PRAKTIKUM IV

PREPARAT TETES GANTUNG & PEWARNAAN SPORA

I. Preparat Tetes Gantung

Kompetensi : Mempelajari prosedur tetes-gantung (hanging-drop) untuk pengamatan
mikroskopik bakteri hidup

Pendahuluan
Bakteri dapat diperoleh dari mana-mana, bisa dari udara, tanah, rongga
mulut, sela-sela gigi, sisa-sisa makanan yang telah basi, dan sebagainya. Untuk
mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri dapat diperiksa dalam
keadaan hidup atau dalam keadaan mati. Pemeriksaan morfologi ini perlu untuk
mengenal nama bakteri. Disamping itu diperlukan juga pengenalan sifat-sifat
fisiologisnya, bahkan sifat-sifat fisiologi itu kebanyakan merupakan faktor penentu
dalam mengenal nama spesies suatu bakteri.
Pemeriksaan bakteri hidup harus dikerjakan dengan hati-hati, terlebihlebih
jika yang akan diperiksa itu bakteri patogen. Juga harus berhati-hati bila melakukan
pengamatan motilitas, jangan sampai keliru dengan gerak Brown. Pergerakan sejati
biasanya progresif dan terarah (seringkali amat cepat), sedangkan gerak Brown
merupakan gerakan menggetar partikel-partikel (termasuk mikroorganisme, baik
yang motil maupun yang non-motil) secara acak atau tak terarah karena terus
menerus kena pukulan molekul-molekul kecil tak kasat mata yang ada dalam cairan.
Pergerakan menggetar semacam ini tidak menyebabkan organisme non-motil
berubah posisinya terhadap benda lain di sekelilingnya.
Jangan pula mengelirukan pergerakan sejati dengan pergerakan
mikroorganisme yang disebabkan oleh arus cairan sehingga organisme yang diamati
akan terlihat berduyun-duyun mengalir mengikuti arus cairan tersebut.
Metode tetes gantung merupakan salah satu metode yang umum digunakan
untuk mengamati secara tidak langsung ada tidaknya organ pergerakan pada
mikroorganisme. Karena flagela bakteri berukuran sangat kecil (diameter 0,01-0,03
µm) sehingga sukar diamati dengan mikroskop cahaya biasa. Meskipun ada
pewarna-pewarna khusus yang dapat digunakan untuk memperbesar diameter
flagela, tetapi pewarna semacam ini sulit dilakukan. Kecuali bila ingin mengetahui
pola penataan flagela pada sel, maka dapat dilakukan pewarnaan semacam ini atau
pengamatan dengan mikroskop elektron.
Prinsip :
Bakteri memiliki ukuran yang kecil dan indeks bias mendekati indeks bias air
sehingga tidak dapat diperiksa dalam keadaan tidak diwarnai.
Pemeriksaan mikroorganisme hidup berguna untuk:
1. Mengamati aktivitas sel, seperti pergerakan dan pembelahan sel
2. Mengamati ukuran dan bentuk sel secara alami.
Pada percobaan ini digunakan kultur campuran dari Pseudomonas aeruginosa (basil
bergerak), Bacillus cereus (basil besar), dan Staphylococcus aureus (kokus). Sedian akan
diamati secara mikroskopik berdasarkan perbedaan bentuk, ukuran, dan pergerakan sel.
Penting untuk membedakan antara gerak sejati, gerak Brown dan gerak vibrasi (getaran)
karena pengaruh molekul air pada suspensi.

Alat dan Bahan

1. Kaca penutup (cover-glass)
2. Kaca obyek cekung
3. Ose/inoculating loop
4. Lampu spirtus/pembakar bunsen
5. Mikroskop
6. Vaselin
7. Biakan campuran bakteri : S.aureus, P. aeruginosa, dan B. cereus

Prosedur
1. Siapkan kaca penutup yang bersih dan olesi keempat pinggir sisinya dengan
vaselin. Lalu letakkan kaca penutup tersebut di atas meja dengan muka yang
bertepikan vaselin menghadap ke atas.
2. Dengan menggunakan ose, ambil biakan bakteri dari TSB dan letakkan di
tengah-tengah kaca penutup tadi
3. Peganglah kaca obyek cekung dengan bagian cekung menghadap ke bawah.
4. Dekatkan kaca obyek cekung ini perlahan-lahan pada kaca penutup
sedemikian rupa sehingga bagian cekung kaca obyek melingkungi tetesan
biakan bakteri.
5. Setelah kaca obyek cekung menyentuh vaselin, tekanlah perlahan-lahan
sehingga vaselin menyebar dan membentuk segel.
6. Dengan hati-hati dan cepat, balikkan obyek cekung tersebut, maka tetesan
biakan bakteri tadi terlihat menggantung dari kaca penutup tanpa
menyentuh kaca obyek.
7. Amati dengan mikroskop, pertama dengan pembesaran kecil (100X)
kemudian dengan pembesaran 400X atau dengan menggunakan minyak
imersi dengan pembesaran 1000X untuk pengamatan yang mendetail.
 Gambar 1. Prosedur Tetes Gantung

Keuntungan penggunaan metode tetes-gantung :

1. Bakteri ada terkurung di dalam lubang kaca objek, sehingga bahaya

terhamburnya kemana-mana hampir tidak ada.
2. Bakteri dapat bergerak dengan leluasa, jika bakteri memang suka bergerak.
 Nama : Puput Millenia Romadhoni
NIM : P27903220018
No. Absen : 18
-
Kelas : Reguler Pegawai Tingkat Satu Semester Dua

PRAKTIKUM IV
PREPARAT TETES GANTUNG & PEWARNAAN SPORA

Hasil pengamatan tetes gantung

1. Amatilah hasil sediaan tetes gantung, yang meliputi bentuk, ukuran, dan gerak.
Catat hasilnya dan masukan dalam table
Organisme Bentuk dan ukuran Gerak sejati atau gerak
brown
S. Aureus Bulat/ coccus 0.7 – 1,2 Gerak brown
P. Aeruginosa Batang / Basil bergerak Gerak sejati
0.5 – 1 um x 3 – 4 um
B . Cereus Batang / Basil besar : Gerak sejati
Lebar 1,0 – 1,2 um &
panjang 3,0 – 5 um

2. Gambar ( lapang pandang yang mewakili )

Bakteri P. Aeruginosa

PEWARNAAN SPORA

TUJUAN
Mengenal dasar dasar kimiawi pada pewarnaan spora,dan kinerja dari prosedur
untuk membedakan spora bakteri dan bentuk vegetatif.

PENDAHULUAN
Jenis-jenis bakteri tertentu,terutama yang tergolong kedalam genus Bacillus dan
Clostridium,membentuk suatu struktur kedalam sel pada tempat-tempat yang khas
disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan
nutrisi,tahan terhadap panas dan unsur-unsur fisik lain nya seperti
pembekuan,kekeringan,radiasi ultraviolet serta terhadap bahan-bahan kimia yang
dapat menghancurkan bakteri yang tidak membentuk spora. Ketahanan tersebut
disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras.Spora terbentuk
dalam sel sehingga seringkali disebut endospore,dalam sel bakteri hanya terdapat 1
spora. Endospore merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten,dapat
bertahan dalam debu dan tanah selama bertahun-tahun. Dalam lingkungan yang
menguntungkan spora bergerminasi kembali menjadi sel vegetatif. Bila lingkungan
tidak menguntungkan,sel vegetatif berubah menjadi spora. Lapisan luar spora
merupakan penahan yang baik terhadap bahan kimia,sehingga spora sukar
diwarnai.
Sifat endospora yang demikian menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang
keras untuk mewarnainya. Prosedur pewarnaan Gram misalnya,tidak dapat
mewarnainya. Hanya bila diberi perlakuan panas yang cukup,pewrana yang sesuai
dapat menembus endospore. Tetapi sekali pewarna tersebut memasuki
endospora,sukar dihilangkan. Ada 2 metode yang umum dipakai yaitu metode
Klein dan Scaeffer-Fulton.Ukuran dan letak endospore didalam sel merupakan ciri-
ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri pembentuknya.

PRINSIP
Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga zat warna
utama (contoh: Malachite green- Scaeffer Fulton) dapat masuk kedalam spora
sehingga berwarna hijau. Melalui pendinginan warna utama akan terperangkap
kedalam spora,dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel vegetatif akan
terlepas sehingga pada saat pewarna kedua (Safranin) sel vegetatif akan berwarna
merah.

BAHAN
Biakan
Biakan berumur 48-72 jam :
Bacillus cereus dalam agar nutrien miring
Clostridium butyricum dalam Tioglikolat

Reagen
Malachitegreen
Safranin

PERALATAN
 Kaca objek bersih
 Pensil gelas atau spidol permanen
 Ose (loop) atau jarum tusuk (needle)
 Pembakar Bunsen /spirtus
 Kertas serap
 Kertas lensa
 Hotplate
 Bak pewarnaan
 Mikroskop
PROSEDUR
1. Bersihkan 3 buah kaca objek dengan baik
2. Buat masing-masing olesan dengan cara aseptic
3. Biarkan olesan kering diudara dan lakukan fiksasi panas
4. Genangi olesan dengan Malachite green dan tempatkan pada tempat
panas(hotplate),biarkan beruap selama 3 menit. Jangan sampai kering
5. Dengan bantuan pinset,letakkan kaca objek tersebut diatas rak pada bak
pewarnaan dan biarkan sampai dingin
6. Cuci kelebihan pewarna dengan air mengalir dari pipet tetes
7. Genangi olesan tadi dengan Sarfranin selama 30-60 detik
8. Cuci dengan air,biarkan kering diisap dengan kertas isap(tissue)
9. Periksa dibawah mikroskop dengan ditambahkan minyak imersi

Gambar 2. Prosedur Tetes Gantung

 Hasil Pengamatan
Bacilus cereus Clostridium sp
Drawing of a
representative field

Warna spora Hijau Hijau

Warna sel vegetatif Merah Merah

Letak endospore Sentral Terminal

Gambar :