LAPORAN PRAKTIKUM

PEWARNAAN MAJEMUK
Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Mikrobiologi

Dosen pengampu :
Ukit, M,Si.
Milla Listiawati, M.Pd

Disusun oleh :
Kelompok 7
Muhammad Utari 1182060075
Permata Hati 1182060091
Syifa Khamelia Wandani 1182060100

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

JURUSAN MATEMATIKA DAN ILMU ALAM
FAKULTAS TARBIYAH DAN KEGURUAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN GUNUNG DJATI BANDUNG
2020
A. Judul Praktikum : PEWARNAAN MAJEMUK
B. Tujuan Praktikum :
- Mahasiswa mampu melakukan pewarnaan majemuk
untuk membedakan warna antara bakteri gram negatif
dan bakteri gram positif
- Mahasiswa mampu mengkomunikasikan prosedur kerja
dalam bentuk bagan alur
- Mahasiswa mampu mengkomunikasikan hasil
pengamatan dalam bentuk tabel pengamatan
- Mahasiswa mampu menginterpretasi (membuat
kesimpulan) dari data pengamatan
C. Rumusan Masalah :
1. Bagaimana cara membedakan bakteri gram negatif dan
bakteri gram positif melalui praktikum pewarnaan
majemuk ?
2. Bagaimana hasil pengamatan praktikum pewarnaan
majemuk?
3. Bagaimana hasil akhir dari praktikum pewarnaan
majemuk?
D. Dasar Teori
Pewarnaan majemuk ini digunakan lebihn dari satu macam bahan ca. Deangan
cara ini bahan-bahan ncat yang dipakai ada kalanya terpisah dan ada kalanya tercampur
dan digunkan dalam satu larutsan. Dau macan pengcetan yang terpenting dari golongan
ini adalah pengecetan gram dan pengecetan tahan asam. (koes irianto.2006 :60)
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil,  bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan
pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Bentuk bakteri bermacam – macam
yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai
dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal
ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu
bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar
& Chan, 2007). Tujuan dari perwarnaan gram yaitu untuk mempermudah proses
pengamatan dari bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam
serta luar sel bakteri, serta untuk melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan,
sehingga nantinya sifat fisik atau kima jazad dapat diketahui (Hadiutomo, 1990).
Metode Pewarnaan gram dilkukan untuk mengetahui morfologi dari bakteri, serta
membedakan bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif
akan berwarna ungu, jika dilihat dari mikroskop, itu karena bakteri gram positif dapat
menahan kompleks pewarna primer karbol gentian violet iodium sampai akhir prosedur
pewarnaan. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah jika dilihat di bawah mikroskop,
itu karena bakteri gram negatif kehilangan kompleks warna karbol gentian violetiodium
dengan proses pembilasan alkohol, kemudian yang terwarnai oleh pewarna tandingan air
fuksin. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya
Mycobacterium sp, karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga
digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaantersebut
sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau.
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif
ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan
komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan
hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif  pada umumnnya lebih tipis dari yang
dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih
tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan
bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau
permeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol gentian violet
dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain
yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua
golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh
lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif.
Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat
disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif
diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang
disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian
violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini
menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat
tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987)
Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana,dengan jumlah
peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki
 peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Membran bagian
luar pada dinding sel gram-negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang
terikat dengan lipid. Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan penyakit,spesies gram-
negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-positif.
Lipopolisakarida yang terdapat pada dinding sel bakteri gram negatif sering bersifat
toksik (racun), dan membran bagian luar membantu melindungi bakteri gram-negatfi
patogen melawawn sistem pertahanan inangnya. Lebih jauh, bakteri gram negatif
umumnya lebih resisten terhadap antibiotik dibandingkan dengan gram-positif karena
membran bagian luar itu mengahalangi masuknya obat-obatan (Campbell, 2003).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya
berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-
senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan
sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai
dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam
dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna
basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat
warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya
pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya
mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan
zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri
dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti: fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Prinsip dasar dari pewarnaan adalah
adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik
baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.
E. Alat dan Bahan
Tabel 1. Alat yang digunakan

No Nama alat Jumlah

1 Kaca slide 1
2 Bunsen 1
3 Mikroskop 1
4 Rak tabung 1
5 Tabung reaksi 1
6 Ose 1
7 Penjepit 1
8 Bak slide 1
 9 Slide dryer 1
10 Korek api 1

Tabel 2. Bahan yang digunakan

No Nama alat Jumlah

1 Biakan bakteri Secukupnya
2 Aquades Secukupnya
3 Lugol / iodine Secukupnya
4 Alcohol Secukupnya
5 Safranin Secukupnya
6 Air fuchsin Secukupnya
7 Sediaan suspense Secukupnya
F. Prosedur Kerja
Vidio 1

Kaca objek disterilkan didekatkan dengan Bunsen

Ose dipijarkan, lalu ambil sediaan 1-2 ose ditaruh di kaca objek

Ose dipijarkan kembali, lalu keringkan sediaan di suhu udara ruang, kemudian sterilkan

Tahap pewarnaan pertama tetes gentian violet pada kaca objek, Tunggu 1 menit lalu
bilas dengan air mengalir

Tahap pewarnaan kedua tetes lugol selama 1 menit, lalu bilas dengan air mengalir

Tahap pewarnaan ketiga dekolorisasi dengan mencelupkan alkohol selama 1 menit, lalu
bilas dengan air mengalir

Tahap pewarnaan terakhir tetes air fuchsin selama 1 menit, lalu bilas dengan air
mengalir

Keringkan kaca objek dengan dimiringkan diatas kertas saring, lalu kaca objek ditetesi
dengan oil imersi

Amati kaca objek tersebut menggunakan mikroskop

Vidio 2

Kaca objek disterilkan didekatkan dengan Bunsen

Ose dipijarkan, ambil setetes aquades menggunakan ose, letakkan pada kaca slide

Ose dipijarkan kembali, lalu sterilkan bakteri dengan cara digilirkan

Ambil biakan bakteri menggunakan ujung ose, letakkan pada kaca slide dengan
melingkar

Keringkan cetakan slide pada Bunsen dengan cara dilewat-lewatkan

Tahap pewarnaan pertama tetes Kristal violet menggunakan pipet tetes selama 1 menit,
lalu bilas dengan aquades

Tahap pewarnaan kedua tetes lugol selama 1 menit, lalu bilas dengan aquades

Tahap pewarnaan ketiga tetes alcohol selama 1 menit, lalu bilas dengan aquades

Tahap pewarnaan keempat tetes safranin selama 1 menit, lalu bilas dengan aquades

Lap kaca slide dengan pelan, lalu letakkan kaca slide pada slide dryer untuk dikeringkan

Terakhir amati dengan mikroskop

G. Hasil Pengamatan
Video 1

No Gambar pengamatan Keterangan

1 Perbesaran 100x dibawah
mikroskop pada bakteri
gram positif berbentuk
coccus mengikat warna
ungu.

2 Perbesaran 100x dibawah

mikroskop pada bakteri
gram positif berbentuk
basil atau batang mengikat
warna ungu.

3 Perbesaran 100x dibawah

mikroskop pada bakteri
gram negatif berbentuk
basil atau batang mengikat
warna merah.

4 Perbesaran 100x dibawah

mikroskop pada bakteri
gram negatif berbentuk
diplococcus mengikat
warna merah.
 Video 2

No Gambar Pengamatan Keterangan

.
1 Bakteri diplobasil, gram
positif.

H. Pembahasan
Pada gambar hasil pengamatan diatas ditunjukkan bahwa jenis bakteri gram
negatif akan mengikat warna merah yang berasal dari fuchsin dan jenis bakteri gram
positif akan mengikat warna ungu yang berasal dari gentian violet. Hal ini dapat terjadi
karena karena konsentrasi lipid dan ketebalan peptidoglikan pada dinding sel bakteri.
Pada sel Gram negatif, alkohol meningkatkan porositas dinding sel dengan melarutkan
lipid lapisan luar. Jadi kompleks Gentian violet dapat lebih mudah dihilangkan dari
lapisan peptidoglikan yang tidak tertaut silang dengan kuat. Oleh sebab itu, efek
pencucian alkohol menyebabkan pelepasan kompleks Gentian violet yang tidak terikat,
yang membuat sel-sel menjadi kehilangan warna atu tidak bewarna. Menurut Purwoko
(2007), bakteri Gram negatif yang ditandai dengan warna merah karena sifat dinding
selnya tidak memiliki afinitas kuat terhadap zat warna utama (Gentian violet) sehingga
kompleks tesebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat kemudian mengambil zat
warna kedua (Fuchsin) yang bewarna merah.
Bakteri Gram positif adalah adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna
violet dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal. Ciri – ciri bakteri Gram positif yaitu
homogen dan tebal (2080 nm) sebagian besar tersusun dari peptidoglikan sebagian lagi
terdiri dari polisakarida lain dan asam teikoat, bulat, batang atau filamen. Bakteri Gram
negatif adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna merah, dan memiliki lapisan
peptidoglikan yang tipis. Ciri - ciri bakteri gram negatif adalah memiliki dinding tidak
terlalu tebal (peptidoglikan) yang mengandungasam tekoat, menghasilkan toksin bersifat
endotoksin, dan tidak resisten terhadap pinisillin [ CITATION Kar08 \l 1033 ].
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai
 dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel
berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, poripori
dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap
menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu
dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek [CITATION Per17 \l 1033 ].
I. Kesimpulan
Jenis bakteri gram negatif akan mengikat warna merah yang berasal dari fuchsin
dan jenis bakteri gram positif akan mengikat warna ungu yang berasal dari gentian violet.
Hal ini dapat terjadi karena karena konsentrasi lipid dan ketebalan peptidoglikan pada
dinding sel bakteri. Pada sel Gram negatif, alkohol meningkatkan porositas dinding sel
dengan melarutkan lipid lapisan luar. Jadi kompleks Gentian violet dapat lebih mudah
dihilangkan dari lapisan peptidoglikan yang tidak tertaut silang dengan kuat. Oleh sebab
itu, efek pencucian alkohol menyebabkan pelepasan kompleks Gentian violet yang tidak
terikat, yang membuat sel-sel menjadi kehilangan warna atu tidak bewarna. Menurut
Purwoko (2007), bakteri Gram negatif yang ditandai dengan warna merah karena sifat
dinding selnya tidak memiliki afinitas kuat terhadap zat warna utama (Gentian violet)
sehingga kompleks tesebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat kemudian
mengambil zat warna kedua (Fuchsin) yang bewarna merah.
J. Daftar Pustaka
Campbell, N.A., Reece, J.B., & Mitchell, L.G. (2003). Biologi Jilid 2 Edisi Kelima Alih
Bahasa: Wasmen. Jakarta: Penerbit Erlangga.
Dwidjoseputro. 1994. Teknik Pembuatan Medium. Jakarta: Erlangga.
Hadiotomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia.
Irianto, Koes.2006, “Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid I” Bandung :
Irama Widia
Judoamidjojo, Muljono. 1991. Teknologi Fermentasi. Bogor: IPB.
Karmana. (2008). Biologi. Jakarta: PT. Grafindo Media Pratama.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book
Company: New York.
Pertiwi. (2017). Identifikasi Mikroba Metode Pewarnaan Gram. Jurnal Praktikum
Mikrobiologi, 2-7.
Purwoko, Tjahjadi. (2007). Fisiologi Mikroba. Jakarta : Bumi Aksara
Razali, U.1987. Mikrobiologi Dasar. Jatinangor: FMIPA UNPAD.
Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang: Universitas Muhammadiyah.