PEWARNAAN SPORA BAKTERI

LAPORAN PRAKTIKUM

Untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Mikrobiologi

yang dibina oleh Agung Witjoro, S.Pd, M.Kes

Disusun oleh:

Kelompok 6

S1 Pendidikan Biologi Offering B

Anggi Kharisma Putri (150341603912)

Annisaa Ahmada Atusta (150341603464)
Iim Rohima Agustin (150341607009)
Indatus Sholikhah (150341601250)
Lia Alfiani R. (150341606455)
Muhibbatul Aina (150341606479)

The Learning University

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
FEBRUARI 2017
 PEWARNAAN SPORA BAKTERI
A. Topik
Pewarnaan Spora Bakteri
B. Tujuan Praktikum

1. Untuk memperoleh keterampilan melakukan pewarnaan spora bakteri

2. Untuk mengetahui ada atau tidak adanya spora bakteri

C. Dasar Teori
Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai
fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan
amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana kedua mikroorganisme
itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak
menguntungkan. Jenis-jenis bakteri tertentu, terutama yang tergolong dalam genus
Bacillus dan Clostridium mampu membentuk spora. Spora yang dihasilkan diluar
sel vegetatif (eksospora) atau di dalam sel vegetatif (endospora) (Pratiwi, 2008).
Bakteri membentuk spora bila kondisi lingkungan tidak optimum lagi
untuk pertumbuhan dan perkembangannya, misalnya medium mengering,
kandungan nutrisi menyusut dan sebagainya (Hastuti, 2012).
Beberapa spesies bakteri menghasilkan spora eksternal. Streptomyces
misalnya, meghasilkan serantaian spora (disebut konidia), yang disangga di ujung
hifa, suatu filamen vegetatif. Proses ini serupa dengan proses pembentukan spora
pada beberapa cendawan. Spora pada bakteri adalah endospora, suatu badan yang
refraktil terdapat dalam induk sel dan merupakan suatu stadium isrtirahat dari sel
tersebut. Endospora memiliki tingkatme tabolisme yang sangat rendah sehingga
dapat hidup sampai bertahun-tahun tanpa memerlukan sumber makanan dari luar
(Irianto, 2006).
Pembentukan spora dapat dianggap sebagai suatu proses diferensiasi dari
suatu siklus hidup dalam keadaan-keadaan tertentu. Hal ini berbeda dari peristiwa
pembelahan sel karena tidak terjadi replikasi kromosom. Kemampuan
menghasilkan spora memberi keuntungan ekologis pada bakteri, karena
memungkinkan bakteri itu bertahan dalam keadaan buruk (Pratiwi, 2008).
D. Alat dan Bahan

Alat dan Bahan

Alat:

1. Mikroskop 5. Kawat penyangga

2. Kaca Benda 6. Pipet

3. Lampu spiritus 7. Pinset

4. Mangkuk pewarna 8. Botol penyemprot

Bahan:

1. Biakan murni bakteri 7. Lisol

2. Aquades steri; 8. Sabun cuci

3. Larutan hijau malakit 5% 9. Korek api

4. Larutan safranin 0,5% 10. Lap

5. Kertas Lensa 11. Kertas tissue

6. Alkohol 70%

E. Prosedur

Menyediakan kaca benda yang bersih, lalu melewatkan di atas nyala api
lampu spiritus.

Meneteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut.

 Mengambil inokulum bakteri yang akan diperiksa secara aseptik, lalu
meletakannya di atas tetesan aquades itu. Kemudian meratakan perlahan-
lahan dan menunggu sampai mengering.

Melakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut di atas nyala api
spiritus dengan cepat

Meneteskan larutan hijau malakit di atas sediaan itu, lalu memanasan sediaan
di atas nyala api spiritus selama 3 menit. Larutan dijaga agar tidak mendidih
atau mengering, jika mengering segera menambahkan lagi larutan tersebut.

Meletakkan sediaan tersebut di atas kawat penyangga yang diletakkan di atas

mangkuk pewarna, lalu membiarkan sampai dingin
 Mencuci kelebihan larutan hijau malakit dengan air kran dalam botol
F. penyemprot

G.

H.

I. Meneteskan larutan safranin di atas sediaan tersebut, lalu membiarkan

selama 3 menit.
J.

K.

L.
Mencuci kelebihan larutan safranin pada sediaan tersebut
M.

N.

Mengeringkan sediaan dengan kertas penghisap dan mengamati di bawah

mikroskop
F. Hasil

Koloni Ada/Tidak ada spora Bentuk spora Letak Spora Gambar

1. Tidak ada spora

- -

2. Ada spora

Oval
Bebas
(bulat telur)

G. Analisis
Pada saat menguji dan mengamati ada tidaknya spora pada bakteri
(endospora) kami melakukan percobaan dengan menggunakan pewarna. Kami
menguji bakteri biakan yang telah kami temukan sebelumnya di Kantin FMIPA,
jadi kami tidak menggunakan bakteri Bacillus subtilis dan Bakteri Clostridium
botulinum.Pertama, kami menyiapkan kaca benda yang bersih lalu
melewatkannya di atas nyala api lampu spirtus agar steril. Lalu kami meneteskan
satu ose aquades steril di atas kaca benda tersebut. Setelah itu, secara aseptik kami
mengambil inokulum koloni bakteri 1 yang akan diperiksa terlebih dahulu dan
meletakkannya diatas tetesan aquades tersebut. Lalu kami meratakannya secara
perlahan sampai kering. Kami melakukan fiksasi, lalu untuk mengujinya sediaan
perlu diteteskan larutan hijau malakit 5 % dan memanaskan sediaan selama 3
menit. Lalu menunggu sampe dingin. Setelah dingin sediaan dibilas secara
perlahan dengan menggunakan air keran. Langkah selanjutnya adalah meneteskan
larutan safranin di atas sediaan dan membiarkannya selama 3 menit. Fungsi
larutan safranin ini adalah agar diserap bakteri sebagai penanda bakteri,
sedangkan larutan hijau malakit tadi berfungsi sebagai pewarna atau penanda
sporanya. Setelah 3 menit kami mencuci larutan safranin dan menunggunya
hingga kering. Langkah terakhir adalah mengamati sediaan koloni bakteri 1 di
miksroskop binokuler cahaya. Hasilnya, pada perbesaran 1000 x nampak ada
banyak bakteri bentuk basil berwarna transparan dengan tepi kehijauan tanpa ada
warna merah sedikitpun. Pada pengamatan koloni 2 langkah kerjanya sama
dengan koloni 1 tadi. Hasil yang didapat adalah pada perbesaran 1000 x nampak
banyak bakteri berbentuk coccus berwarna merah dengan tepi transparan serta
pada beberapa bakteri terdapat gumpalan kecil berbentuk oval dan bewarna hijau
yang diduga adalah spora. Letak sporanya adalah bebas.

H. Pembahasan
Prinsip dari percobaan ini adalah pemanasan akan mengembangkan
lapisan luar spora sehingga zat warna utama dapat masuk masuk ke dalam spora
sehingga berwarna hijau. Melalui pendinginan warna utama akan terperangkap di
dalam spora,dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel vegetatif akan
terlepas sehingga pada saat pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif akan
berwarna merah (Dwidjoseputro, 2005).

Ada 2 jenis bakteri yang dapat membentuk spora:

1. Clostridium adalah bakteri yang bersifat anaerob.
2. Bacillus adalah Bakteri yang bersifat aerob.

Stuktur endospora berbeda-beda untuk setiap spesies, Clostridium

botullinum : sporanya subterminal, Clostridium tetani : sporanya terminal,
Bacillus anthracis : sporanya central.
Endospora bakteri merupakan struktur yang paling tahan terhadap lingkungan
yang ekstrim misalnya kering, kepanasan, dan keadaannya asam. Pewarnaan
Spora tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan
khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.
Untuk pewarnaan spora, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau
bisa masuk ke dalam spora (Razali, 1987).
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar
baik bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora
juga disebut endospora yang masih terletak didalam sel bakteri. Endospora jauh
lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk daripada bakteri biasa yaitu bakteri
dalam bentuk vegetatif, Sporulasi (proses pembentukan spora) dapat dicegah
apabila selalu diadakan pemindahan biakan ke medium yang baru (Margareth,
1998).
Pengecatan endospora dengan larutan hijau malasit, bakteri penghasil
endospora akan menunjukkan reaksi positif yaitu larutan hijau malasit akan
berikatan dengan spora sehingga saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat
penutup atau safranin tidak bisa diikat oleh endospora. Sedangkan pada bakteri
yang tidak menghasilkan endospora maka larutan hijau malakit tidak dapat diikat
(Pearce 2009).
Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat
pada spore coat, yang terdiri dari cross-linked keratin. Beberapa endospora
mempunyai diameter lebih besar daripada sel, dimana sel tersebut akan nampak
menggembang pada letak endosporanya. Letak endospora yang berbeda diantara
spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal,
subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel
vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki pengertian letak el
vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti
lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora
dapat berukuran lebih besar ataupun kecil dari sel vegetatif yang terdiri dari
lapisan protein yang terbuat dari keratin (Pelezar 2008).
Dari data dan hasil pengamatan yang kami lakukan di atas menunjukkan
bahwa pada koloni bakteri 1 tidak terlihat adanya spora, padahal pada pengamatan
sebelumnya telah diidentifikasi bahwa koloni bakteri 1 adalah bakteri Bacillus
yang seharusnya memiliki spora. Bakteri penghasil endospora akan menunjukkan
reaksi positif yaitu larutan hijau malasit akan berikatan dengan spora sehingga
saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat penutup atau safranin tidak bisa
diikat oleh endospora, tetapi pada hasil pengamatan larutan hijau malakit tidak
dapat diikat. Ketidaksesuaian ini kemungkinan terjadi karena pemanasan kurang
lama, pencucian terlalu bersih, pewarnaan yang kurang tebal, dan juga kurang
telitinya praktikan.
Berdasarkan data hasil pengamatan pada bakteri koloni dua bahwa pada
koloni tersebut terdapat banyak bakteri yang berbentuk coccus dan berwarna
merah dengan beberapa gumpalan kecil berbentuk oval dan berwarna hijau di
sekitar sel bakteri. Bentukan oval yang berwara hijau merupakan spora dari koloni
bakteri yang diakibatkan oleh pewarna hijau malakit sedangkan bentukan coccus
yang berwarna merah merupakan sel dari koloni bakteri diakibatkan oleh pewarna
safranin. Pada pewarnaan spora bakteri ini digunakan pewarna hijau malakit dan
safranin. Dalam prosesnya, larutan hijau malakit diteteskan pada sediaan yang
telah difiksasi kemudian dipanaskan. Proses pemanasan ini menyebabkan lapisan
luar dari spora mengembang sehingga pori-pori dapat membesar dan zat warna
(larutan hijau malakit) meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri dan
menjadikan spora bakteri nampak hijau (Pelczar.1986). Setelah dipanaskan,
dilakukan pendinginan yang bertujuan untuk melekatkan warna hijau pada spora
bakteri. pewarna kedua (safranin) dapat meresap pada sel vegetatif. Adanya
pewarnaan kedua ini menyebabkan sel vegetatif bakteri berwarna merah.

I. Diskusi
1. Apakah fungsi spora pada bakteri?
Jawaban: Spora bakteri berfungsi untuk melindungi diri terhadap faktor
luar yang tidak menguntungkan. Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang
sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar.
Sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba
dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana kedua mikroorganisme itu
berubah bentuk
2. Mengapa diperlukan pemanasan dalam proses pewarnaan spora? Jelaskan!
Jawaban: pemanasan pada proses pewarnaan spora bertujuan agar bakteri
dapat menempel pada kaca benda sehingga mudah diamati dan juga untuk
membunuh mikroorganisme yang akan diamati
J. Kesimpulan
1. Pewarnaan bakteri dilakukan dengan mengambil inokulasi bakteri yang
diletakkan pada kaca benda yang berisi satu ose aquades steril, setelah
kering dasar kaca benda dipanaskan agar bakteri dapat menempel pada
kaca benda sehingga mudah diamati dan juga untuk membunuh
 mikroorganisme yang akan diamati. setelah itu meneteskan larutan hijau
malakit kemudian dipanaskan selama 3 menit setelah dingin dibilas dan
ditetesi safranin dan menunggu selama 3 menit setelah itu dibilas dan
diamati di Mikroskop perbesaran 1000 kali
2. Pada bakteri koloni 1 setelah diuji tidak memiliki spora. Hal ini ditandai
saat diamati spora berwarna merah dikarenakan larutan hijau malakit tidak
dapat diikat bakteri, dikarenakanbakteri tidak menghasilkan endospora,
sedangkan pada bakteri koloni 2 setelah diuji memiliki spora. Hal ini
ditandai saat diamati spora berwarna hijau dikarenakan larutan hijau
malasit akan berikatan dengan spora sehingga saat pencucian akan tetap
berwarna hijau dan cat penutup atau safranin tidak bisa diikat oleh
endospora.

K. Daftar Rujukan

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Hastuti, S.U. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi . Malang : UMM Press.
Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Jilid I. Bandung : Yrama Widya.
Margareth F W. 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Jakarta : Erlangga.
Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri,
penerjemah. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan
dari : Anatomy and Physiology for Nurses (halaman : 200).
Pelezsar, M dan Chan, ECS. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi 2. Jakarta :
Universitas Indonesia Press.
Pratiwi, T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga
Razali, U. 1987. Mikrobiologi Dasar. Jatinangor : FMIPA UNPAD.