A.

TOPIK
Pewarnaan Gram dan Pengukuran Sel Bakteri
B. TUJUAN
1. Memperoleh keterampilan pewarnaan bakteri secara gram.
2. Dapat menentukan sifat gram dari bakteri yang diperiksa.
3. Memperoleh ketrampilan menera skala mikrometer okuler.
4. Mengukur sel bakteri.
C. DASAR TEORI
Bakteri dibagi menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram
negatif.Pembagian kelompok ini didasarkan teknik pewarnaan diderensial yang
disebut pewarnaan gram. Kedua kelompok ini berbeda terutama dalam dinding
selnya (Volk & Wheeler, 1988).
1

Bakteri Gram Positif

Dinding sel organisme gram positif cukup tebal (20-80 nm) dan terdiri atas
60-100 % peptidoglikan. Semua sel gram positif memiliki pi]olimer lurus asam
N-asetilmuramat dan N-asetilglukosamin, namun ada varian dalam panjang
dann komposisi jembatan peptida yang mengaitkan silang tetrapeptida dari satu
asam N-asetilmuramat dengan polimer yang ada disampingnya. Beberapa
organisme gram positif juga mengandung substansi dinding sel yang disebut
asam

teikoat

yang

dikaitkan

pada

asam

muramat

dari

lapisan

peptidoglikan.Asam teikoat berwujud dalam dalam dua bentuk utama, yaitu

asam teikoat ribito, dan asam teikoat gliserol.Disamping asam teikoat yang
terikat pada peptidoglikan (yang tidak terdapat pada semua bakteri gram
positif), semua bakteri gram positif mengandung asam teikoat yang terikat
2

pada membran sel.

Bakteri Gram Negatif
Dinding sel bakteri gram negatif mempunyai susunan kimia yang lebih
rumit dari pada bakteri gram positif.Sebagai contoh, dinding sel gram negatif
mengandung lebih sedikit peptidoglikan (10-20% bobot kering dinding sel),
tetapi diluar lapisan peptidoglikan, ada struktur membran kedua yang
tersusun dari protein fosfolipida dan lipopolisakarida (asam lemak yang
dirangkai dengan polisakarida.Komponen lipopolisakarida dinding sel bakteri
ini sangat penting karena toksisitasnya pada hewan. Bakteri yang temasuk
gram negatif adalah Enterobactericeae, Salmonella sp, Shigella sp, E. Coli, dan
lain-lain.

Baik pada bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif, dinding sel
tidak meyerap cukup zat warna dasar yang umum.Pewarnaan sel bakteri secara
gram merupakan salah satu proseedur yang penting dan paling banyak digunakan
dalam klasifikasi bakteri (Hastuti, 2012). Adapun hasil perubahan warna bakteri
oleh pewarnaan gram yaitu :
1
2

Bakteri gram positif, akan berwarna ungu pada akhir pewarnaan.

Bakteri gram negatif, akan berwarna merah pada akhir pewarnaan.

Mikroorganisme

membutuhkan

suatu

medium

atau

substrat

untuk

pertumbuhannya (Hastuti, 2012).Medium tersebut ialah bahan yang digunakan

untuk menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya. Meskipun
persyaratan nutrien mikroorganisme amat beragam, namun sebagai makhluk
hidup mereka mempunyai kebutuhan dasar yang sama, yaitu meliputi karbon,
energi, mineral dan faktor tumbuh. Bagi organisme bersel tunggal, air sangat
dibutuhkan karena air merupakan komponen utama protoplasma (70-85)%
protoplasma terdiri dari air) serta sebagai media untuk masuknya nutrien ke
dalam sel dan keluarnya sekresi ataupun ekresi dari dalam sel. Disamping itu, air
juga diperlukan untuk berlangsungnya reaksi-reaksi enzimatik didalam sel.
Sumber Nitrogen dapat diperoleh dari senyawa organik juga dapat berasal dari
unsur logam seperti natrium, kalium, kalsium, magnesium, mangan, besi, seng,
tembaga, fosfor, dan kobalt. Bakteri membutuhkannya dalam jumlah yang sedikit
(Hadioetomo, 1990).
Bentuk tubuh bakteri itu terpengaruhi oleh keadaan medium dan oleh usia.
Maka untuk membandingkan bentuk serta ukuran sel bakteri perlu diperhatikan
bahwa kondisi bakteri itu harus sama, temperatur dimana piaraan itu disimpan
harus sama, penyinaran oleh sumber cahaya apapun harus sama, dan usia piaraan
itu juga harus sama. Pada umumnya, bakteri dari piaraan yang masih muda, yaitu
sekitar 6 sampai 12 jam, itu nampak lebih besar daripada bakteri berasal dari
koloni yang lebih tua (Dwidjoseputro. 1978). Sel bakteri sangat beragam
panjangnya; sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada
sel spesies yang lain. Satuan ukuran bakteri adalah mikrometer (m), yang setara
dengan 1/1000 mm atau 10-3 mm. Bakteri yang paling umum dipelajari di dalam

praktikum mikrobiologi berukuran kira-kira 1,0 x 2,0-5,0 m. Bentuk batang

yang berukuran rata-rata seperti bakteri tifoid dan disentri mempunyai lebar 0,5
sampai 1 m dan panjang 2 sampai 3 m. Sel beberapa spesies bakteri amat
panjang; panjangnya dapat melebihi 100 m dan diameternya berkisar dari 0,1
sampai 0,2 m.
Pengukuran yang tepat sel mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara
menyisipkan suatu mikrometer okuler pada lensa okuler mikroskop yang
digunakan untuk mengamati sel tersebut. Mikrometer okuler pada umumnya
merupakan suatu piringan kaca bundar pada salah satu permukaannya terukir
skala pengukuran. Sebelum digunakan untuk mengukur sel, mikrometer okuler ini
terlebih dahulu harus ditera terhadap mikrometer pentas yang sudah memiliki
skala yang pasti (Hadioetomo. 1985)

D. ALAT DAN BAHAN

a. Pewarnaan Gram
1. Mikroskop
2. Kaca benda
3. Mangkuk pewarna
4. Kawat penyangga
5. Aquades steril
6. Biakan murni bakteri umur 1 x 24 jam
7. Larutan Ammonium Oksalat Kristal Violet
8. Kertas penghisap
9. Korek api
10. Alkohol 70%
b.

Pengukuran Sel Bakteri

1. Mikroskop
2. Micrometer okuler (ocular micrometer)
3. Sediaan bakteri yang telah diwarnai secara gram
4. Kertas penghisap
5. Kertas lensa
6. Minyak emersi
E. LANGKAH KERJA
a. Pewarnaan Gram

MMeennytdsikaaknnsetacsbaeqnudadeysntgrbielrdsiha,tlaskuamcelbewnadtaktenrsdibautt.snyal mpus irtus.

SMeeclaarkusaenptfiikksmaeindgeanmgbailcnorakumlemlwbaaktkternisyeadniganktaenrsdibpuetrdkisaa,tlsnuymaleltpaiklamnpduisatirstuestdseanngaqucaedpeasti.tu.Kemudianmeratknperlahn-lahnda menu g usampikerng.
MMeelmtbaukangnkseeldibaihnandizattwskaranwtteprsenbyuatkgeadaylnmgbearnagdkuiadtansmmaengbkiulaspeewdiaarnn.dLelugamnenirtksakna.nlrutanAmoniumOksaltKristalVioletdiats ediantersbut.
MMeenmbtusaknagnklelrubtaihnainodlurumtadniiaotdsumedkieadnalitum,laaunmgkeunudganumseambpilias2medeinait.nde gan irkan.
MMeenmbtusaknagnsilkaohlkolh95l%itudikaetdsalemdianan,gmkeu bdiaanrkmneseblailmas1edmiaennit.degan irkan.
MMeenmbtusaknagnklelrubtaihnaSnlfrrauntiandsafrtansiedtiuakne,dmaelmbiarakngnksuel,almau1mmeenbiti.lasdenga irkan
M e n g ri n g k a n s e d i a n d e g a n h t i- a d e n g a k e r t a s p e n g i s a p , l u m e r ik s a d i b a w h m i k ro s p
b. Pengukuran Sel Bakteri

MMee n g a tku r p oasni j a ns ge l- s e l bt a uk tde rai ms e ht einr gs e al db ae lr amd a m p ialdma eb tidra, nb ge rsdk asl r k a n h a r g a tia p s k a l m ik r o m e t r o k u l e r
my aink gr otm lea th rd iotke ru al.e r
F. HASIL PENGAMATAN
a. Pewarnaan Gram
Aspek yang diamati

Warna

Koloni I
Merah
(bakteri

Koloni II
gram Merah (bakteri gram

negatif), fosfolipid sedikit, negatif),

peptidoglikan banyak

sedikit,

fosfolipid
peptidoglikan

banyak
b. Pengukuran sel bakteri
Aspek yang diamati
Ukuran

Koloni I
Skala okuler= 7
Perbesaran= 1000x
Panjang bakteri= 7 m

Koloni II
Skala okuler= 4
Perbesaran= 1000x
Panjang bakteri= 4 m

G. ANALISIS DATA
Pengamatan pewarnaan gram yang dilakukan adalah kaca benda bersih
dilewatkan diatas nyala api lampu spiritus (bunsen), di atas kaca benda ditetesi
setetes aquadest steril, bakteri yang akan diperiksa diambil dengan jarum
inokulum lalu diletakkan di atas aquadest lalu diratakan secara perlahan-lahan dan
ditunggu sampai kering, pada sediaan tersebut dilakukan fiksasi dengan
dilewatkan di atas nyala api spiritus (bunsen) dengan cepat, fiksasi dilakukan
untuk mematikan bakteri, melekatkan pada kaca benda dan agar tidak mengubah
bentuk dari bakteri.

Sediaan diletakkan di atas kawat penyangga yang berada di atas mangkuk

pewarna. Lalu diteteskan larutan ammonium oksalat kristal violet dan ditunggu
selama 1 menit, pemberian oksalat violet untuk memberikan warna ungu pada
kaca benda, kelebihan zat warna dibuang ke dalam mangkuk warna dan dibilas
dengan air kran, larutan Iodium diteteskan di atas sediaan dan ditunggu selama 2
menit, pemberian iodium berfungsi untuk menguatkan warna yang telah diberikan
sebelumnya. Kelebihan larutan Iodium dibuang ke dalam mangkuk dan dibilas
dengan air kran, larutan alkohol 95% diteteskan di atas sediaan dan ditunggu
selama 1 menit, alkohol diberikan untuk melihat perubahan warna yang
menunjukkan adanya peptidoglikan, apabila tidak terdapat peptidoglikan maka
warna krisatal violet akan luruh begitu pula sebaliknya pada bakteri tersebut,
kelebihan larutan alcohol dibuang ke dalam mangkuk dan dibilas dengan air kran,
larutan Safranin diteteskan di atas sediaan dan ditunggu selama 30 detik, safranin
diberikan untuk melihat kandungan fosofolipid yang terkandung di dalamnya,
apbila fosfolipid sedikit maka bakteri tersebut tidak menyerap safranin, warna dari
safranin sendiri adalah warna merah. Kelebihan Safranin dibuang ke dalam
mangkuk dan dibilas dengan air kran, sediaan dikeringkan dengan hati-hati
dengan kertas penghisap lalu diamati di bawah mikroskop.
Hasil yang di dapatkan dari pengematan adalah koloni 1 berwarna merah
yang artinya bakteri gram negatif, fosfolipid yang terkandung sedikit dan
peptidoglikan banyak, sama halnya dengan koloni 2 yang merupakan bakteri gram
negatif dengan warna yang di dapatkan adalah merah.
Untuk pengukuran sel bakteri dilakukan dengan cara sediaan diperiksa di
bawah mikroskop yang telah dipasang skala lensa okuler, bakteri diukur dengan
skala yang yang terdapat di dalamnya dengan perbesaran 1000X, hasil skala
dikalikan dengan hasil teraan yang telah dilakukan sebelumnya. Hasil yang di
dapatkan dari pengamatan adalah koloni 1 ukuran sel bakteri panjangnya adalah
7m, dan untuk koloni 2 berukuran panjang 4 m. Untuk bentuk dari sel bakteri
tersebut adalah kedua koloni tersebut berbentuk batang.
H. PEMBAHASAN
a. Pewarnaan Gram

Pewarnaan

Gram

bertujuan

untuk

memudahkan

identifikasi

mikroorganisme, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri dan untuk melihat

struktur luar dan dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan,
2007). Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari dari pewarna yang disebut
kromagen. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram
negatif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Ammonium
Kristal violet (Volk dan Wheeler, 1993).
Proses pewarnaan gram, dilakukan pada kaca obyek yang bersih. Setelah
dicuci kaca obyek diberi satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Setelah
aseptik, inokulum bakteri yang akan diperiksa diletakkan diatas aquades.
Pengambilan inokulum bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu
banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipistipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan
bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas
nyala api sebanyak tiga kali. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar
melekat pada kaca obyek, membunuh bakteri, melepaskan granula protein
menjadi gugusan reaktif (NH3+), membuat sel lebih kuat, mencegah terjadinya
otolitas sel, serta mengubah avinitas (Pelczar & Chan, 2007).
Setelah fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan Amonium Oksalat Kristal
Violet dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir.
Larutan Amonium Oksalat Kristal Violet ini merupakan pewarna utama.
Kemudian ditambahkan larutan iodium yang merupakan cat mordan.
Larutan iodium berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh
bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna
dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram,
penambahan larutan iodium menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks.
Tanpa penambahan larutan iodium, zat warna larutan Amonium Oksalat Kristal
Viole larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan selama 2 menit untuk
dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan
warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat) (Pelczar & Chan, 2007).

Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk

melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari
komplek larutan Amonium Oksalat Kristal Viole pada gram negatif, karena
mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan
warna ungu karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsi untuk
melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan
pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan larutan
Amonium Oksalat Kristal Viole (Pelczar & Chan, 2007). Perlakuan ini dilakukan
selama 1 menit lalu dibilas dengan aquades.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin sebanyak 2 tetes
dan didiamkan selama 30 detik.. Safranin ini berwarna merah yang merupakan cat
sekunder atau kontras.
mikroorganisme non target.

Cat ini berfungsi untuk memberikan warna

Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang

berbeda dari cat primer. Safranin tidak akan menyebabkan perubahan warna pada
bakteri positif karena persenyawaan larutan Amonium Oksalat Kristal Viole tetap
terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan
menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna ungu yang
dihasilkan oleh larutan Amonium Oksalat Kristal Viole telah luntur dengan
lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, safranin atau
zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet
(Lay, 1994).

Kemudian dicuci dengan air mengalir. Kemudian preparat

dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah

mikroskop.
Setelah dilakukan pengamatan pada 2 koloni yang berbeda didapat hasil
warna sel bakteri pada koloni I adalah merah. Warna sel pada koloni 2 adalah
merah. Berdasarkan pernyataan Pelczar & Chan (2007), bakteri koloni I dan
bakteri koloni II adalah adalah gram negatif karena kehilangan zat warna kristal
violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya
yaitu safranin akan tampak merah.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada
komponen dinding selnya. Dinding sel gram negatif lebih tipis dari gram positif,
presentasi kandungan lipid bakteri gram negatif lebih tinggi dari gram positif,
sehingga setelah pewarnaan kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel

dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat

lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol
memungkinkan hilang dari sel menyebabkan gram negatif terwarnakan. Selain itu
bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang
tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3
nm) sehingga kerapatan jalinan gram negatif lebih sedikit dari gram positif. Pori
pada peptidoglikan gram negatif masih cukup besar untuk mengeluarkan zat
warna kristal violet sehingga warna ungu pudar. Sedangkan pada gram positif
yang memiliki lapisan peptidoglikan dengan pori kecil, struktur ini yang
menyebabkan zat warna pertama yanitu kristal violet tetap bertahan.
b. Pengukuran Sel Bakteri
Pengukuran sel bakteri bertujuan untuk mengetahui ukuran bakteri
menggunakan mikroskop. Pada pengamatan ini mikroskop yang digunakan
berupa mikroskop cahaya. Saat pengukuran sel bakteri di laboratorium,
mikroskop yang kami gunakan adalah mikroskop nomor 10 dan mikrometer
nomor 4 yang telah dilakukan peneraan sebelumnya.
Mikroskop cahaya merupakan mikroskop yang umum digunakan di
laboratorium untuk mengamati berbagai jenis mikroba. Mikroskop ini mempunyai
2 perangkat lensa yaitu lensa okuler dan lensa obyektif dan menggunakan cahaya
sebagai sumber iluminasi. Dengan mikroskop cahaya bayangan benda dapat
diperbesar sampai 1000 kali dan dapat digunakan untuk memeriksa benda-benda
atau bagian-bagian dari sel yang berukuran lebih dari 200nm. Prinsip umum
mikroskop adalah bahwa makin pendek gelombang cahaya yang digunakan, maka
resoluinya makin besar (Tarigan, 1988).
Ukuran besar bacteria bervariasi, tergantung dari spesiesnya. Rata-rata
ukuran diameter dan panjang bakteri pathogen yang berbentuk batang kira-kira
0,5 m dan 2 m, sedangkan bakteri non pathogen yang berbentuk batang dapat
mencapai diameter 4 m dan panjangnya 20 m (Tarigan, 1988). Sedangkan
menurut Kusnadi (2003), bentuk dan ukuran sel bakteri bervariasi, ukurannya
berkisar 0,4 2,0 mm. Bentuk sel bakteri dapat terlihat di bawah mikroskop
cahaya, dapat berbentuk kokus (bulat), basil (batang), dan spiral.
Pengukuran bakteri dilakukan dengan cara mengukur panjang sel dalam
milimeter, berdasarkan harga tiap skala mikrometer okuler yang telah ditera.

Berdasarkan pengukuran sel bakteri yang telah dilakukan didapatkan pada koloni
bakteri 1, panjangnya 7 mm setelah ditera panjangnya 7 m. Pada koloni bakteri
2, panjang sel bakteri 4 mm setelah ditera panjangnya adalah 4 m . Pengukuran
ini menggunakan perbesaran 1000x sehingga membutuhkan minyak emersi untuk
menurunkan indeks bias. Bakteri dari koloni 1 dan 2 sama-sama berbentuk basil
(batang).
I. KESIMPULAN
1. Pewarnaan bakteri secara gram bertujuan untuk memudahkan identifikasi
mikroorganisme, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri dan untuk
melihat struktur luar dan dalam bakteri. Pewarnaan menggunakan kaca
benda yang disterilisasi, setelah menaruh koloni diatas kaca benda
dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan ammonium oksalat
kristal violet, larutan iodium, alkohol 95 % dan larutan safranin warna
merah.
2. Hasil pewarnaan gram dari koloni 1 dan 2 adalah gram negatif bersifat
dinding sel gram negatif lebih tipis, presentasi kandungan lipid bakteri
lebih tinggi, lapisan peptidoglikogennya tipis dan pori pada peptidoglikan
masih cukup besar.
3. Peneraan skala mikrometer okuler dilakukan dengan memasang kaca
benda yang telah ada skalanya dan memasang lensa okuler yang terdapat
skalanya. Peneraan dilakukan dengan membandingkan skala okuler dan
obyektif dengan perbesaran 10 kali, 40 kali, 100 kali dan 1000 kali.
4. Hasil dari pengukuran bakteri dengan perbesaran 1000 kali dengan bentuk
bakteri basil adalah koloni bakteri 1, panjangnya 7 mm setelah ditera
panjangnya 7 m. Pada koloni bakteri 2, panjang sel bakteri 4 mm setelah
ditera panjangnya adalah 4 m.

DAFTAR RUJUKAN
Hadioetomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta :
Gramedia
Hastuti, Utami Sri. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Malang: UMMPress.
Kusnadi, dkk. 2003. Common textbook (Edisi revisi) Mikrobiologi. Bandung:
Universitas Pendidikan Indonesia.
Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada :
Jakarta.

Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book
Company: New York
Tarigan, Jeneng. 1988. Pengantar mikrobiologi. Jakarta: Depertemen Pendidikan
dan Kebudayaan- Proyek pengembangan lembaga pendidikan tenaga
kependidikan.
Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta

PEWARNAAN GRAM DAN PENGUKURAN SEL BAKTERI

LAPORAN PRAKTIKUM
Untuk Memenuhi Tugas Mata
Mikrobiologi
yang Dibimbing oleh Ibu Sitoresmi Prabaningtyas

Disusun oleh:

Kelompok 4 Kelas B
1.
2.
3.
4.
5.

Anton
Fitriatul Ummah
Ika Prastikasari
Indah Syafinatu Zafi
Intan Yunanda

(120341410321)
(140341606221)
(14034160
)
(140341601596)
(140341600448)

The Learning University

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
Februari 2016

LAMPIRAN

Proses pewarnaan gram

Hasil pewarnaan gram yaitu gram

negatif

Proses pengukuran sel bakteri

yang berbentuk bassil