II.

PEWARNAAN SEL BAKTERI

TUJUAN 1. Mengamati morfologi bakteri dengan melakukan pewarnaan sederhana
dari Pseudomonas aeruginosa, Sarcina lutea, dan Streptococcus sp. 2. Menentukan kelompok bakteri Sarcina lutea, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Sreptococcus sp. berdasarkan komposisi dinding sel dengan melakukan pewarnaan Gram 3. Menentukan bakteri yang mampu membentuk struktur endospora dengan melakukan pewarnaan endospora 4. Menentukan bakteri yang mampu membentuk kapsula dengan melakukan pewarnaan kapsula.

PENDAHULUAN
Mengamati sel bakteri dan mikroorganisme lainnya dalam keadaan hidup cukup sulit, bukan saja hanya karena ukurannya yang amat kecil tetapi juga karena keberadaan selnya yang transparan. Sel-sel bakteri praktis tidak berwarna bila berada dalam keadaan tersuspensi dalam medium cair. Untuk memenuhi kebutuhan pengamatan sel bakteri yang tembus cahaya itu maka dikembangkan metode pewarnaan. Banyak metode dan teknik pewarnaan bakteri yang dapat dilakukan untuk berbagai kepentingan penelitian. Secara ringkas, metode dan teknik tersebut adalah sebagai berikut :
Pewarnaan basa (langsung atau positif) Pewarnaan sederhana (menggunakan satu jenis zat pewarna)

Pewarnaan asam (tak langsung atau negatif)

Bertujuan untuk mengamati bentuk bakteri secara morfologis

Pengelompokan bakteri Pewarnaan diferensial (menggunakan lebih dari satu jenis zat perwarna) Penampakkan struktur sel bakteri

Pewarnaan Gram Pewarnaan tahan asam

pewarnaan flagella pewarnaan kapsula pewarnaan spora pewarnaan nukleus

Pewarnaan langsung atau positif mewarnai struktur mikroorganisme sementara pewarnaan tidak langsung atau pewarnaan negatif hanya mewarnai lingkungan Praktikum Mikrobiologi 2013

sekitar sel mikroorganisme. Hal ini terjadi berkaitan dengan muatan dinding sel mikroorganisme yang cenderung negatif bila berada di lingkungan dengan pH normal (sekitar 7).

PERSIAPAN YANG HARUS DILAKUKAN SEBELUM MELAKUKAN PROSES PEWARNAAN BAKTERI ADALAH :
Menyiapkan kaca obyek : kaca obyek harus bersih, kering dan terutama bebas

lemak. Kaca obyek yang kotor akan membuat pengamatan bentuk bakteri menjadi terganggu sedangkan lemak dapat menyebabkan bakteri sukar atau tidak dapat melekat pada kaca obyek. Bersihkanlah kaca obyek dengan sabun, air, dan alkohol 96 % sebelum dikeringkan dan digunakan.

Membuat apusan bakteri : Apusan bakteri pada kaca obyek dapat berasal dari

biakan cair atau biakan padat. Aapusan harus dibuat setipis mungkin, sehingga ketika dikeringkan akan diperoleh lapisan keputih-putihan yang semi transparan di atas kaca obyek. Apusan bakteri dari kultur cair : Ambil satu atau dua mata jarum ose kultur cair bakteri yang akan diwarnai secara steril, lalu teteskan di atas permukaan kaca obyek. Ratakan tetesan kultur tersebut menggunakan ujung jarum hingga diperoleh lapisan tipis berdiameter + 2 cm. Apusan bakteri dari kultur padat : Taruhlah setetes reagen (biasanya akuades) ke atas permukaan kaca obyek. Sentuhkan ujung jarum ose steril ke permukaan biakan padat bakteri yang akan diwarnai, lalu masukkan bakteri pada ujung jarum tersebut ke dalam reagen pada kaca obyek. Ratakan tetesan reagen berisi bakteri tersebut untuk memperoleh apusan seperti pada apusan dari kultur cair.

Fiksasi panas : Fiksasi dapat diartikan sebagai usaha melekatkan apusan bakteri pada kaca obyek. Apusan yang belum melekat kuat dapat ikut tercuci pada proses pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan membiarkan apusan mengering dengan sendirinya di udara terbuka (fiksasi udara), atau dengan melalukannya ke dekat nyala api Bunsen berulang-ulang (fiksasi panas). Jarak antara kaca obyek dengan api harus dijaga agar tidak lebih dekat dari 30 cm. Bila apusan terlalu dekat dengan api maka justru dapat terlepas dari kaca obyek, atau bentuk sel bakteri pada apusan akan rusak karena terbakar.

2.1 PEWARNAAN SEDERHANA PEWARNAAN NEGATIF PERALATAN

1. 2. 3. 4. 5. Mikroskop cahaya Kaca obyek dan penutup Botol semprot Kawat oose Pembakar Bunsen

BAHAN 1. Biakan mikroba: Pseudomonas aeruginosa, Sarcina lutea, dan

Streptococcus sp. 2. Tinta cina / nigrosin 3. Kertas tissue Praktikum Mikrobiologi 2013

PROSEDUR KERJA

1. Bersihkan kaca obyek dengan alkohol dan kertas tissue 2. Teteskan satu tetes nigrosin / tinta cina di ujung kaca objek 3. Secara aseptik ambil sejumlah sel dari kultur dan dicelup ke dalam tetesan tinta cina / nigrosin di atas preparat 4. Ambil satu kaca objek bersih, letakkan ujungnya dengan kedudukan miring di pinggir tetesan zat pewarna yang telah diinokulasi kultur bakteri 5. Kaca objek yang miring didorong sehingga tetesan tinta cina / nigrosin tersebar merata mebentuk apusan tipis 6. Apusan dibiarkan mengering di udara terbuka 7. Amati apusan di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x, gambar, serta beri keterangan. CATATAN: Hasil slide harus dibuat setipis mungkin.

2.2 PEWARNAAN GRAM

PRINSIP DASAR Pewarnaan Gram banyak dilakukan untuk identifikasi bakteri, terutama yang berkaitan dengan kesehatan, baik bidang kedokteran maupun farmasi. Prinsip dari pewarnaan ini adalah membedakan besar kecilnya kemampuan dinding sel mengikat warna dasar (crystal violet) setelah pencucian dengan alkohol 96%. Sel bakteri yang dindingnya mengikat crystal violet akan terwarna biru tua keunguan. Alkohol 96 % akan melarutkan lemak yang menjadi salah satu komponen penyusun dinding sel bakteri. Dinding sel yang lebih banyak mengandung lemak daripada peptidoglikan akan banyak terlarut setelah pencucian menggunakan alkohol, sehingga crystal violet yang terikat juga ikut tercuci. Setelah warna dasar tercuci, warna pembanding yang diberikan kemudian (biasanya zat pewarna safranin) akan lebih mudah diikat oleh sel, sehingga sel terwarna merah muda. Bakteri dengan dinding sel yang lebih banyak mengandung peptidoglikan dibanding lemak disebut sebagai bakteri Gram positif. Bakteri yang dinding selnya lebih banyak mengandung lemak dibanding peptidoglikan disebut bakteri Gram negatif. Sebelum diberikan warna pembanding safranin, zat pewarna crystal violet dimantapkan dulu ikatannya dengan sel dinding sel bakteri menggunakan lugol atau Gram iodine. Iodium dalam kedua zat tersebut akan berikatan dengan crystal violet membentuk kompleks tak larut alkohol (CV-I). Pada sel bakteri Gram positif, kompleks CV-I ini berikatan dengan komponen magnesium-asam nukleat pada dinding sel, membentuk kompleks Mg-RNA-CV-I yang sangat sulit untuk tercuci. Praktikum Mikrobiologi 2013

PROSEDUR KERJA

1. Buat apusan bakteri Sarcina lutea, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, dan Streptococcus sp. larutan crystal violet, biarkan terendam selama 1 menit. 3. Cuci kelebihan pewarna dengan air mengalir secara hati-hati. 4. Tetesi apusan dengan lugol atau Gram iodin, biarkan selama 1 menit. 5. Buang kelebihan reagen, jangan dicuci dengan air. 6. Rendam apusan dalam alkohol 96 % selama 30 detik. 7. Cuci apusan dengan air mengalir secara hati-hati. 8. Warnai dengan safranin selama 1 menit sebagai warna pembanding 9. Cuci kembali safranin yag berlebih di air mengalir lalu dikeringkan (blot) 10.Amati apusan di bawah mikroskop, gambar serta beri keterangan.

2. Teteskan pewarna dasar

2.3 PEWARNAAN ENDOSPORA

PRINSIP DASAR Beberapa anggota anaerob dari genera Clostridium dan Desulfomaculatum serta jenis yang aerob dari genus Bacillus adalah contoh dari bakteri-bakteri yang memiliki kemampuan untuk membentuk endospora dari sel vegetatifnya (memiliki kemampuan sporogenesis). Spora memiliki dinding yang sangat resisten terhadap kondisi ekstrim lingkungan dan mampu `berkecambah` kembali menjadi sel vegetatif yang aktif bila kondisi lingkungan telah kembali normal. Sebagai pewarna dasar digunakan zat pewarna malakit hijau. Zat ini mampu mewarnai sel maupun spora bakteri. Karena endospora sel biasanya telah memiliki lapisan khusus yang sulit ditembus zat pewarna, maka pemanasan dibutuhkan selama proses pengikatan warna dasar. Setelah pemberian warna dasar ini, baik spora maupun sel vegetatif bakteri akan terwarna hijau. Sebagai pencuci warna dasar cukup digunakan air kran yang mengalir. Pewarna dasar yang ada di dinding sel akan hilang sementara yang telah terperangkap dalam spora akan bertahan. Sel vegetatif bakteri menjadi tak berwarna sementara spora tetap terwarna hijau. Sel vegetatif bakteri ini kemudian diwarnai dengan warna pembanding safranin. Dinding sel yang menyerap safranin terwarna merah muda sementara spora tetap terwarna hijau. PROSEDUR KERJA

1. Buat apusan dari kultur Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa

2. Tutup apusan bakteri menggunakan kertas saring dan tetesi dengan malakit hijau di atas penangas air selama lima menit. Jaga agar apusan dan pewarna agar tidak mengering dengan terus menerus meneteskan malakit ke atas apusan selama pemanasan. 3. Cuci kelebihan pewarna menggunakan air mengalir secara hati-hati. 4. Tetesi apusan dengan safranin, biarkan 30 detik. 5. Cuci kelebihan warna dengan air mengalir. 6. Keringkan apusan dengan kertas hisap secara hati-hati. Praktikum Mikrobiologi 2013

7. Amati apusan di bawah mikroskop, gambar dan beri keterangan. Perhatikan warna spora dan sel vegetatif serta letak endospora dalam sel vegetatif.

2.4 PEWARNAAN KAPSULA

PROSEDUR KERJA 1. Buat apusan bakteri Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa tanpa fiksasi panas 2. Diteteskan kristal vilet dan dibiarkan terendam 5-7 menit 3. Kelebihan pewarna dicuci dengan tembaga sulfat 20% 4. Apusan dikeringkan dengan kertas hisap (tidak digosok atau ditempelkan) 5. Amati di bawah mikroskop, gambar dan beri keterangan.

Praktikum Mikrobiologi 2013