PERCOBAAN III

PEWARNAAN DAN IDENTIFIKASI INOKULASI CENDAWAN

A. Tujuan
1. Mahasiswa dapat mengetahui langkah-langkah pewarnaan cendawan
2. Mahasiswa dapat mengidentifikasi morfologi spora cendawan

B. Dasar teori
Menurut (Waluyo, 2007: 56-59), pewarnaan khusus adalah pewarnaan yang
digunakan untuk melihat salah satu struktur sel. Ada beberapa macam metode
pewarnaan, yakni:
1. Pewarnaan spora
Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan panas dan tahan bahan
kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan
yang tidak menguntungkan bagi bakteri tersebut. Contoh-contoh bakteri
pembentuk spora adalah Bacillus, Clostridium, Thermoactinomycetes,
Sporosarcina, dan lain-lain. Lapisan bagian luar spora merupakan lapisan
penahan yang baik terhadap bahan kimia, sehingga spora sulit diwarnai.
Spora bakteri pada dapat diwarnai dengan cara dipanaskan. Pemanasan ini
menyebabkan lapisan luar spora mengembang sehingga zat warna dapat
masuk. Bahan yang digunakan untuk pewarnaan spora dapat memakai
larutan hijau malakhit dan larutan safranin. Secara teknis laboratoris
dibicarakan dalam prosedur praktikum.
2. Pewarnaan kapsula
Kapsula merupakan lapisan yang melekat diluar dinding sel yang terdiri
dari polisakarida atau polipetida dengan ketebalan 1-2 . Kapsula
berfungsi untuk melekatkan diri pada permukaan dan melindungi bakteri
terhadap sel-sel fagosit. Lapisan kapsul cukup tebal, sehingga dapat dilihat
dengan mikroskop cahaya, namun demikian sulit diwarnai sehingga perlu
diberi pewarnaan khusus. Pada pewarnaan negatif, latar belakangnya yang
 2

diwarnai zat warna negatif, sedangkan bakterinya diwarnai dengan zat

warna basa. Kapsula tidak menyerap warna sehingga terlihat lapisan terang-
tembus dengan latar belakang yang bewarna. Salah satu cara pewarnaan
kapsula menurut Raebiger. Cara ini dengan menggunakan larutan formol-
gentian violet Raebiger.
3. Pewarnaan flagela
Flagela merupakan salah satu struktur yang digunakan bakteri untuk
bergerak. Ketebalan flagela sekitar 0,025 sehingga sulit terlihat oleh
mikroskop cahaya. Penataan flagela merupakan ciri bakteri yang digunakan
dalam identifikasi. Untuk melihat flagel digunakan cara khusus.
Penambahan bahan kimia berupa larutan mordan yang berguna untuk
membengkakkan flagela sehingga dapat dilihat dengan mikroskop cahaya.
4. Pewarnaan badan inklusi
Beberapa bakteri dapat mensintesis badan inklusi atau granula yang
disimpan dalam sitoplasma. Granula ini merupakan cadangan bahan
makanan dan merupakan sumber karbon dan energi yang siap pakai. Dalam
sel bakteri badan inklusi berupa granula metakromatik, asam poli-beta-
hidroksibutirat, pati, dan glikogen. Granula metakromatik merupakan
polimer fosfat yang ditemukan pada beberapa bakteri. Polimer fosfat ini
merupakan cadangan makanan yang mengandung fosfat untuk proses
biosintesis. Granula metakromatik adalah cara sel bakteri menyimpan
kelebihan ion fosfat dalam sel dan hal ini sering ditemukan pada genus
Bacillus dan Corynebacterium. Granula ini dapat digunakan sebagai ciri
untuk identifikasi. Granula ini dapat diwarnai dengan larutan biru-toluidin
1% sedangkan pencucian dengan larutan H2SO4. Larutan lugol diberikan
untuk meningkatkan aafinitas zat warna, sedangkan zat warna pembeda
adalah eosin Y 1%. Pewarnaan ini menyebabkan granula bewarna hitam dan
sitoplasma bearna merah muda.
Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, ini akan mempersulit
untuk dilihat atau diteliti sekalipun dibawah mikroskop. Hal tersebut
disebabkan karena banyak mikroba yang tidak mempunyai zat warna,
 3

seperti umumnya yang didapatkan pada bakteri. Berbeda dengan mikroalga

yang jelas mempunyai butir-butir atau serat warna dalam selnya. Bakteri
yang masih hidup tidak nampak jelas bentuk maupun sifat-sifat morfologi
lainnya. Bakteri tunggal, yaitu yang berupa satu sel saja hanya kelihatan
bening saja, walaupun bakteri itu diambilkan dari suatu koloni tertentu. Oleh
karena itu, untuk memperlihatkan bagian-bagian sel diperlukan pewarnaan.
Untuk memperlihatkan inti atau bahan inti ada pewarnaan sendiri, untuk
melihat flagel ada cara lain lagi, demikian pula untuk melihat spora ada cara
yang khusus untuk itu saja. Misalnya, pewarnaan inti disebut juga
pewarnaan secara Feulgen. Pewarnaan yang lain adalah cara Giemsa,
pewarnaan secara Gram, secara Neisser, dan masih banyak lagi.
Mikroorganisme sangat sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengadsorbsi atau mebiaskan cahaya. Dengan alasan inilah yang
menyebabkan zat warna yang digunakan untuk mewarnai mikroorganisme
tesebut terlihat kontras dengan sekelilingnya (Waluyo, 2007: 55-56).
Menurut (Subandi, 2012: 186-189), dalam pewarnaan gram digunakan 4 zat
kimia yang berbeda, bahan-bahan kimia tersebut adalah:
1. Zat warna primer, yaitu kristal violet berfungsi sebagai zat warna primer dan
memberikan warna pada seluruh bagian sel berwarna biru ungu.
2. Mordan yaitu Iodin gram. Zat ini berperan sebagai mordan, yaitu zat kimia
yang membentuk komplek yang tidak larut dengan mengikat zat warna
primer. Hasilnya adalah komplek kristal violet-iodin (CV-I) yang berfungsi
mengintesifkan warna zat warna primer sehingga seluruh sel akan tampak
ungu-gelap. Pada sel bakteri gram-positif, komplek CV-I akan terikat pada
asam ribonukleat-magnesium yang merupakan komponen dinding sel dan
membentuk kompleks asam ribonukleat-magnesium-kristal violet-iodin
(Mg-RNA-CV-I) yang sifatnya sangat sulit dipisahkan/dihilangkan
warnanya.
3. Zat Decolourizing, yaitu etil alkohol dengan konsentrasi 95%. Zat itu
berperan ganda sebagai pelarut lipida dan sebagai zat dehidrasi protein
 4

Efektif-perannya bergantung pada konsentrasi lipida dari dinding sel

mikroorganisme.
4. Lawan-warna (Counterstain), yaitu safranin. Zat ini merupakan zat kimia
terakhir yang digunakan untuk mewarnai sel yang telah kehilangna
warnanya oleh alkohol. Karena hanya pada sel gram-negatif yang
mengalami kelenturan warnanya, maka gram-negatif itu yang akan
menerima zat warna safranin, sedangkan sel bakteri gram-positif akan tetap
bewarna seperti zat warna primer.

Gambar 1: Pewarnaan (Subandi, 2012: 188)

Pewarnaan gram/diferensial memerlukan penggunaan sekurang-
kurangnya 3 macam reagen bahan kimia yang dipakai pada film bakteri
yang sudah difiksasi. Zat kimia pertama disebut zat warna utama. Fungsi zat
warna ini adalah untuk memberikan warna pada semua sel bakteri. Agar
diperoleh warna yang kontras, zat kimia kedua yang dipakai adalah zat
penghilang warna (decolourizing agent). Berdasarkan komposisi kimia
komponen sel bakteri, makan zat kimia yang ke-2 tersebut dapat atau tidak
dapat menghilangkan zat warna yang pertama dari semua bagian sel atau
hanya dapat menghilangkan zat warna dari bagian sel tertentu dalm struktur
bakteri. Zat kimia yang terakhir, yaitu lawan warna (counterstain) memiliki
sifat warna yang kontras dengan zat warna yang ke-2 (decolourization), jika
 5

zat warna yang pertama tidak tercuci, maka zat warna kedua (counterstain)
tidak dapat diabsorbsi dan sel bakteri atau komponen sel akan tetap
berwarna seperti zat pewarna yang pertama. Akan tetapi, apabila zat
pewarna yang pertama tercuci oleh zat kimia yang ke-2, maka sel bakteri
atau komponen sel akan menerima dari warna dari zat warna kedua (zat
kimia ke-3/couterstain). Dengan cara ini, tipe sell atau struktur sel dapat
saling dibedakan berdasarkan zat warna yang diterima (Subandi,2012:185-
186).

Karena demikian sensitifnya perubahan kimiawi yang terjadi, maka terdapat

titik kritis yang perlu diperhatikan agar diperoleh hasil yang akurat dalam
interpretasi hasil pengecatan. Titik kritis tersebut adalah pada saat pelunturan
warna dengan alkohol. Pelunturan yang terlalu intensif (terlalu lama atau
terlalu deras pemakaian alkoholnya) dapat menyebabkan sel gram-positif
kehilangan warna primernya yang seharusnya dapat diperhatikan, sehingga
pada saat diwarnai dangan zat warna ke-2 , sel gram-positif tersebut justru
dapat menerima warna ke-2. Demikian juga terjadi pada sel gram-negatif
(Subandi, 2012: 188).
 6

C. Alat dan Bahan

1. Alat
a. Penutup kaca objek 3 Buah
b. Mikroskop 1 Unit
c. Kaca objek 1 Buah
d. Jarum pentul 2 Buah
e. Spidol 1 Buah
2. Bahan
a. Lactophenol blue solution
b. Media Saboutaud Dextrose Agar (SDA)
c. Tissue
D. Prosedur Kerja
1. Kaca objek dibersihkan dengan air lalu dikeringkan dengan tissue
2. Kaca objek diberi lingkaran pada bagian bawah kaca objek sebagai
pembeda bagian atas dan bawah
3. Kaca objek ditetesi dengan Lactophenol Blue Solution dengan
menggunakan pipet tetes
4. Hifa cendawan diambil dengan menggunakan jarum pentul lalu diletakkan
pada kaca objek
5. Spora cendawan disebar secara merata dengan mengguakan jarum pentul
6. Kaca objek ditutup dengan kaca penutup dengan kemiringan 45
7. Spora cendawan diamati dengan mikroskop menggunakan perbesaran
lemah hingga perbesaran kuat
8. Bagian-bagian yang terlihat pada spora cendawan diamati dan diberi
keterangan
 7

E. Hasil Pengamatan

No Gambar Keterangan

Preparat metode
1
tuang 10-1

Preparat metode
2
tuang 10-2

Preparat metode
3
tuang 10-3
 8

Preparat metode
4
gores cawan 1

Preparat metode
5
gores cawan 2

Pada pengamatan
preparat metode
tuang 10-1
ditemukan
6 bakteri berbentuk
coccus dan
termasuk dalam
bakteri gram
negatif
Pada pengamatan
preparat metode
tuang 10-2
ditemukan
7 bakteri berbentuk
coccus dan
termasuk dalam
bakteri gram
negatif
Pada pengamatan
preparat metode
tuang 10-3
ditemukan
8 bakteri berbentuk
coccus dan
termasuk dalam
bakteri gram
negatif
 9

Pada pengamatan
preparat metode
gores cawan 1
ditemukan
9 bakteri berbentuk
coccus dan basil
yang termasuk
dalam bakteri
gram negatif
Pada pengamatan
preparat metode
gores cawan 2
ditemukan
10 bakteri berbentuk
coccus dan
termasuk dalam
bakteri gram
negatif