine : mordan untuk memperjelas warna primer
C : Etanol : Aseton : peluntur
D : Safranin : peluntur atau penutup

Gram A ( Ungu)
Kristal Violet 2 gr, Etil alkohol 95% 20 ml, Ammonium oksalat 1% 0,8
gr, Akuades 80 ml
Gram B (Coklat )
Yodium 1gr, Kalium Yodida 2gr,Akuades 300ml
Gram C (Tidak berwarna)
Aseton 50ml, Etil Alkohol 95% 50ml
Gram D ( Merah)
Safranin 0,25gr, Etil Alkohol 95% 10ml, Akuades 90ml
Prinsip Pengecatan Gram
 PengecatanGram
 Prosedur
1. Buat preparat smear pada obsyek yang bersih
2. Sediaan dikeringkan dengan udara dan fiksasi dengan api spirtus
3. Sediaan digenangi dengan cat gram A , 1 menit
4. Cuci dengan air mengalir
5. Genangi dengan gram B selama 1 menit
6. Cuci dengan air mengalir
7. Genangi dengan cat gram C selama 30 detik
8. Cuci dengan air mengalir
9. Genangi dengan cat gram D selama 1 menit
10. Bakteri gram (+) berwarna biru, gram (-) berwarna merah
 PengecatanGram
 Hal-hal perlu diperhatikan
 Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang
mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel.
 Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan
overdecolorization sehingga sel gram positif
tampak seperti gram negatif.
 Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol
(underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara
sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
 Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang
tidak lebih lama dari 24 jam.
 Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna
utama (CV), khususnya pada gram positif.
 Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian
berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur.
Contoh Gram Positif
Bacillus sp
• Strepcoccus
 Contoh Gram Negatif
Pseudomonas sp
Klebsiella
• Salmonella sp
 Pengecatan Diferensial
Pengecatan Ziehl Neelsen (ZN)
Pengecatan Acid fast / Tahan Asam (BTA)
Bakteri Tahan Asam ( BTA positif)
Bakteri tidak tahan asam ( BTA negatif)

BTA (+) : setelah diberi cat utama ( ZN A) akan tahan terhadap

pencucian dengan asam dan alkohol ( ZNB), sehingga tidak mengikat
cat penutup (ZN C)  bakteri berwarna merah

BTA (-) : Cat utama akan dilunturkan oleh asam dan alkohol ,
selanjutnya akan mengikat cat penutup  Bakteri biru
 Pengecatan Diferensial
Acid fast
ZN A : Fuchsin : cat utama
ZN B : Asam alkohol : cat peluntur
ZN C : Methylen blue : cat lawan

Komposisi
Cat ZN A ( Merah)
Basic fuschin 0,3 gr, Alkohol 95% 10 ml, fenol 5ml, akuades 95ml
Cat ZN B ( tidak berwarna)
Asam klorida pekat 3ml, etil alkohol 95% 97 ml
Cat ZN C ( Biru)
Metilen biru 0,6ml, akuades 100ml
 Pengecatan Ziehl Neelson
 Prosedur :
1. Buat sediaan smear diatas obyekglas yang bersih
2. Sediaan yang sudah difiksasi deletakkan dijembatan pengecatan
3. Digenangi ZN A dan dilewatkan dinyala api spirtus sampai keluar
uap 5 menit
4. Dicuci dengan air mengalir
5. Larutkan warna merah sampai bersih dengan ZN B
6. Cuci dengan air mengalir
7. Genangi dengan ZN C selama 20-30 detik
8. Cuci dengan air mengalir
9. BTA (+) berwarna merah, BTA (-) berwarna biru
 Hasil Pengecatan ZN
BTA (+)
Berwarna Merah

BTA (-) Tidak ditemukan bakteri berwarna

Berwarna Biru merah
Hasil Pengecatan ZN
 Pengecatan Kusus
Pengecatan yang secara khusus digunakan untuk melihat alat
tambahan pada bakteri
Contoh :
1. Pengecatan Burri :melihat kapsul
Kapsul terlihat jernih, badan bakteri & sekitar hitam
2. Pengecatan Neisser : melihat Granula C. dyphteri
Granula biru kehitaman, badan bakteri kuning
3. Pengecatan Gray : melihat flagella
Flagella berwarna merah
4. Pengecatan Much Weiss : melihat granula M.tbc
Granula berwarna ungu, bakteri warna merah, latar
belakang biru
 Pengecatan Granula Neisser
 Neissser A dan Neisser B
 Prosedur
1. Sediaan digenangi dengan Neisser A selama 1 menit
2. Dicuci dengan aquadest
3. Genangi dengan Neisser B selama 10 detik
4. Dicuci dengan aquadest
5. Dikeringkan dan diamati dibawah mikroskop

Granulla diujung bakteri akan berwarna biru dan badan berwarna

kuning atau coklat
Hasil Pengecatan Neisser
 Pengecatan Kapsul : Burry
 Tinta cina/tinta india, safranin
 Prosedur :
1. Siapkan objek glass yang bersih, dan buat suspensi bakteri
dengan 1 ose air garam pada ujung kanan objek
2. Pada suspensi ditambahkan 1 osetinta cina, campur sampai
homogen
3. Dengan objekglass lain dibuat sediaan apus
4. Dibiarkan kering diudara
5. Digenangi dengan cat fuchsin selama 1 menit
6. Cat dibuang dan dibiarkan kering, kemudian amati dibawah
mikroskop
Kapsul bakteri tidak berwarna, badan bakteri berwarna ungu-merah
tua, latar belakang sedikit hitam
Bakteri yang biasadiamati klebsiela sp dan Bacillus sp
Contoh
 Pengecatan Spora : Wirtz Conklin
 Solutio Malachite green, Solutio Safranin
 Prosedur
1. Sediaan tipis digenangi dengan solutio makachit green dan
dipanasi sampai keluar uap kurang lebih 3-6 detik
2. Cuci dengan aquadest
3. Genangi dengan solutio safranin selama 30-60 detik
4. Cuci dengan aquadest
5. Keringkan dan periksa dibawah mikroskop

Spora berwarna hijau, badan bakteri berwarna kemerah-merahan

Bakteri yang diamati biasanya : clostridium dan bacillus
Hasil Pengecatan Spora
 Tabel Identifikasi Bakteri Gram +
Stahpylococcus sp • Coccus kecil-kecil
• Coccus berkelompok
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Tidak bergerak
Stomatococcus sp • Diplococci
• Kadang-kadang coccus berempat atau berkelompok
• Tidak berspora
• Ada yang berkapsul
• Tidak bergerak
Streptococcus sp • Coccus kecil-kecil
• Membentuk rantai pendek/panjang
• Tidak berspora
• Ada yang berkapsul
• Tidak bergerak
Bacillus sp • Batang persegi/cekung ujungnya
• Sendiri-sendiri, berpasangan
• Berspora
• Kadang berkapsul
• Tidak bergerak
 Tabel Identifikasi Bakteri Gram -
Neisseria sp • Diplococci
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Tidak bergerak

Escherichia Coli • Batang lurus

• Tidak berspora
• Kadang ada yg berkapsul
• Bergerak aktif dan ada yang tidak

Shigella sp • Batang
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Tidak bergerak

Salmonella sp • Batang
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Bergerak aktif
 Tabel Identifikasi Bakteri Gram -
Edwardsiella sp • Batang
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Bergerak aktif

Citrobacter • Batang
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Bergerak aktif

Klebsiella • Batang pendek-panjang

• Berpasangan/berderet
• Tidak berspora
• Berkapsul
• Tidak bergerak

Enterobacter • Batang
• Tidak berspora
• Kadang berkapsul
• Bergerak aktif
 Tabel Identifikasi Bakteri Gram -
Serratia sp • Batang
• Tidak berspora
• Kadang berkapsul
• Bergerak aktif
Proteus • Batang pendek-panjang
• Ada yang cocobacili
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Bergerak aktif
Providencia • Batang pendek-panjang
• Ada yang cocobacili
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Bergerak aktif
Vibrio sp • Batang pendek-panjang
• Ada yang cocobacili
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Bergerak aktif
 Tabel Identifikasi Bakteri Gram -
Pseudomonas sp • Batang lurus/bengkok
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Bergerak aktif

Legionella sp • Batang kecil-panjang, tumpul, pipih

• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Bergerak aktif]

Aeromonas • Batang lurus

• Pendek-panjang
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Bergerak aktif

Campylobacter • Batang
• Tidak berspora
• Tidak berkapsul
• Bergerak aktif
DOA SESUDAH BELAJAR

‫يم‬
ِ ‫ح‬ِ ‫ن ال َّر‬
ِ ‫م‬
َ ‫ح‬ ِ َّ‫م الل‬
ْ ‫ه ال َّر‬ ِ ‫س‬
ْ ِ‫ب‬

ً ‫طال‬
ِ ‫ل بَا‬
َ ‫ط‬ ًّ ‫ح‬
ِ ‫قا َوا ْر ُز ْق َنا اتِ ّـبَاعَ ه ُ َوَأ ِرنَا ا ْلبَا‬ َ ‫قـ‬ َ ‫م َأ ِرنَا ا ْل‬
َّ ‫ح‬ َّ ‫اَللَّ ُه‬
‫ه‬ ْ ‫َوا ْر ُز ْق َنا‬
ُ َ‫اجتِ َناب‬

Ya Alloh Tunjukkanlah kepada kami kebenaran

sehinggga kami dapat mengikutinya Dan
tunjukkanlah kepada kami kejelekan sehingga kami
dapat menjauhinya
TERIMAKASIH