Laporan Praktikum

MIKROBIOLOGI
Praktikum VI
Judul Praktikum : Pewarnaan Gram
Prodi/Kelas : Biologi Nondik/B
Koordinator Asisten : Dr. Yuliana Retnowati , M.Si
Asisten Lab. : 1. Adam Suduri, S.Pd
2. Moh. Ikbal Riski A. Danial, S.Pd
3. Windi Oktaviani
4. Sri Vanvaria Usman
Kelompok : V (lima)
Anggota Kelompok : 1. Fahria Ningsih Adam
2. Regita Cahyani Daud
3. Sri Nuning B. Tanaiyo
4. Ririn Septiani
5. Anisa S. Mayasin
6. Wahyuni Ws. Harunja
7. Syifa Andria Puteri
8. Moh Rizal N. Matau

Nilai Paraf

LABORATORIUM BIOLOGi

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN IPA
UNIVERSITAS NEGERI GORONTALO
A. Judul
Pewarnaan Gram
B. Tujuan
Untuk mengetahui perbedaan bakteri gram positif dengan gram negatif
C. Dasar Teori / Tinjauan Pustaka
Pewarnaan secara gram adalah pewarnaan yang sangat berguna dan
paling banyakdigunakan dalam laboratorium mikrobiologi dan klasifikasi
bakteri, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi.
Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnyalapisan peptidoglikan di
dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram
positif dangram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal
dan membran sel selapis.Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding
sel tipis yang berada di antara dua lapismembran sel (Jawetz,2008).
Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu
dari kelompoklainnya, maka pewarnaan ini juga disebut pewarnaan
diferensial. Mikroorganisme terutama bakteri sulit dilihat dengan
menggunakan mikroskop cahaya, karena tidak mengasorbsi
ataupunmembiaskan cahaya (Jawetz,2008).
Tehnik pewarnaan merupakan cara yang banyak dipergunakan untuk
melihat struktur danmorfologi bakteri. Terdapat beberapa tehnik pewarnaan
diantaranya, pewarnaan sederhanamerupakan pewarnaan yang hanya
menggunakan satu macam larutan warna contohnya pewarnaan sederhana dan
pewarnaan negative, kemudian pewarnaan diferensial, merupakan pewarnaan
yang menggunakan lebih dari satu macam larutan warna, contohnya
pewarnaan gram, pewarnaan tahan asam, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan
spora (Jawetz,2008).
Sebelum melakukan prosedur pewarnaan terhadap bakteri, terdapat
beberapa hal yang perlu diperhatikan, seperti gelas objek dibersihkan dengan
menggunakan alcohol 70% untukmenghilangkan debu atau lemak, kemudian
pewarnaan diferensial terlebih dahulu dibuat preparat, dan fiksasi dapat
dilakukan dengan melewatkan preparat ulas diatas nyala api, adapuntujuan
dilakukan fiksasi antara lain untuk melekatkan sel bakteri pada objek glass,
mematikan sel bakteri dan lain sebagainya (Jawetz,2008).Pewarnaan yang
dilakukan merupakan pewarnaan gram.
Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak
digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat
diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel.
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan
gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans (Christian gram
1884).
Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena
menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial
karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri,
sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram
positif (Cristian gram, 1884)
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus,
spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi
beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal,
diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus,
diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua
yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro,1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit,
karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil.
Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel
bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-
penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro,1998)
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay,1994)
 Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain
pewarnaan sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu
pewarna pada lapisan tipis yang sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu
prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba
atau bagian-bagian sel mikroba dari pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan
differensial digunakan untuk bakteri
D. Alat dan Bahan

No Nama Alat Gambar Fungsi

1. Gelas objek dan Berfungsi untuk
paper glass media yang akan di
amati di mikroskop

2. Lampu spritus Untuk mensterilkan

media agar tidak
terkontiminasi

3. Pipet Untuk memngambil

aquades,alkhol dll.

4. Jarum ose Untuk mengambil

media yang terdapat
didalam cawan petri
6. Mikroskop Untuk mengamati
gram positif dan
negatif

No Nama Bahan Gambar Fungsi

1. Alkohol 96% Untuk mensterilkan
media

2. Aquades Untuk membersihkan

warna yang terdapat
pada media

3. Lugol (Mordan) Berfungsi untuk

melekatkan warna
pada dinding sel
bakteri
4. Ungu violet Berfungsi untuk
memberikan warna
ungu pada mikroba
sebagai pewarna
primer

5. Safranin Berfungsi untuk sel

berwarna merah atau
bisa di sebut gram
negatif
E. Prosedur Kerja

Pewarnaan Gram

Menyiapkan media dan tetesi sedian dengan 2-3 ungu

violet, larutan zat warna harus menutupi seluruh
permukaan sediaan, dan diamkan selama 1 menit

Mengambil sediaan dan dibilas dengan air mengalir

kemudian keringkan di udara atau dengan
menggunakan kertas isap

Mengambil kembali sediaan terus ditetesi dengan

larutan lugol (mordan) dan diamkan selama 2 menit,
cuci dengan air dan keringkan

Meneteskan larutan peluntur (etanol 95%) selama

kurang lebih 30 detik, setelah itu di cuci dengan aif
mengalir dan kering-anginkan

Memberikan larutan cat penutunp (safranin) selama

1 menit, cuci dengan air lalu keringkan di udara

Mengamati sediaan dibawah mikroskop dengan

menggunakan lensa objektif dengan perbesaran
besar yang terlebih dahulu sediaan di tetesi minyak
intersi
F. Hasil Pengamatan

Deskripsi :
Pewarnaan secara gram adalah pewarnaan yang sangat berguna dan
paling banyakdigunakan dalam laboratorium mikrobiologi dan klasifikasi
bakteri, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi.
Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnyalapisan peptidoglikan di
dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram
positif dangram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal
dan membran sel selapis.Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding
sel tipis yang berada di antara dua lapismembran sel (Jawetz,2008).
Jadi untuk gambar di atas yaitu termasuk gram positif karena warna
yang terlihat warna ungu violet. Diamati dibwah mikroskop dengan
perbesaran 10x 0,25.
Kokus adalah bakteri yang berbentuk bulat.Bakteri kokus ada yang
tersusun sendiri (monokokus), ada juga yang berbentuk seperti rantai
(streptokokus).
G. Pembahasan
Banyak obyek yang telah mengalami beberapa proses dalam mikroteknik
dan kemudian dibalsam lalu berubah bening yang mengakibatkan tidak dapat
diamati dengan mikroskop. Cara mengatasi permasalahan ini, yakni
penggunaan zat pewarna yang dapat mempertegas jaringan maupun organ
tumbuhan ataupun hewan. Proses pewarnaan dapat menggunakan pewarna
yang tahan lama dan sesuai dengan kebutuhan pewarnaan. Zat pewarna harus
mampu diserap oleh irisan preparat agar dapat membedakan bagian jaringan
maupun organ secara jelas. Zat-zat warna itu dapat dibedakan menjadi 2
kelompok yaitu zat warna asam dan zat warna basa. Yang termasuk dalam zat
warna asam yaitu hematoxylin dan safranin, yang dapat mewarnai inti dan
jaringan berkayu, sedangkan zat warna basa yaitu eosin dan fast green, tidak
dapat mewarnai inti dan jaringan berkayu, tetapi bagian-bagian lain dari
jaringan (Moebadi, 2011).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri
ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro,1998)
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa
macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan
tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus,
sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro,1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri
ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro,1998) Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang
sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar
yang berlaku (Lay,1994)
Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain
pewarnaan sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu
pewarna pada lapisan tipis yang sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu
prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba
atau bagian-bagian sel mikroba dari pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan
differensial digunakan untuk bakteri
H. Kesimpulan
Kesimpulan yang didapat dari praktikum kali ini adalah praktikan mampu
melakukan metode pewarnaan gram bakteri dan praktikan juga mampu
membedakan bakteri gram positif dan gram negatif. Dari pengamatan yang
telah dilakukan kami mendapatkan hasil bakteri gram positif dengan bentuk
cocus. Kokus adalah bakteri yang berbentuk bulat.Bakteri kokus ada yang
tersusun sendiri (monokokus), ada juga yang berbentuk seperti rantai
(streptokokus).
I. Pertanyaan
1. Sebutkan beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan
2. Buatkan ikhtisar perwarnaan gram
3. Jelaskan 2 mekanisme pewarnaan mikroba
Penyelesaian :
1. Fiksasi, Pelunturan zat warna, Identifikasi pewarnaan, Substrat, Zat warna
penutup atau zat warna lawan
2. Teknik pewarnaan Gram dimulai dari pengambilan spesimen, kemudian
dilanjutkan dengan persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan
pemeriksaan slide di bawah mikroskop. Bakteri Gram positif memiliki
lapisan peptidoglikan yang tebal (20-80 nm), sehingga akan mengambil
kompleks stain-mordant primer dan akan tampak biru atau ungu di bawah
mikroskop. Sementara itu, bakteri Gram negatif memiliki lapisan
peptidoglikan yang tipis (1-3 nm) dan persentase ikatan silang yang rendah
diikuti dengan lapisan membran luar yang tipis (7-8 nm), sehingga tidak
mengikat kompleks stain-mordant dan akan tampak merah di bawah
mikroskop.
3. Pewarnaan Sederhana atau Tunggal, dengan menggunakan satu macam zat
warna seperti: Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.
Pemberian warna pada bakteri atau jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan
yang sudah di fiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Lapisan tadi
dimasukkan dalam larutan pewarna selama jangka waktu tertentu,
kemudian larutan itu dicuci dengan air dan kaca objeknya dikeringkan
dengan kertas penghisap. Sel akan terwarnai merata, kecuali bagian-bagian
tertentu akan tampak terwarnai lebih gelap.

Pewarnaan Differensial dengan menggunakan dua atau lebih zat warna.

Prosedur pewarnaan yang dapat menghasilkan perbedaan di antara sel-sel
mikroorganisme atau bagian-bagian sel mikroorganisme disebut teknik
pewarnaan diferensial. Teknik ini menggunakan lebih dari satu larutan zat
pewarna.

Pewarnaan Gram . Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang

penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan Gram.
Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan
ungu kristal, larutan yodium, alkohol (sebagai bahan pemucat), dan
safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Hasil
pewarnaan bakteri dengan metode Gram ini menghasilkan dua kelompok
bakteri yaitu: Bakteri Gram positif yaitu bakteri yang mempertahankan
zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang
lain adalah bakteri Gram negatif, yaitu bakteri yang akan kehilangan ungu
kristal ketika dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarna
tandingan dengan warna merah safranin, tampak berwarna merah.
Perbedaan warna bakteri menjadi ungu dan merah disebabkan oleh
perbedaan struktur kimiawi bakteri tersebut. Teknik pewarnaan Gram ini
pertama kali dipublikasikan pada tahun 1884 oleh seorang ahli
Bakteriologi Denmark, Christian Gram.
 Daftar Pustaka
Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. 9 Mei 2017.
Dwidjo seputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan .Malang.
Fitria, Bayu.2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif). 9 Mei
2017.
Lay, Bibiana.. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Rajawali. Jakarta
Hadioetomo, R. S. 1991. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Erlangga. Jakarta Manurung,
Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri. 9 Mei 2017.
Pelczar, M. J. dan Chan, E. C. S. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi 1.Jakarta :
Penerbit Universitas Indonesia.
Lampiran