1

PRAKTIKUM II
MIKROSKOP & PEMBUATAN SEDIAAN

Kompetensi : mahasiswa mengetahui bagian-bagian dari mikroskop dan

membuat sediaan basah dan kering

Pendahuluan
Mikroskop adalah salah satu instrument yang sangat penting dalam bidang
mikrobiologi. Dengan mikroskop akan diperoleh pembesaran yang
memungkinkan mikroorganisme yang tidak tampak dengan mata telanjang
menjadi tampak. Ada dua kategori mikroskop berdasarkan sumber
pencahayaannya: yaitu mikroskop cahaya dan mikroskop electron. Mikroskop
cahaya yaitu mikroskop yang menggunakan sistem lensa optis, meliputi
mikroskop medan terang, medan gelap, fluoresensi, dan fase kontras.

Jenis- jenis mikroskop

1) Mikroskop Cahaya (Medan terang)
Ada dua tipe dasar dari mikroskop medan terang yaitu : mikroskop sederhana
dan mikroskop campuran.
 Mikroskop sederhana, sebuah mikroskop sederhana hanya memiliki
satu lensa pembesaran, yang lebih mirip kepada kaca pembesar
daripada mikroskop modern.
 Mikroskop campuran, mikroskop sederhana telah digantikan pada
laboratorium modern sekarang ini dengan mikroskop campuran.
Sebuah mikroskop campuran menggunakan lensa berseri untuk
pembesarannya.

2) Mikroskop Medan Gelap

Mikroskop medan gelap susunannya mirip dengan mikroskop medan terang,
perbedaannya hanya pada mikroskop medan gelap latar belakangnya dibuat
gelap sedangkan cahaya dipancarkan hanya pada objek yang diamati.
Mikroskop ini sangat berguna untuk mengamati mikroorganisme hidup
golongan spiroketa (spirochetes), seperti Treponema pallidum, penyebab
sifilis.
 2

3) Mikroskop Fase kontras

Cara ideal untuk mengamati organisme adalah dilakukan dalam keadaan
alaminya, tidak diberi warna dan dalam kondisi hidup. Pengamatan dengan
menggunakan mikroskop cahaya biasa tidak mungkin dilakukan. Misalnya
pada pengamatan bakteri, nukleus yang tidak diwarnai tidak dapat diamati dan
melihat flagel dan silia pada mikroorganisme.

4) Mikroskop ultra violet/ Fluoresensi

Kekuatan daya pisah mikroskop dapat ditingkatkan dengan menggunakan
cahaya bergelombang pendek yaitu ultra violet (200-400 nm). Beberapa bahan
kimia tertentu dapat mengabsorpsi sinar u.v dan dipantulkan kembali sebagai
cahaya yang bergelombang lebih panjang. Contoh bahan tersebut adalah
flouresein dan akridin.

5) Mikroskop elektron
Mikroskop elektron memiliki kemampuan jauh lebih besar dibanding
mikroskop cahaya. Mikroskop ini menggunakan berkas-berkas elektron
dengan panjang gelombang yang jauh lebih pendek dari panjang gelombang
cahaya biasa. Berkas elektron yang digunakan umumnya memíliki panjang
gelombang antara 0,005 sampai dengan 0,0003 nm. Panjang gelombang yang
sangat pendek ini, memungkinkan dicapainya daya pisah beberapa ratus kali
lebih besar dibanding pada mikroskop biasa.
Gambar 1. Mikroskop Elektron
 3

Bagian – bagian mikroskop cahaya

1. Eyepiece / oculars (lensa okuler) Untuk
memperbesar bayangan yang dibentuk
lensa objektif
2. Revolving nosepiece (pemutar lensa
objektif)
Untuk memutar objektif sehingga
mengubah perbesaran
3. Observation tube (tabung
pengamatan/ tabung okuler)
4. Stage (meja benda) Spesimen
diletakkan di sini
5. Condenser (condenser)
Untuk mengumpulkan cahaya
supaya tertuju ke lensa objektif
6. Objective lense (lensa objektif)
Memperbesar spesimen
7. Brightness adjustment knob (pengatur
kekuatan lampu) Gambar 2. Bagian-bagian Mikrroskop
Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu
8. Main switch (tombol on-off)
9. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter)
Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri
10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar)
11. Specimen holder (penjepit spesimen)
12. Illuminator (sumber cahaya)
13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal) Untuk
menaikkan atau menurunkan object glass
14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal)
Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas
15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar)
Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat
16. Fine focus knob (sekrup fokus halus)
Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat
17. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler)
18. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser)
Untuk menaik-turunkan kondenser
 4

Prosedur Menggunakan Mikroskop Cahaya

1. Menyalakan lampu
a. tekan tombol on (8)
b. atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7)
2. Menempatkan spesimen pada meja benda
a. Letakan objek glas diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11).
Jika meja benda belum turun, diturunkan dengan sekrup kasar (15)
b. Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan
diperkirakan memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup
vertikal dan horizontal (13) dan (14)
3. Memfokuskan
a. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x lalu putar
sekrup kasar (15) sehingga meja benda bergerak ke atas untuk mencari
fokus
b. Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan, maka putar (2) pada
perbesaran selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x. kemudian putar
sekrup halus (16) untuk mendapatkan fokusnya
c. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih
tinggi

Perbesaran total
Ukuran spesimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan perbesaran
lensa okuler dengan lensa objektif. Misal = Okuler (10x) x Objektif (40x) = 400x
 5

Penggunaan minyak imersi

Semakin kecil nilai daya pisah, akan semakin kuat kemampuan lensa untuk
memisahkan dua titikyang berdekatan pada preparat sehingga struktur benda terlihat
lebih jelas. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan indeks bias atau
menggunakan cahaya yang memiliki panjang gelombang (λ) pendek. Biasanya
dapat digunakan minyak imersi untuk meningkatkan indeks bias pada perbesaran 10 x
100
a. Jika fokus pada perbesaran 10 x 40 telah didapatkan maka putar ke perbesaran
objektif 100x
b. tetesi minyak imersi 1 – 2 tetes dari sisi lensa
c. Jika telah selesai menggunakan mikroskop, bersihkan lensa objektif 100x
dengan kertas lensa yang dibasahi xylol.

Gambar 3. Fungsi Minyak Immersi

Cara pemeliharaan mikroskop

1. Letakkan dan simpan mikroskop pada tempat yang kering, bebas debu dan
bebas getaran.
2. Hindari mikroskop dari sinar matahari langsung.
3. Bila mikroskop tidak digunakan tutuplah dengan plastik atau masukan dalam
kotaknya supaya terhindar dari debu.
4. Jangan meletakkan mikroskop dekat centrifuge.
5. Simpan mikroskop dalam kotak penyimpanan mikroskop atau lemari
mikroskop dengan cahaya lampu 5 watt.
6. Selalu membersihkan mikroskop dari oil imersi dengan xylol setelah selesai
digunakan.
 6

Pembuatan sediaan

Morfologi bakteri dapat diamati dengan cara mebuat preparat mikroskopik.

Preperat mikroskopik ada dua macam yaitu preparat basah dan preparat kering.
Preparat basah yaitu preparat yang digunakan untuk mengamati jasad renik yang
masih hidup dengan menggunakan cairan tertentu. Prepearat kering dibuat untuk
digunakan untuk proses pewarnaan, yaitu untuk mengamati mikroba yang telah
diwarnai dengan zat kimia tertentu yang biasanya berhubungan dengan mikroba
tersebut.
Perbesaran saat menggunakan objektif 100 kali, diafragma iris kondensor
harus digunakan dalam keadaan terbuka penuh, karena objektif dengan perbesaran
tinggi membutuhkan lebih banyak cahaya. Perbesaran objektif 100 kali juga harus
menggunakan minyak imersi. Hal ini bertujuan untuk mencegah hilangnya cahaya
yang disebabkan oleh perbedaan bias (refraktif) antara kaca dan udara. Indeks bias
udara 1, sedangkan kaca 1.56 dan indeks bias minyak imersi sama dengan kaca yaitu
1,56
Olesan yang baik adalah olesan yang tidak terlalu tebal dan tidak terlalu tipis.
Jika terlalu tebal, maka akan terjadi penumpukan mikroba, sehingga akan sulit
diamati. Jika terlalu tipis juga akan sulit diamati karena bentuknya tidak jelas.
Fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan atau penempelan struktur sel
mikroorganisme pada suatu posisi. Selain itu fiksasi juga berfungsi untuk
menonaktifkan enzim lytic sehingga bakteri tidak mengalami lisis dan berubah bentuk
pada saat diamati. Fiksasi dilakukan setelah olesan pada kaca preparat sudah kering.
Jika olesan belum kering akan menyebabkan sel-sel mikroorganisme yang
bersangkutan menjadi tidak beraturan bentuknya. Tujuan dari fiksasi adalah pelekatan
bakteri supaya pada saat pencucian, bakteri tersebut tidak ikut hilang tercuci. Fiksasi
yang digunakan pada percobaan kali ini adalah fiksasi panas, yaitu dengan cara
melewatkan kaca preparat di atas api. Fiksasi dilakukan sampai kaca preparat terasa
hangat apabila ditempelkan pada punggung tangan. Fiksasi yang dilakukan tidak
boleh terlalu panas dan lama, karena bakteri yang ada pada preparat bisa hangus
terpanggang dan terjadi perubahan bentuk dan penyusutan sel.
Pengamatan dilakukan dengan mikroskop dengan perbesaran 1000x.
Hal ini dikarenakan ukuran bakteri yang sangat kecil, jika menggunakan perbesaran
biasa, akan menyulitkan pengamat dalam pengamatan bakteri.
Saat pengamatan perlu diberikan minyak imersi antara preparat dan lensa
objektif dikarenakan, cahaya yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda,
yaitu udara dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan
 7

yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan
pembiasan yang mendekati garis normal. Bahan yang mampu membiaskan cahaya
dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal
adalah minyak imersi. Selain itu, minyak imersi juga mempunyai indeks bias yang
mendekati atau identik dengan kaca.

Alat dan Bahan :

 Alat :
- Ose
- Bunsen
- Objek glass
- Deck glass
- Mikroskop
- Rak pewarnaan
- Pensil atau spidol
- Alkohol 95%
- Aquadest atau Nacl fisiologis steril
 Bahan : - Bakteri Eschericia coli dalam TSB
- Bakteri Staphyloccus aureus dalam TSB
- Bakteri Bacillus cereus dalam TSB
- Koloni Candida albican dalam NaCl

 Prosedur sediaan basah :

1. Bersihkan kaca obyek sehingga bebas dari lemak dan kotoran sebagai berikut :
a. Basahi telunjuk dan jari tengah tangan dengan antiseptik untuk
menghilangkan lemak yang ada di tangan
b. Teteskan alkohol 95% pada kedua permukaan kaca obyek
c. Tiriskan kaca obyek, kemudian seka dengan lap kertas
d. Setelah bersih pegang kaca obyek pada pinggirnya saja, jangan
menyentuh permukaan agar lemak dari jari tidak mengotori lagi.
2. Dengan pensil atau spidol tuliskan pada sisi kaca obyek (sisi yang tidak akan
terkenai zat warna) singkatan nama bakteri yang akan dioleskan atau nama
pembuatnya
3. Gunakan teknik aseptik dalam pembuatan olesan
a. Bila yang dipindahkan itu biakan dalam medium cair, maka tinggal
memindahkan 1-2 ose penuh biakan tersebut lalu tutup
 8

perlahan dengan deck glass usahan jangan sampai ada gelembung

udara
b. Bila yang dipindahkan itu biakan dalam medium padat, maka mula-
mula harus menaruh 1-2 ose penuh aquades steril atau NaCl fisiologis
steril pada kaca obyek, dengan jarum (ose) tusuk pindahan sedikit saja
biakan yang dimaksud lalu tutup perlahan dengan deck glass usahan
jangan sampai ada gelembung udara
Berikut ini dapat dilihat prosedur pembuatan preparat basah :

Gambar 4. Persiapan preparat basah

 Prosedur sedian kering :

1. Bersihkan kaca obyek sehingga bebas dari lemak dan kotoran sebagai berikut :
a. Basahi telunjuk dan jari tengah tangan dengan antiseptik untuk
menghilangkan lemak yang ada di tangan
b. Teteskan alkohol 95% pada kedua permukaan kaca obyek
c. Tiriskan kaca obyek, kemudian seka dengan lap kertas
d. Setelah bersih pegang kaca obyek pada pinggirnya saja, jangan
menyentuh permukaan agar lemak dari jari tidak mengotori lagi.
2. Dengan pensil atau spidol tuliskan pada sisi kaca obyek (sisi yang tidak akan
terkenai zat warna) singkatan nama bakteri yang akan dioleskan atau nama
pembuatnya
3. Untuk memudahkan meletakkan organisme ditempat yang sesuai, buat
lingkaran sebesar mata uang logam Rp. 100 ditengah-tengah permukaan kaca
bawah obyek dengan pensil atau spidol. Bila kelak telah berpengalaman,
langkah ini dapat ditiadakan
 9

4. Gunakan teknik aseptik dalam pembuatan olesan

a. Bila yang dipindahkan itu biakan dalam medium cair, maka tinggal
memindahkan 1-2 ose penuh biakan tersebut setelah mengocoknya
dengan baik tanpa membasahi sumbat tabung
b. Bila yang dipindahkan itu biakan dalam medium padat, maka mula-
mula harus menaruh 1-2 ose penuh aquades steril atau NaCl fisiologis
steril pada kaca obyek. Lalu dengan jarum (ose) tusuk pindahkan
sedikit saja biakan yang dimaksud
5. Dengan berpedoman pada lingkaran pada permukaan kaca obyek, sebarkan
organisme tersebut hingga rata
6. Biarkan olesan tersebut kering udara. Bila olesan tersebut berasal dari biakan
kaldu, biarkan mengering sampai setengah jam setelah olesan itu tampak
kering. Olesan yang dibuat dari organisme yang berasal dari biakan padat
biasanya lebih cepat mengering dan akan tampak seperti lapisan tipis berwarna
putih.
7. Setelah olesan itu betul-betul kering, lalu kan kaca obyek tersebut beberapa
kali di atas api bunsen sampai kaca obyek terasa agak panas bila ditempelkan
pada punggung tangan. Proses ini disebut fiksasi panas dan dimaksudkan
untuk mematikan semua organisme yang ada pada kaca obyek. Karena itu
semua kaca obyek bekas olesan bakteri terutama yang patogen hendaknya
disterilisasi terlebih dahulu sebelum dicuci.
8. Untuk masing-masing organisme siapkan 2 olesan pada 2 kaca obyek yang
berbeda.
9. Gunakan olesan mikoorganisme ini untuk pewarnaan.
 10

Berikut ini dapat dilihat prosedur pembuatan preparat kering :

 11

LEMBAR KERJA PRAKTIKUM II

MIKROSKOP & PEMBUATAN SEDIAAN
TUGAS PRAKTIKUM I
Tulislah bagian – bagian Mikroskop Cahaya dibawah ini beserta fungsinya.

1
.
PRAKTIKUM III
PEWARNAAN BAKTERI

Kompetensi :
1. Mempelajari teknik pewarnaan sel
3.Mengetahui bentuk struktur (morfologi) bakteri dengan jelas dari aplikasi
2.
2
pewarnaan sel
.
Pendahuluan
4 bakteri
Bakteri memiliki sifat transparan sehingga untuk mengamati morfologi
diperlukan suatu pewarnaan. Ada dua cara yang dapat digunakan untuk memeriksa
.
bakteri secara mikroskopis yaitu pemeriksaan langsung dan pemeriksaan tidak
5 cara diwarnai.
langsung dengan
.
1. Pemeriksaan langsung
Pemeriksaan langsung memiliki kelebihan bakteri yang diamati dalam
6
keadaan hidup. Cara ini termasuk cara yang cepat, mudah dan murah, tetapi sediaan
.
harus langsung diperiksa, karena sediaan akan cepat kering kalau tidak7 segera
diperiksa. Pemeriksaan langsung sediaan basah dapat menggunakan NaCl fisiologis
atau KOH untuk pemeriksaan jamur.
.
8
.

9
.
 12

Nama : Puput Millenia Romadhoni

NIM : P27903220018
No. Absen : 18
Kelas : Reguler Pegawai Tingkat Satu Semester Dua

LEMBAR KERJA PRAKTIKUM I

MIKROSKOP DAN PEMBUATAN SEDIAAN

TUGAS PRAKTIKUM I
Tulislah bagian bagian mikroskop cahaya dibawah ini beserta fungsinya

1. Eyeplece / oculars ( lensa okuler )

Untuk memperbesar bayangan yang dibentuk lensa objektif
2. Lengan mikroskop
Berfungsi sebagai tempat untuk memegang mikroskop ketika memindahkan mikroskop
3. Revolving noseplece ( pemutar lensa objektif )
Untuk memutar objektif sehingga mengubah perbesaran
4. Objective lense ( lensa objektif )
Memperbesar spesimen
5. Stage ( meja benda )
Spesimen diletakkan di sini
6. Condenser ( condenser )
Untuk mengumpulkan cahaya supaya tertuju ke lensa objektif
7. Fine focus knob ( sekrup fokus halus )
Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat
8. Vertical feed knob ( sekrup pengantar vertikal )
Untuk menaikkan dan menurunkan object glass
Horizontal feed knob ( sekrup pengatur horizontal )
Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas
9. Kaki mikroskop
Berguna untuk penyangga atau penopang mikroskop
 13

Nama : Puput Millenia Romadhoni

NIM : P27903220018
No. Absen : 18
Kelas : Reguler Pegawai Tingkat Satu Semester Dua

TUGAS PRAKTIKUM II :
1. Buatlah masing-masing kelompok 1 preparat basah dan preparat kering dari masing –
masing mikrooorganisme yang telah disediakan, lalu foto hasil kerja kalian dan tempel
di buku laporan masing – masing.
2. Simpanlah dengan rapi preparat kering yang telah dibuat kedalam kotak preparat untuk
persiapan praktikum pewarnaan dipertemuan berikutnya.

Preparat kering Preparat basah

Preparat BTA Preparat SADT