LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI I

TEKNIK PEWARNAAN MIKROB

Disusun Oleh:

Nama : Hasriany Vellarenza

Npm : F1D016014

Diketahui, Praktikan

Asisten praktikum

Yuni Clara Situngkir Hasriany Vellarenza

F1D014032 F1D016014

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BENGKULU

2018
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba menggunakan mikroskop
dapat digunakan dua cara yaitu mengamati sel mikroba yang masih hidup tanpa diwarnai
dan mengamati sel mikroba yang telah mati dengan diwarnai. Untuk lebih mudah dilihat
sebaiknya bakteri diwarnai dengan zat warna, beberapa zat yang digunakan untuk
mewarnai bakteri juga dapat digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel.
Dengan adanya pewarnaan terutama bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran yang retif
kecil akan lebih mudah terlihat di bawah mikroskop denagn menggunakan lensa objektif
minyak imersi yang mempunyai tingkat pembesaran yang relatif tinggi (Tracy, 2005).
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup
akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga
sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.
Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa
(Sutedjo, 1991).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat
terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.
Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial
dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan
diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan
metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl,
2008).

1.2 Tujuan Percobaan

Adapun tujuan dari praktikaum Teknik Pewarnaan Mikrob ini adalah:
1) Mengetahui teknik pewarnaan sederhana, differensial dan khusus.
2) Mengetahui kegunaan teknik pewarnaan sederhana, differensial dan khusus.
3) Mengetahui morfologi dari bakteri yang telah di lakukan pewarnaan.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat

kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan
pembesaran 1.000 X atau lebih. Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan
mikroskop biasa yaitu tanpa dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan
bergantung, menggunakan kondensor medan gelap dan lainlain. Tetapi pengamatan dari
pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti,
karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan. Melihat dan mengamati bakteri dalam
keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan
sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan
bakteri ,sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-
penelitian mikrobiologi (Hadiotomo, 1990).
Bakteri yang hidup tidak berwarna sehingga sulit untuk dibedakan dengan
lingkungan sekelilingnya. Meskipun kontras bakteri dengan lingkungan tidak mencolok
namun susunan kimiawinya sangat berbeda. Perbedaan kimiawi inilah yang menuntungkan
kita, sehingga bakteri dapat diwarnai tanpa mewarnai lingkungan sekitarnya. Keuntungan
melakukan pewarnaan adalah:
1) Meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnyam sehingga dapat diamati
berbagai bentuk susunan bakteri.
2) Memungkinkan pengamatan salah satu bagian dari sel bakteri, misalkan spora,
kapsel, atau flagela.
3) Memungkinkan penggunaan perbesaran (Lay,1992).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat
tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan
pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan
diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan
metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Volk,1984).
Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan
larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan, yang sudah difiksasi,
dinamakan pewarnaan sederhana prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan
diantar sel-sel mikroba atau bagian- bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga
dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah
pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Karmana,2008).
Salah satu pewarnaan yang sering digunakan untuk mengidentifikasi bakteri adalah
pewarnaan Gram. Berdasarkan pewarrnaan Gram, bakteri dibagi menjadi dua golongan,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau kristal violet. Bakteri yang
tetap berwarna ungu dengan pewarnaan oleh kristal violet disebut bakteri Gram positif,
misalnya Clostridium perfringers, Staphylococcus aureus, sedangkan bakteri yang warna
ungunya hilang jika dibilas dengan alkohol, tetapi tetap berwarna merah muda karena
menahan warna merah safranin disebut bakteri Gram negatif, misalnya Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan Gram
misalnya Mycobacterium Sp. Karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga
digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaan ini sel
bakteri akan berwarna merah muda tetapi sel jaringan akan berwarna hijau (James, 2006).
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel
bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif
dan gram negatif (Karmana,2008).
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri sehingga dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang
paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini
adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat
dibedakan pewarna basa dan pewarna asam (Hadiotomo, 1990).
Pewarnaan asam dapat terjadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif.
Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cendrung bermuatan negatif,
sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel
tidak berwarna. Pewarna asam disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya
tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin daan lainnya. Pewarnaan basa bisa terjadi
bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel
bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa mmisalnya metilen biru,
kristal violet, safranin dan lain-lain. Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan
satu jenis senyawa pewarna. Teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana
diperlukan untuk mengammati morfolgi, baik bentuk maupun susunan sel (Hadiotomo,
1990).
Pewarnaan bakteri dengan pewarnaan ini memilahkan bakteri menjadi Gram Positif
dan Gram Negatif. Gram positif terlihat ungu, sedangkan negatif terlihat merah. Perbedaan
ini disebabkan oleh:
a) Daya Permeabilitas
Pada bakteri Gram-positif, kompleks KV-I (Kristal Violet-Yodium)
terperangkap dalam dinding sel setelah perlakuan dengan ethanol. Hal ini
disebabkan pori-pori pada lapisan peptidogligan mengecil. Dinding sel bakteri
Gram-Negatif mengandung lapisan peptidogligan yang lebih rendah dibandingkan
bakteri Gram-positif. Pori-pori pada lapisan peptodogligan bakteri Gram-negatif
setelah perlakuan dengan ethanol cukup besar, sehingga melalukan kompleks KV-I.
 Jika pada bakteri gram-positif ditambahkan Lisozim, suatu enzim yang akan
melisiskan (menghancurkan) dinding sel, maka akan terjadi bentuk protoplas.
Pewarnaan Gram pada protoplas menyebabkan warna ungu pada tahap pertama,
tetapi warna ini akan dilunturkan sewaktu penambahan larutan pemucat. Ini berarti
dinding sel baktri Gram-positif merupakan lapisan yang mangikat zat warna kristal
violet.Bakteri gran-positif dapat pula memberikan hasil pewrnaan Gram variabel.
Biakan yang tua tidak berdaya untuk tetap mengikat kompleks KV-I, sehingga alan
mengambil zat warna kedua.
b) Dinding sel bakteri Gram-Negatif mengandung lipid yang tinggi, sehingga sewaktu
pencucian dengan larutan pemucat menyebabkan pembesaran lubang pori-pori dan
peningkatan permeabilitas zat warna. Pencucian menyebabkan kompleks zat warna
terlepas, dan sel akan mengambil zat warna kedua.
c) Dinding sel bakteri Gram-positif mengandung lipid yang rendah, sehingga sewaktu
penambahan alkohol terjadi dehidrasi dan pengecilan lubang pori-pori. Ini
menyababkan zat warna tetap terikat dan sel tetap ungu.
d) Struktur dinding sel
Bakteri Gram- negatif berdinding tipis, sedangkan bakteri Gram-Positif
berdinding tebal.
e) Pada bakteri Gram-positif ditemukan senyawa Mg-ribonukleat yang akan bereaksi
dengan kristal-violet dan menyebabkan tidak mudah dilarutkan oleh larutan
pemucat. Ribonukleat ini tidak ditemukan pada Gram-negatif (Lay,1992).
Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa yaitu tanpa dengan
cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan bergantung, menggunakan kondensor
medan gelap dan lainlain. Tetapi pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di
pakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya
transparan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut
maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat terlihat jelas dan
mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu
cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2005).
 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada hari Senin dan Rabu tanggal 5 Maret 2018, di
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Bengkulu.

3.2 Alat
Alat yang digunakan untuk percobaan kali ini adalah kaca objek, kaca penutup,
mikroskop, pipet tetes, lampu spritus, bak pewarna, jarum ose, dan pensil lilin.

3.2 Bahan
Bahan yang digunakan untuk percobaan ini yaitu tisu gulung, suspensi mikrob, 25
ml larutan biru metil atau karbol fuksin, alkohol 70%, 10 ml iodium, 10 ml safranin, 10 ml
ungu kristal, 100 ml minyak imersi, biakan bakteri, 1 biakan Bacillus, 200 ml air suling,
dan larutan hijau malakit.

3.3 Prosedur Kerja

a) Pewarnaan Sederhana
Pertama objek difiksasi terlebih dahulu. Kemudian olesan suspensi mikrob yang
tersedia di kaca objek dibuat.xat wrna biru metil/ karbol fuksin diambil dan ditetesi
sebanyak 1 tetes ke olesan suspensi mikrob selama 1-2 menit. Kemudian kaca objek
dimiringkan dan dibilas olesan mikrob dengan air. Apabila terdapat kelebihan zat warna
pada kaca preparat perlu diserap dengan kertas tisu. Terakhir dilihat bentuk dan warna
mikrob dengan mikroskop.
b) Pewrnaan Gram
Olesan suspensi mikrob yang akan diamati terlebih dahulu disiapkan. Dengan pipet
tetes, diberikan 1 tetes pewrna ungu kristal pada suspensi mikrob dan dibiarkan selama 1
menit. Dibilas dengan air selama 10 detik, kemudian diberikan 1 tetes iodium dan
dibiarkan selama 2 menit, barulah bilas dengan air selama 10 detik. Selanjutnya dilakukan
pemucatan dengan alkohol 96% selama 1 menit, dibilas dengan air selama 10 detik.
Selanjutnya diberi 1 tetes pewarna safranin dan dibiarkan selama 30 detik. Dibilas lagi
dengan air selama 10 detik, kelebihan warna diserap dengan tisu. Diamati bentuk dan
warna mikrob dibawah mikroskop.
c) Pewarnaan Spora
Disiapkan olesan bakteri dengan fiksasi panas. Disepanjang kaca objek dibuat garis
dengan pensil guna menahan agar zat warna tidak meluap keluar. Kemudian kaca objek
diletakkan pada cincin besi dan letakkan kira-kira 25 cm dari meja serta letakkan kertas
dibawanya untuk melindungi meja dari pewarna yang tercecer. Selanjutnya diberikan 1
tetes hijau malakit dengan pipet tetes ke atas olesan bakteri, selama 10 menit sembari
dipanaskan langsung di atas lampu spritus sampai beruap (jangan sampai mendidih dan
mengering, untuk mengatasi dapat ditambahkan pewarna). Kaca objek dibiarkan dingin,
kelebihan pewarna dicuci dengan air, diberi 1 tetes pewarna safranin dan dibiarkan selama
1 menit. Kemudian dibilas dengan air, kelebihan zat warna diserap menggunakan tisu.
Terakhir bentuk dan warna sel bakteri diamati dibawah mikroskop.

.
 BAB VI
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Dari praktikum pewarnaan mikrob didapati hasil kelas sebagai berikut :

Tabel 1. Bentuk dan penataan bakteri yang dapat

NO Bakteri Bentuk Penataan Bakteri
1. Sp 1 Basil Streptobasil
2. Sp 2 Basil Streptobasil
3. Sp 3 Cocobasil Streptococus, Diplococus
4. Sp 4 Cocus Monococus, Diplococus
5. Sp 5 Cocus Diplococus, Streptococus,
Staphylococus.
6. Sp 6 Cocus Mikrococus

(a) (b) (c)

Gambar 1. Bakteri hasil pengamatan setelah dilakukan pewarnaan sederhana (a),

pewarnaan Gram (b) dan pewarnaan Spora(c).

4.2 Pembahasan
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara
langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni).
Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985):
1. Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik
dan kimia yang ada akan dapat diketahui.
Didapatinya berbagai macam bentuk dan penataan bakteri yang berbeda merupakan
hasil dari lokasi yang berbeda dalam pengisolasian bakteri-bateri tersebut. Praktikum ini
dilakukan dengan 3 cara pewarnaan yakni pewarnaan sederhana, pewarnaan Gram, dan
pewarnaan Sprora. Pada pengamatan Kelompok 5(Sp 5) pewarnaan sederhana
menggunakan zat warna MB (Methylen Blue) kemudian di dapatkan hasil berupa bakteri
berbentuk Cocus berwarna biru dengan penataan yang beragam mulai dari diplococus
hingga streptococus. Kemudian begitupula pada pewarnaan gram dan spora.
Pada Pewarnaan garam merupakan suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Pada saat praktikum pewarnaan
gram, larutan yang digunakan yaitu larutan Kristal violet, larutan safranin, larutan lugol,
dan larutan peluntur. Bakteri yang dipakai saat pewarnaan yaitu bacteri yang telah di
lakukan enumirasi pada praktikum sebelumnya.
Hasil pewarnaan Gram pada satu jenis bakteri dapat menunjukkan Gram variabel,
yaitu dapat bersifat gram positif maupun gram negatif. Hal tersebut diakibatkan oleh
perbedaan umur koloni bakteri tersebut pada saat pewarnaan Gram dilakukan. Koloni
berumur tua akan menunjukkan Gram negatif, sebaliknya jika berumur muda akan
menunjukkan Gram positif (Nugroho, 2006, p. 88).
Namun pada pewarnaan spora bakteri yang seharusnya didapat bukanlah berbentuk
cocus melainkan yang berbentuk basil. Bakteri cocus tidak menghasilkan Spora.
Menurut Dwidjoseputro (2005), beberapa spesies bakteri dapat kehilangan
kemampuannya untuk membentuk spora. Spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri biasa
apabila keaadaan di luar menguntungkan. Mula-mula air meresap ke dalam spora,
kemudian spora mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya. Keretakan ini dapat
terjadi pada salah satu ujung, tetapi juga dapat terjadi pada tengah-tengah atau dekat
tengah-tengah spora. Hal ini merupakan ciri khas bagi beberapa spesies Bacillus. Jika kulit
spora pecah di tengah-tengah, maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup
pada kedua ujung bakteri.
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar Dasar Mikrobiologi. Malang: Penerbit Djambatan.

Hadiotomo, Ratna Siri., 1990, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : PT Gramedia.

James, Joyce., Colin Baker, Helen Swain.2006. Prinsip-prinsip Sains Untuk Keperawatan
diterjemahkan oleh dr. Indah Retno Wardhani. Jakarta : PT Gramedia

Karmana, Oman. 2008. Biologi. PT Grafindo Media Pratama: Jakarta

Nugroho, Astri. (2006). Biodegradasi Sludge Minyak Bumi dalam Skala Mikrokosmos:
Simulasi Sederhana Sebagai Kajian Awal Bioremediasi Land Treatment. Jurnal
Makara Teknologi, 10(2):82-89.

Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Sutedjo, M., 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta

Tracy.2005.GramStaining. www.tracy.k12.ca.us/ thsadvbio/ pdfs/ gram%20stain.pdf,

Diakses pada tanggal 4 Maret 2018.

Umsl. 2008.StainingBacteria. www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf.

Diakses pada tanggal 4 Maret 2018.

Volk & Wheeler. 1984. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid I. Jakarta : Erlangga