MODUL II

PEWARNAAN SEL BAKTERI

Rabu, 7 Februari 2018

I. Pendahuluan
Sel bakteri sulit diamati dalam keadaan hidup melalui mikroskop cahaya karena
ukurannya yang kecil dan warnanya yang transparan. Oleh karena itu, diperlukan suatu
teknik yang mempermudah pengamatan sel bakteri menggunakan mikroskop cahaya; salah
satunya dengan teknik pewarnaan.
Berdasarkan banyaknya zat warna yang digunakan, pewarnaan terbagi menjadi
pewarnaan sederhana (menggunakan satu jenis zat warna) dan pewarnaan diferensial
(menggunakan lebih dari satu jenis pewarna). Berdasarkan target zat warna, pewarnaan
dibagi menjadi pewarnaan langsung atau positif (apabila pewarna mewarnai bakteri,
menghasilkan sel berwarna di tengah latar belakang putih) dan pewarnaan tidak langsung
atau negatif (apabila pewarna mewarnai lingkungan, menghasilkan sel berwarna putih di
tengah latar belakang berwarna). Secara ringkas, teknik pewarnaan bakteri terangkum
dalam bagan berikut.

II. Pembuatan Apusan

a. Apusan basah
Apusan basah atau lebih dikenal sebagai preparat basah/preparat segar dibuat dengan
cara berikut.
1. Apabila kultur bakteri yang akan dibuat apusan merupakan kultur
padat: teteskan satu tetes akuades pada kaca objek, lalu inokulasikan
satu loop kultur menggunakan kawat Oose.
2. Apabila kultur bakteri yang akan dibuat apusan berasal dari kultur cair:
ambil satu loop kultur menggunakan kawat Oose, letakkan pada kaca
objek.
b. Apusan kering
 Pembuatan apusan kering atau preparat kering bertujuan untuk melekatkan bakteri/sel
pada kaca objek. Apusan kering dapat dibuat dengan dua metode: fiksasi udara dan
fiksasi panas.
1. Fiksasi udara
a. Buat apusan basah dari kultur yang diinginkan
b. Biarkan mengering dengan sendirinya di udara terbuka
2. Fiksasi panas
a. Buat apusan basah dari kultur yang diinginkan
b. Dekatkan kaca objek pada pembakar bunsen. Jarak antara
kaca objek dan pembakar Bunsen harus dijaga sedemikian
rupa (15-20 cm diatas bunsen) agar tidak merusak bentuk sel,
merusak kaca objek, atau melukai tangan. Untuk mencegah
kecelakaan, gunakan penjepit kayu saat memanaskan kaca
objek.

III. Teknik Pewarnaan

a. Pewarnaan Sederhana Negatif
Pewarnaan negatif/pewarnaan tidak langsung/pewarnaan asam merupakan
teknik pewarna sederhana yang mewarnai lingkungan bakteri sehingga, melalui
pengamatan mikroskop, akan tampak sel berwarna putih di tengah lingkungan
berwarna.

i. Alat:
1. Mikroskop cahaya
2. Kaca objek dan cover glass
3. Botol semprot
4. Kawat oose
5. Pembakar Bunsen
ii. Bahan:
1. Kultur Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium
2. Tinta cina/nigrosin
3. Tissue
4. Akuades
iii. Cara Kerja
1. Bersihkan kaca objek dengan alkohol dan kertas tissue
2. Teteskan satu tetes nigrosin / tinta cina untuk pembuatan pewarnaan
negatif ujung kaca objek
3. Ambil satu loop sel dari tiap kultur murni dan inokulasikan ke dalam
tetesan nigrosin (asam) dan CV/safranin (basa) di atas preparat.
 4. Ambil satu kaca objek bersih, letakkan ujungnya dengan kedudukan
miring di pinggir tetesan zat pewarna yang telah diinokulasi kultur
bakteri
5. Dorong kaca objek yang miring sehingga tetesan nigrosin tersebar
merata membentuk apusan tipis. Apusan yang dibentuk harus setipis
mungkin.

6. Apusan dibiarkan mengering di udara terbuka

7. Amati apusan di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x,
dokumentasikan, serta beri keterangan.

b. Pewarnaan Sederhana Positif

Pewarnaan positif/pewarnaan langsung/pewarnaan basa merupakan teknik pewarna
sederhana yang mewarnai dinding sel bakteri sehingga sel terwarnai berdasarkan reagen
pewarna yang digunakan di tengah lingkungan tidak berwarna.
i. Alat:
1. Mikroskop cahaya
2. Kaca objek dan cover glass
3. Botol semprot
4. Kawat oose
5. Pembakar Bunsen
ii. Bahan:
1. Kultur Sarcina lutea dan Vibrio sp.
2. Cristal Violet atau Safranin
3. Tissue
4. Akuades
iii. Cara Kerja
1. Bersihkan kaca objek dengan alkohol dan kertas tissue
2. Teteskan satu tetes CV / safranin untuk pembuatan pewarnaan positif
ujung kaca objek
3. Ambil satu loop sel dari tiap kultur murni dan inokulasikan ke dalam
tetesan CV/safranin diatas preparat
4. Ambil satu kaca objek bersih, letakkan ujungnya dengan kedudukan
miring di pinggir tetesan zat pewarna yang telah diinokulasi kultur
bakteri
5. Dorong kaca objek yang miring sehingga tetesan CV/safranin tersebar
 merata membentuk apusan tipis seperti langkah pewarnaan sederhana
negatif. Apusan yang dibentuk harus setipis mungkin.
6. Apusan dibiarkan mengering di udara terbuka
7. Amati apusan di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x,
dokumentasikan, serta beri keterangan.

c. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram adalah teknik pewarnaan yang paling sering dilakukan di
laboratorium mikrobiologi. Teknik ini membagi bakteri menjadi dua kelompok, Gram
positif (terwarnai ungu) dan Gram negatif (terwarnai merah), berdasarkan komposisi
dinding sel.

i. Alat:
1. Mikroskop cahaya
2. Kaca objek dan cover glass
3. Botol semprot
4. Kawat oose
5. Pembakar Bunsen
6. Pipet tetes
ii. Bahan:
1. Kultur Sarcina lutea, Bacillus cereus, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa
 2. Pewarna kristal violet (CV)
3. Pewarna safranin
4. Lugol/Iodin
5. Alkohol 96%
6. Akuades
7. Tisu
iii. Cara Kerja
1. Buat apusan kering dari bakteri yang akan diwarnai dengan apusan
basah dari kultur yang diinginkan, kemudian dekatkan kaca objek pada
pembakar Bunsen (jarak ±15-20 cm). Jarak antara kaca objek dan
pembakar Bunsen harus dijaga sedemikian rupa agar tidak merusak
bentuk sel, merusak kaca objek, atau melukai tangan
2. Setelah siap apusan kering, tetesi dengan satu tetes kristal violet,
biarkan terendam selama satu menit.
3. Cuci kelebihan pewarna dengan akuades dalam botol semprot.
4. Tetesi apusan kering dengan lugol/iodin, biarkan terendam selama 1
menit
5. Bilas apusan dengan meneteskan alkohol 96% selama 10-30 detik
6. Cuci kelebihan reagen dengan akuades dalam botol semprot.
7. Tetesi apusan dengan safranin, biarkan terendam selama 5-10 detik
8. Cuci kelebihan reagen dengan akuades dalam botol semprot,
keringkan menggunakan tisu dengan hati-hati.
9. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x (ditambahkan
minyak imersi) ,dokumentasikan.

d. Pewarnaan Endospora

i. Alat:
1. Mikroskop cahaya
2. Kaca objek dan cover glass
3. Botol semprot
4. Kawat oose
5. Pembakar Bunsen
6. Pipet tetes
7. Penangas air
8. Penjepit kayu
ii. Bahan:
 1. Kultur Bacillus megaterium dan Enterobacter aerogenes umur 24
jam dan 48 jam dalam medium NA
2. Kertas saring/kertas hisap
3. Pewarna malakit hijau
4. Pewarna safranin
5. Akuades
6. Minyak imersi
7. Tisu
iii. Cara Kerja
1. Buat apusan kering dari bakteri yang akan diwarnai endospora dari
apusan basah pada kultur yang diinginkan, kemudian dekatkan kaca
objek pada pembakar Bunsen (jarak ±15-20 cm). Jarak antara kaca
objek dan pembakar Bunsen harus dijaga sedemikian rupa agar tidak
merusak bentuk sel, merusak kaca objek, atau melukai tangan
2. Tutup apusan dengan kertas hisap
3. Jepit dengan penjepit kayu
4. Tempatkan apusan yang telah ditutupi dengan kertas hisap di atas
penangas sambil ditetesi malakit hijau selama lima menit
5. Buang kertas hisap dan cuci kelebihan pewarna menggunakan akuades
6. Tetesi apusan dengan safranin, rendam selama 30 detik
7. Cuci kelebihan reagen dengan akuades dalam botol semprot.
8. Keringkan apusan menggunakan tisu atau kertas hisap secara hati-
hati
9. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x,
dokumentasikan.
e. Pewarnaan Kapsula

i. Alat:
1. Mikroskop cahaya
2. Kaca objek dan cover glass
3. Botol semprot
4. Kawat oose
5. Pipet tetes
ii. Bahan:
1. Kultur Bacillus megaterium dan Enterobacter aerogenes umur 24
dan 48 jam dalam medium skim milk agar
 2. Pewarna kristal violet (CV)
3. Larutan tembaga sulfat 20%
4. Akuades
5. Tisu
iii. Cara Kerja
1. Buat apusan basah dari bakteri yang akan diamati kapsulnya.
2. Tetesi dengan satu tetes CV, biarkan terendam selama 5-7 menit.
3. Cuci kelebihan pewarna dengan tembaga sulfat 20%.
4. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x,
dokumentasikan.
IV. MSDS
Cari nama kimia, sifat kimia dan fisika, potensi bahaya, handling, dan penanganan apabila
terjadi kecelakaan dari zat CuSO4 20%, malakit hijau, nigrosin, alkohol 96%,
CV,safranin,lugol!

V. Poin Literatur
a. Deskripsi jenis Gram dan morfologi bakteri sampel + gambar
b. Fungsi reagen, medium, dan cara kerja seperti tertera di atas
c. Deskripsi bakteri yang memiliki kapsul dan endospora

VI. Peralatan yang Harus Disediakan

a. Tertera di daftar alat dan bahan, kecuali penangas air dan mikroskop karena
disediakan di laboratorium.
b. Kaca objek dan cover glass minimal 6 per-kelompok
c. Kawat Oose bulat minimal 2 per-kelompok
d. Botol selai
e. Pipet tetes
f. Plastik tahan panas ukuran 2kg
g. Gloves
h. Masker
i. Korek api
j. Sabun cuci tangan
k. Penjepit kayu perkelompok minimal 1

VII. FORMAT HASIL PENGAMATAN

Judul
Tanggal Praktikum :
Tanggal Pengamatan :
Kultur/Sampel :
Umur :
Medium :
Reagen :
Perbesaran :
Keterangan :