LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBILOGI 1

TEKNIK PEWARNAAN

Disusun oleh :
Fepta Aryanti
F1D018024
Kelompok III ( Tiga )

Diketahui :
Asisten Dosen Praktikan

Ahmad Faizi Andeas Fepta Aryanti

F1D017026 F1D018024

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BENGKULU
2020
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba menggunakan
mikroskop dapat digunakan dua cara yaitu mengamati sel mikroba yang masih
hidup tanpa diwarnai dan mengamati sel mikroba yang telah mati dengan
diwarnai. Untuk lebih mudah dilihat sebaiknya bakteri diwarnai dengan zat warna,
beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri juga dapat digunakan untuk
mengamati struktur bagian dalam sel. Melihat dan mengamati bakteri dalam
keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga
transparan dan sangat kecil ( Astanti, 2014 ).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-
mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau
pewarnaan, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram ( Cahyo, 2013).
Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram,
bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu
metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar,
Gram positif dan gram negatif, Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu
pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan
pewarnaan ini mampu membedakan bakteri menjadi dua golongan yaitu Gram
negatif dan Gram positif ( Linda, 2014 ).
Berdasarkan pemaparan di atas praktikum teknik pewarnaan dilakukan
untuk mengetahui morfologi dari bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan
sederhana dan pewarnaan negatif.
1.2 Tujuan
Praktikum mikrobiologi yang berjudul Teknik Pewarnaan, bertujuan untuk
mengetahui morfologi dari bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan
sederhana dan pewarnaan negatif.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teknik pewarnaan

Pewarnaan mikroorganisme dalam keadaan idup cukup sulit, bukan hanya
kerena ukurannya yang sangat kecil, melainkan juga karena mikroorganisme
tersebut transparan dan praktis tidak berwarna bila disuspensikan dalam suatu
media cair. Secara kimia, suatu pewarna dapat didefinisikan sebagai suatu
senyawa organik yang mengandung sebuah cincin benzen dan juga suatu
kelompok kromofor dan auksokrom. Kemampuan suatu pearna berikatan dengan
komponen sel makromolekul seperti protein atau asam – asam nukleat bergantung
pada muatan elektrik yang ditemukan pada bagian kromosom dan juga pada
komponen sel yang akan diwarnai. Pewarna – pewarna asam bersifat anionik,
yang berarti bahwa, pada ionisasi pewarna bahian kromogen memiliki muatan
negatif sehingga memiliki afinitas yang kuat terhadap konstituen sel yang
bermuatan positif. Pewarna – pewarna basa bersifat kationik karena pada ionisasi
bagian kromogen memperlihatkan muatan positif sehingga memiliki afinitas kuat
terhadap konstituen sel yang bermuatan negatif ( James, 2002 ).
2.2 Macam-Macam Pewarnaan Bakteri
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna
untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka
dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk
dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuksin yang
mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan yaitu :
a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan
tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam
pewarnaan positif adalah metilen biru dan air fuchsin.
b.  Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk
mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada
pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan atau tembus pandang. Teknik
ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini
menggunakan tinta cina (Hartono, 2015 ).
2.  Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri
gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram
negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif
menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding
sel mereka. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu:
a.Zat warna utama (violet kristal)
b.Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan
warna utama. Pencuci/peluntur zat warna (alkohol/aseton) yaitu solven
organik yang digunakan untuk melunturkan zat warna utama.
c. Zat warna kedua/cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali
sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol
( Hadioetomo, 2016 ).
Pewarnaan sederhana hanya digunakan 1 macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazimnya,
prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti kristal violet, biru
metilen, karbol fuksin basa, safranin atau hijau. Prosedur pewarnaan sederhana
mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk,
ukuran, dab penataan mikroorganisme. Pada bakteri dikenal berbagai bentuk yaitu
bulat ( kokus ), batang ( basilus) dan spiral. Pada kokus dapat terlihat penataan
seperti rantai ( streptokokus ) , buah anggur ( stafilokokus ) , (diplokokus), bentuk
kubus yang terdiri dari 4 atau 8 kokus ( sarcinae ). Pewarnaan negarif, beberapa
mikroba sulit diwarnai denagn zat warna yang bersifat basa tetapi, muadah dilihat
dengan pewarnaan negatif. Pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina
atau nigrosin, kemudian digesekan ke atas kaca objek. Zat warna tidak akan
mewarnai bakteri akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan
mikroskop, mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam.
Pada tahun 1883, Christian Gram, seorang ahli bakteriologi dari Denmark
menemukan metode pewarnaan bakteri secara tidak sengaja. Pewarnaan Gram
merupakan pewarnaan deferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan ini merupakan tahap
penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri. Pewarnaan Gram memilah
bakteri menjadi kelompok Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif
berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violet yodium tetap
dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat, sedangkan bakteri Gram negatif
berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu pemberian larutan
pemucat dan kemudian mengambil zat warna kedua yang berwana merah
(Bibiana, 2007 ).
Sel bakteri kaya akan asam nukleat, yang banyak membawa muatan
negatif dalam bentuk gugus fosfat. Muatan ini akan bergabung dengan pewarna
basayang bermuatan positif. Pewarna asam tidak mewarnai sel bakteri sehingga
dapat digunakan untuk manandai material latar belakangnya dengan warna yang
kontras. Pewarna basa mewarnai sel –sel bakteri secara seragam kecuali bila RNA
sitoplasma hancur terlebih dahulu. Walaupun demikian, teknik pewarnaan khusus
bisa digunakan untuk membedakan flagel, kapsul, dinding sel, membran sel,
granula,nukleoid dan spora ( Jawetz, 2002 ).
 BAB III

METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Teknik Pewarnaan, dilaksanakan pada hari Selasa 18 Februari
2020, pukul 14.00 – 16.30 WIB , di Laboratorium Mikrobiologi, Gedung Basic
Science, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Bengkulu.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah kaca objek, kaca
penutup, lampu spiritus, pipet tetes, mikroskop dan tusuk gigi steril.
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kotoran gigi, 10 ml
nigrosin atau tinta cina, alkohol 70 %, 20 ml larutan biru metil atau karbol fuksin,
10 ml suspensi mikrob dan ¼ tisu gulung.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Pewarnaan Sederhana
Kaca objek di fiksasi dan dibuat olesan suspensi mikrob yang tersedia
pada kaca objek, kemudian diteteskan 1 tetes zat warna biru metil atau karbol
fuksin ke olesan suspensi mikrob selama 1- 2 menit, lalu dimiringkan kaca objek
dan olesan mikrob dibilas dengan air. Kemudian kelebihan zat warna pada
preparat diserap dengan kertas tisu. Diamati di bawah mikroskop bentuk dan
warna mikrob yang terlihat.
3.3.2 Pewarnaan Negatif
Diambil kotoran gigi pada mulut dengan digunakan tusuk gigi yang steril
dan diletakkan pada kaca objek, lalu diteteskan satu tetes nigrosin ke kaca objek
dan disebarkan olesan kotoran gigi sampai ke pinggir kaca objek. Dilakukan
penyebarannya dengan merata dan jangan sampa menumpuk. Kemudian kaca
objek di kering. Lalu diamati di bawah mikroskop bentuk sel yang terlihat.
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Setelah melakukan percobaan mengenai Teknik Isolasi Mikroorganisme
maka didapatkan hasil sebagai berikut :