LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI
Morfologi dan Sifat-Sifat Bakteri dengan Pengecatan

NAMA : Aly Sahid Saifullah

NIM : P07120220026
KELAS : Sarjana Terapan Keperawatan dan Profesi
Ners

JURUSAN KEPERAWATAN
POLITEKNIK KESEHATAN YOGYAKARTA
2021/2022
ACARA : 3. Morfologi & Sifat-Sifat Bakteri dg Pengecatan
TANGGAL PRAKTIKUM : 25 Maret 2021
TUJUAN PRAKTIKUM : Untuk mengetahui bentuk dan sifat-sifat bakteri dengan
cara mewarnai objek glass.

DASAR TEORI :
Bakteri  mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri
merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri
juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat
dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut
maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara
yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk
mempernudah proses identifikasi  bakteri.
Pengecatan Sederhana adalah pengecatan yang dilakukan jika cat yang
dugunakan untuk mengecat bakteri hanya satu macam saja. Zat warna yang biasa
digunakan dalam pengecatan ini adalah : Metylene Blue, Fuschin basa, Cristal violet.
Zat warna ini dalam mewarna bakteri dapat bekerja dengan baik karena mengandung
gugusan fungsional (khromofor) bermuatan positif yang disebut zat warna basa,
sedangkan sel-sel bakteri pada umumnya bermuatan negatif, sehingga sel-sel dapat
mengikat zat warna dengan baik. Zat warna yang mengandung khromofor bermuatan
negatif disebut zat warna asam.
Pengecatan Negatif adalah pengecatan yang tidak langsung, pada pengecatan ini
yang terarsir oleh cat adalah hanya latar belakang dari sel bakteri, sedangkan bakterinya
sendiri akan berwarna transparan. Pengecatan Gram merupakan cara pewarnaan
deferensial, sehingga dengn cara ini bakteri dapat dibedakan menjdi dua golongan, yaitu
:
- Bakteri Gram Positif
- Bakteri Gram Negatif
Dalam pengecatan diperlukan 4 jenis larutan, yaitu :
1. Zat warna basa
2. Larutan Mordant ( larutan Intensifikasi warna ), yaitu larutan yang dapat menaikkan
afinitas yaitu meningkatkan pengikatan antara sel dan zat warna. Contoh larutan
mordant : asam, basa, garam metal, Yodium.
3. Larutan pencuci warna ( larutan Peluntur Cat / Decolorizer ), untuk melepaskan
warna dari sel bakteri, setelah pewarnaan pertama pada pengecatan bertingkat.
Karena bakteri tertentu akan lebih mudah melepaskan, sehingga perbedaan kecepatan
melepaskan zat warna ini merupakan ciri bakteri tertentu, dan digunakan sebagai ciri
identifikasi.
4. Larutan zat warna penutup ( Counterstain ), yaitu zat warna kedua yang digunakan
setelah dicuci dengan larutan pencuci, zat warna ini mempunyai warna berbeda dari
yang pertama. Sel-sel yang tidak dapat segera melepaskan zat warna pada waktu
pencucian, akan tetap seperti zat warna pertama. Sedangkan sel-sel yang segera dapat
melepaskan warna pertama pada pencucian akan mengikat zat warna kedua.
Mekanisme pengecetan Gram : bila suatu bakteri dilakukan pengecatan Gram
dengan pewarna pertama (disebut sebagai Gram A) zat warna basa Cristal Violet,
menggunakan suatu mordant yaitu larutan yodium (lugol), sel kemuadian dicuci dengan
menggunakan alkohol untuk menghilangkan cristal violet, setelah dicuci dengan air
mengalir, kemudian diwarnai dengan Counterstain yaitu Safranin. Sel-sel yang tidak
dapat melepaskan zat warna pertama dan akan tetap berwarna Cristal violet yaitu biru-
ungu, maka bakteri tersebut bakteri “Gram Positif”, sedang sel-sel yang dapat
melepaskan cristal violet dan mengikat safranin sehingga berwarna merah-merah muda,
maka bakteri ini disebut bakteri “Gram Negatif”
ALAT DAN BAHAN :
A. Praktikum pewarnaan negatif dan Pewarnaan sederhana
Bahan : 1. Bakteri bacillus subtilis
2. Bakteri staphylococcus aureus
3. Bakteri E. coli
4. Pewarna safranin
5. Pewarna kristal violet
6. Alkohol
7. Tinta cina
8. Minyak imersi

Alat : 1. Obyek glass

2. Spidol
3. Ose bulat
4. Lampu bunsen spiritus
5. Mikroskop
6. Jembatan pengecatan
B. Praktikum pewarnaan gram
Bahan : 1. Biakan bakteri
2. Larutan kristal violet (pewarna primer)
3. Larutan iodin/lugol (mordant)
4. Alkohol 95% (zat dekolorisasi)
5. Safranin (pewarna tanding)
6. Akuades
7. Minyak imersi
Alat : 1. Kaca objek
2. Bunsen
3. Jarum ose
4. Penjepit kayu
5. Korek api
6. Rak pewarnaan
7. Pipet tetes
8. Objek glass
 9. Slide dryer
10. Mikroskop
C. Pewarnaan tahan asam
Bahan : 1. Sampel BTA ( Bakteri Tahan Asam)
2. Carbol fuchsin
3. Asam alkohol 3%
4. Methilen blue
Alat : 1. Objek glass
2. Tusuk gigi
3. Pensil
4. Preparat
5. Lampu bunsen
6. Mikroskop
CARA KERJA :
 Pewarnaan negatif
1. Siapkan alat dan bahan
2. Beri tanda obyek glass dengan spidol permanen kemudian fiksasi dengan alkohol di
bagian sebaliknya.
3. Panaskan ose sampai membara berwarna merah, pastikan tetap steril
4. Ambil suspensi bakteri bacillus subtilis secara aseptis sebanyak 3 ose, letakkan dalam
obyek glass.
5. Panaskan kembali ose sampai membara.
6. Tambahkan 1 tetes kecil tinta cina, campur dengan bakteri sampai homogen.
7. Buat hapusan merata.
8. Keringkan hapusan dalam suhu ruang.
9. Amati dibawah mikroskop

 Pewarnaan sederhana
1. Panaskan ose sampai membara berwarna merah, pastikan tetap steril
2. Ambil obyek glass yang telah difiksasi dengan alkohol, kemudian beri tanda kotak
untuk bakteri staphylococcus aureus.
3. Ambil 3-5 ose bakteri staphylococcus aureus, ratakan pada kotak yang telah
disediakan.
4. Ambil 3-5 ose bakteri E.coli, ratakan pada kotak yang telah disediakan.
5. Panaskan ose sampai membara.
6. Fiksasi obyek glass yang berisi bakteri diatas nyala api sampai benar-benar kering
dan bakteri mati atau timbul bercak.
7. Siapkan jembatan pengecatan diatas wastafel.
8. Genangi preparat staphylococcus aureus dengan kristal violet dan E. coli dengan
safranin sampai penuh selama 3 menit.
9. Buang cat, cuci dibawah air mengalir sampai bersih
10. Kering angin-anginkan
11. Amati dibawah mikroskop dengan lensa obyektif 100x ditambah minyak imersi

 Praktikum pewarnaan gram

 Tahap persiapan preparat
1. Nyalakan bunsen dengan korek api
2. Ambil kaca preparat dan bersihkan kaca preparat
3. Ambil jepit kayu dan jepitkan pada kaca objek
4. Lakukan pembersihan pada kaca objek dengan cara dilalui api
5. Ambil dan bakar jarum ose pada api bunsen hingga terlihat membara agar siap
digunakan.
6. Teteskan akuades pada ose, letakkan di tengah preparat
7. Panaskan kembali ose sampai membara
8. Siapkan isolat pada media kultur nutrien agar, sebelumnya lalui tepian cawan
petri pada api sebelum membuka cawan
9. Isolat diambil perlahan dalam jumlah sedikit menggunakan ose yang
sebelumnya sudah dibakar
10. Oleskan isolat yang terambil pada bagian tengah yang sebelumnya ditetesi
akuades dan kemudian ratakan dengan menggunakan ose
11. Panaskan kembali ose sampai membara
12. Lakukan tahapan fiksasi secara berhati-hati dengan cara kaca objek dilalui
oleh api
 Tahap pewarnaan (staining)
1. Ambil larutan kristal violet sebagai pewarna primer menggunakan pipet tetes
2. Teteskan di biakan bakteri pada objek glass, biarkan selama 1 menit
3. Bersihkan menggunakan akuades
4. Tambahkan larutan lugol sebagai mordant, biarkan selama 1 menit
 5. Bersihkan menggunakan akuades
6. Teteskan alkohol sebagai proses dekolorisasi selama 5 detik, segera bilas
menggunakan akuades
7. Teteskan safranin sebagai pewarna tanding dari kristal violet, biarkan selama
1 menit
8. Cuci menggunakan akuades
9. Letakan kaca objek diatas slide dryer
 Tahap pengamatan
1. Siapkan preparat yang akan diamati
2. Teteskan minyak imersi 1 tetes di kaca objek
3. Lakukan pengamatan dibawah mikoskop
 Praktikum pewarnaan tahan asam
1. Ambil sputum sampel sekitar 1 butir kacang ijo menggunakan tusuk gigi
2. Tempelkan di objek glass, ratakan pada objek glass menggunakan tusuk gigi
3. Lakukan teknik pewarnaan dengan metode ziehl-neelsen
4. Fiksasi selama 3x dengan api bunsen
5. Tuangkan carbol fuchsin sampai rata
6. Bakar sampai keluar asap
7. Diamkan selama 5 menit
8. Cuci dengan air mengalir
9. Berikan asam alkohol 3% sampai warna carbol fuchsin hilang
10. Cuci dengan air mengalir
11. Tambahkan methilen blue selama 3 detik
12. Cuci lagi dengan air
13. Amati di bawah mikroskop
HASIL PENGAMATAN :

Tanggal Pengamatan : 25 Maret 2021

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
Keterangan Gambar : bakteri bacillus subtilis
POLTEKES YOGYAKARTA
1. Pengecatan : pewarnaan negatif (tinta cina)
2. Warna koloni : transparan
3. Keterangan gambar :
a. bentuk bakteri batang
b. susunan bakteri berderet
4. Kesimpulan :
Bakteri bacillus subtilis setelah dilakukan
pewarnaan negatif dengan tinta cina dan diamati
PREPARAT :
PERBESARAN : 1000x
dengan perbesaran 1000x dapat terlihat
bentuknya batang , berwarna transparan, dan
mempunyai susunan yang berderet.

Tanggal Pengamatan : 25 Maret 2021

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
Keterangan Gambar : bakteri staphylococcus
POLTEKES YOGYAKARTA
aureus
1. Pengecatan: pewarnaan sederhana (kristal
violet)
2. Warna koloni : violet
3. Keterangan gambar :
a. bentuk bakteri bulat
b. susunan bergerombol
4. Kesimpulan :
PREPARAT :
PERBESARAN : 1000x
Bakteri staphylococcus aureus setelah
dilakukan pewarnaan secara sederhana dengan
pewarna kristal violet dan diamati dengan
perbesaran 1000x dapat diamati bahwa bakteri
tersebut berwarna violet, berbentuk bulat, dan
susunanya bergerombol.
Tanggal Pengamatan : 25 Maret 2021

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
Keterangan Gambar : bakteri E.coli
POLTEKES YOGYAKARTA
1. Pengecatan : pewarnaan sederhana (safranin)
2. Warna koloni : merah
3. Keterangan gambar :
a. bentuk bakteri batang
b. susunan menyebar/terpisah
4. Kesimpulan :
Bakteri E.coli setelah dilakukan pewarnaan
secara sederhana dengan pewarna safranin dan
PREPARAT :
PERBESARAN : 1000x diamati dengan perbesaran 1000x dapat diamati
bahwa bakteri tersebut berwarna merah,
berbentuk bulat, dan susunanya
menyebar/terpisah.

Tanggal Pengamatan : 25 Maret 2021

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
Keterangan Gambar : bakteri gram negatif
POLTEKES YOGYAKARTA
1. Pengecatan : pewarnaan gram
2. Warna koloni : merah
3. Keterangan gambar :
a. berbentuk batang
b. susunan bakteri berderet
4. Kesimpulan :
Bakteri gram negatif setelah dilakukan
pewarnaan gram dengan kristal violet, lugol,
PREPARAT :
PERBESARAN : 1000x
dan penambahan alkohol dan diamati dengan
perbesaran 1000x dapat diamati bahwa bakteri
tersebut berwarna merah, berbentuk batang, dan
susunanya berderet.
Tanggal Pengamatan : 25 Maret 2021

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
Keterangan Gambar : mycobacterium
POLTEKES YOGYAKARTA
tubercolosis
1. Pengecatan : pewarnaan tahan asam
2. Warna koloni : merah
3. Keterangan gambar :
a. bentuk bakteri batang
b. susunan bakteri berderet bengkok yang
menyerupai rantai
4. Kesimpulan :
PREPARAT : Bakteri mycobacterium tubercolosis setelah
PERBESARAN : 1000x
dilakukan pewarnaan gram dengan carbol
fuchsin, asam alkohol, dan metilen blue dan
diamati dengan perbesaran 1000x dapat diamati
bahwa bakteri tersebut berwarna merah,
berbentuk batang, dan susunanya berderet
bengkok menyerupai rantai.
PEMBAHASAN :
A. Pewarnaan Negatif
Berdasarkan hasil pengamatan, didapatkan bahwa pada pewarnaan negatif dapat
diketahui bentuk luar dan karakteristik dari bakteri yang sulit untuk diwarnai, sehingga
hanya mewarnai latar belakangnya saja dan bentuk dari bakteri tersebut adalah batang.
Bakteri yang digunakan adalah Bacillus subtilis yang merupakan bakteri basil dengan
ukuran 0,5 µm x 1 µm. Biasanya bakteri tersebut ditemukan berkoloni atau membentuk
endospora oval atau bersilinder. Bakteri tersebut berumur 24 jam, karena pada usia
tersebut morfologi bakteri sudah terlihat jelas.
Setelah dipijarkan dengan lampu bunsen panaskan hingga membara jarum ose
dan ambil biakan Bacillus subtilis. Pada kaca objek yang telah di fiksasi tadi, beri 1
tetes nigrosin/tinta cina dan biakan Bacillus subtilis. Ratakan dengan menggunakan kaca
objek yang lainnya, lalu di keringkan. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan
negatif yaitu nigrosin. Pewarna nigrosin tidak mewarnai bakteri, tapi mewarnai preparat
sehingga terlihat bakteri tersebut berwarna bening. Hal ini disebabkan karena nigrosin
dan bakteri sama-sama bermuatan negatif. Akibatnya, nigrosin langsung mewarnai
preparat, tidak mewarnai bakteri. Dalam kondisi pH mendekati netral,dinding sel
bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif
akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna.

B. Pewarnaan Sederhana
Setelah diambil obyek glass yang telah difiksasi dengan alkohol, kemudian
diberi tanda kotak untuk bakteri staphylococcus aureus. Kemudian diambil 3-5 ose
bakteri staphylococcus aureus, diratakan pada kotak yang telah disediakan. Diambil 3-5
ose bakteri E.coli, ratakan pada kotak yang telah disediakan. Setelah ose dipanaskan
sampai membara, Fiksasi obyek glass yang berisi bakteri diatas nyala api sampai benar-
benar kering dan bakteri mati atau timbul bercak. Siapkan jembatan pengecatan diatas
wastafel. Genangi preparat staphylococcus aureus dengan kristal violet dan E. coli
dengan safranin sampai penuh selama 3 menit. Buang cat, cuci dibawah air mengalir
sampai bersih. Kering angin-anginkan.
Dari hasil pengamatan didapatkan Bakteri E.coli setelah dilakukan pewarnaan
secara sederhana dengan pewarna safranin dan diamati dengan perbesaran 1000x dapat
diamati bahwa bakteri tersebut berwarna merah, berbentuk bulat, dan susunanya
menyebar/terpisah. Sedangkan Bakteri E.coli setelah dilakukan pewarnaan secara
sederhana dengan pewarna safranin dan diamati dengan perbesaran 1000x dapat diamati
bahwa bakteri tersebut berwarna merah, berbentuk bulat, dan susunanya
menyebar/terpisah.

C. Pewarnaan Gram
Preparat yang sudah disiapkan diberi tetesan kristal violet sebagai zat warna
primer dan didiamkan selama 1 menit, kemudian dibilas menggunakan air. Setelah itu,
ditambahkan tetesan lugol sebagai mordant yang fungsinya untuk membantu zat warna
membantuk kompleks dengan bagian bermuatan dalam dinding sel, plasma membran,
dan sitoplasma. Setelah dicuci dengan air, ditambahkan tetesan alkohol 95%. Alkohol
berfungsi sebagai pencuci zat warna, kompleks lugol-kristal violet kompleks. Karena
bakteri gram negatif mempunyai dinding sel yang lebih tipis dari bakteri gram positif
maka kompleks lugol-kristal violet akan tercuci dengan cepat. Penambahan safranin
digunakan sebagai zat warna pengkonter dari warna bakteri gram negatif yang tercuci
karena penambahan alkohol sebelumnya.
Setelah bakteri diamati, didapatkan Bakteri gram negatif setelah dilakukan
pewarnaan gram dengan kristal violet, lugol, dan penambahan alkohol dan diamati
dengan perbesaran 1000x dapat diamati bahwa bakteri tersebut berwarna merah,
berbentuk batang, dan susunanya berderet.

D. Pewarnaan tahan asam

Pewarnaan tahan asam adalah pewarnaan yang dapat mengukur ketahanan sel
yang telah diwarnai terhadap pencucian dengan asam. Ketahan-asaman dari bakteri dan
aktinomicetes tertentu berhubungan dengan banyaknya lapisan lemak. Sebagai pewarna
dasar adalah karbol fuhsin panas, dan pencucinya adalah alkohol asam. Setelah itu,
sediaan diberi warna pembanding. Pewarnaan ini terutama digunakan untuk diagnosa
dan studi penyakit-penyakit yang disebabkan oleh species-species tahan asam seperti
penyebab TBC dan lepra.
Menurut Enjang (2003) pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-Neelsen
dapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :
1.  Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri
tahan asam (acid fast).
2.  Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteritidak
tahan asam (non acid fast).
Menurut Ziehl Neelsen Bakteri genus mycobacterium dan beberapa spesies
nocardia pada dinding selnya mengandung banyak zat lipoid (lemak) sehingga bersifat
permiable dengan pewarnaan biasa. Bakteri tersebut bersifat tahan asam (+)
terhadap pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahan asam dapat digunakan untuk
membantu menegakkan diagnosa tuberkulosis. Pewarnaan tahan asam menggunakan
larutan cat karbol fuchsin.
Hasil pewarnaan maka bakteri tahan asam akan berwarna merah dan bakteri
tidak tahan asam akan berwarna biru. Adapun kelemahan dan kelebihan Ziehl Neelsen
yakni: latar belakang berwarna biru terang, basil merah jelas, reagen terjangkau dan
mudah didapat,fenol diencerkan 5% dan tidak dipanaskan karena pemanasan dilakukan
pada proses pewarnaan sedian zat warna utama maka dari itu agak lama waktu yang
dibutuhkan.
Berdasarkan pengamatan yag telah dilakukan, Bakteri mycobacterium
tubercolosis setelah dilakukan pewarnaan gram dengan carbol fuchsin, asam alkohol,
dan metilen blue dan diamati dengan perbesaran 1000x dapat diamati bahwa bakteri
tersebut berwarna merah, berbentuk batang, dan susunanya berderet bengkok
menyerupai rantai.

KESIMPULAN :
Bakteri  mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri
merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri
juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat
dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut
maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri.
Teknik pengecatan bakteri dibagi menjadi 4, yaitu teknik pengecatan negatif,
pengecatan sederhana, pengecatan gram, dan pengecatan tahan asam. Pengecatan
Negatif adalah pengecatan yang tidak langsung, pada pengecatan ini yang terarsir oleh
cat adalah hanya latar belakang dari sel bakteri, sedangkan bakterinya sendiri akan
berwarna transparan. Pewarna nigrosin tidak mewarnai bakteri, tapi mewarnai preparat
sehingga terlihat bakteri tersebut berwarna bening. Hal ini disebabkan karena nigrosin
dan bakteri sama-sama bermuatan negatif. Akibatnya, nigrosin langsung mewarnai
preparat, tidak mewarnai bakteri. Hal itu menyebabkan warna bacillus subtilis berwarna
transparan.
Pengecatan Sederhana adalah pengecatan yang dilakukan jika cat yang
dugunakan untuk mengecat bakteri hanya satu macam saja. Dari hasil pengamatan
didapatkan Bakteri E.coli setelah dilakukan pewarnaan secara sederhana dengan
pewarna safranin dan diamati dengan perbesaran 1000x dapat diamati bahwa bakteri
tersebut berwarna merah, berbentuk bulat, dan susunanya menyebar/terpisah.
Sedangkan Bakteri E.coli setelah dilakukan pewarnaan secara sederhana dengan
pewarna safranin dan diamati dengan perbesaran 1000x dapat diamati bahwa bakteri
tersebut berwarna merah, berbentuk bulat, dan susunanya menyebar/terpisah.
Pengecatan Gram merupakan cara pewarnaan deferensial. Teknik ini
memerlukan 3 larutan yaitu kristal violet, lugol/iodin, dan alkohol. Bakteri gram negatif
setelah dilakukan pewarnaan gram dengan kristal violet, lugol, dan penambahan alkohol
dan diamati dengan perbesaran 1000x dapat diamati bahwa bakteri tersebut berwarna
merah, berbentuk batang, dan susunanya berderet.
Pewarnaan tahan asam adalah pewarnaan yang dapat mengukur ketahanan sel
yang telah diwarnai terhadap pencucian dengan asam. Ketahan-asaman dari bakteri dan
aktinomicetes tertentu berhubungan dengan banyaknya lapisan lemak. Sebagai pewarna
dasar adalah karbol fuhsin panas, dan pencucinya adalah alkohol asam. Bakteri
mycobacterium tubercolosis setelah dilakukan pewarnaan gram dengan carbol fuchsin,
asam alkohol, dan metilen blue dan diamati dengan perbesaran 1000x dapat diamati
bahwa bakteri tersebut berwarna merah, berbentuk batang, dan susunanya berderet
bengkok menyerupai rantai.
DAFTAR PUSTAKA :
https://www.academia.edu/34693071/PENGECATAN_MIKROORGANISME_docx
diakses 29 Maret 2021 pukul 09.53 WIB
https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_pendidikan_dir/a7f802a44af914018f32b47afe64f
857.pdf diakses 29 Maret 2021 pukul 15.40 WIB
http://israyantianur.blogspot.com/2013/05/pewarnaan-bta-ziehl-neelson.htm diakses 29
Maret 2021 pukul 16.15
http://erlinpurnamasari.blogspot.com/2013/06/pewarnaan-bta-metode-zn.html diakses
29 Maret 2021 pukul 16.30

Yogyakarta, 30 Maret 2021

Asisten Mahasiswa

(……………………) (Aly Sahid Saifullah)