LAPORAN PRATIKUM BAKTERIOLOGI

Pewarnaan Gram dan Pewarnaan Sederhana Bakteri

Dibuat untuk memenuhi tugas

Mata Kuliah : Bakteriologi

Dosen Pengampu :
Husjain Djajaningrat, SKM, Mkes

Disusun oleh :
Widi Dwi Kuncoro P3.73.34.2.21.051

POLTEKKES KEMENKES JAKARTA III

D-IV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
TAHUN AKADEMIK 2022/2023
 I. Judul Laporan
Pewarnaan Gram dan Pewarnaan Sederhana Bakteri

II. Hari/Tanggal
Hari/Tanggal : Jum’at/25 Maret 2022
Pukul : 13.00 s.d. 17.00 WIB
Tempat : Laboratorium Kimia II, lantai 4, Gedung Soerodo, Poltekkes Jakarta III

III. Tujuan
1. Dapat membedakan gram positif dengan gram negative
2. mengetahui morfologi, ukuran, dan stuktur-struktur bakteri

IV. Landasan Teori dan Prinsip Dasar

1. Pewarnaan Sederhana

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur
pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru
metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat
warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan
adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994).Prosedur Pewarnaan sederhana mudah
dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan
penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentuk yang bulat
(coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat
penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai
(streptococcus), buah anggur (stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus
yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994). Prinsip dasar dari pewarnaan ini
adalah adanya ikatan ion antarakomponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif
dari pewarna yangdisebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik
baik padakomponen seluler maupun pada pewarnanya.
2. Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi
nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938)
yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara
Pneumococcus dan bakteri Klebsiella Pneumonia(Karmana,2008).Pewarnaan gram
dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negatif, tergantung dari reaksi
dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristalviolet. Contoh dari bakteri gram positif
ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negatif
misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan
gram,misalnya Mycobacterium sp , karena dinding selnya mengandung banyaklipid,
sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada
pewarnaan tersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringanakan berwarna
hijau (James, 2002)

Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna dasar
(Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif terlihat berwarna
ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violetlebih kuat, sedangkan sel
Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah membesar
dan Kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol (Fardiaz, 1989).Pewarnaan
gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk membedakan bakteri
apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur dengan tetesan air steril pada
gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas obyek sehingga membentuk lapisan
tipis dan difiksasi. Dengan kristal violet olesan bakteri digenangi selama dua

menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan dikering anginkan. Diberi yodium
 selama dua menit, dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Selanjutnya
diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes sampai zat warna
ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikering anginkan.
Kemudian digenangi lagi dengan safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan dibiarkan
kering di udara. Warna merah pada olesan bakteri menujukkan bakteri gram negatif
dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram positif (Pelczar,2007).

V. Bahan dan Alat :

 Mikroskop
 Preparat
 Bunsen
 Korek api
 Tisu
 Rak Tabung
 NaCl 0,9%
 Aquades
 Gentian Violet
 Alkohol 70%
 Lugol
 Minyak emersi
 Safranin
 Bak pewarna
 Koloni Bakteri
 Pipet tetes
 Ose

VI. Sampel
Sampel yang di gunakan pada pemeriksaan adalah suspensi bakteri Staphylococcus
aureus.
VII. Cara kerja
1. Pewarnaan Sederhana
 Bersihkan kaca objek dengan kapas alkohol 70% kemudian di fiksasi di atas
Bunsen untuk menghilangkan lemak yang menempel pada kaca objek.
 Bakar ujung ose hingga berwarna merah membara, lalu dinginkan.
 Teteskan 3 ose NaCl pada preparat glass menggunakan jarum ose
 Pijarkan lagi jarum ose hingga berwarna merah membara, lalu dinginkan.
 Selanjutnya ambil bakteri dari media dengan cara aseptik lalu diratakkan di atas
kaca objek.
 Lalu bakar ose kembali untuk membunuh mikroorganisme yang masih tersisa
pada ose.
 Keringkan sediaan di udara, lalu fiksasi dengan dilewatkan diatas nyala Bunsen
sebanyak 3 kali berturut-turut
 Teteskan larutan zat warna (fuchsin) diatas sediaan lalu diamkan selama 2 menit
selanjutnya cuci dengan aquadest mengalir secara perlahan. lalu keringkan
preparat
 Amati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri dengan pembesaran
100x. Jangan lupa menggunakan minyak imersi kaca objek.

2. Pewarnaan Gram
 Bersihkan kaca objek dengan kapas alkohol 70% kemudian di fiksasi di atas
Bunsen untuk menghilangkan lemak yang menempel pada kaca objek.
 Ambil ose dan bakar ujung ose hingga berwarna merah membara, lalu
dinginkan.
 Teteskan 2-3 ose NaCl pada preparat glass menggunakan jarum ose.
 Pijarkan lagi jarum ose hingga berwarna merah membara, lalu dinginkan.
 Selanjutnya ambil bakteri dari media dengan cara aseptik lalu diratakan di atas
kaca objek.
 Lalu bakar ose kembali untuk membunuh mikroorganisme yang masih tersisa
pada ose.
  Keringkan sediaan di udara, lalu fiksasi dengan dilewatkan diatas nyala Bunsen
sebanyak 3 kali berturut-turut
 Teteskan zat warna Gentian Violet diatas sediaan lalu diamkan selama 1 menit.
Lalu bilas sediaan dengan aquadest mengalir secara perlahan.
 Teteskan lugol diatas sediaan lalu diamkan selama 1 menit. Bilas kembali
sediaan dengan aquadest mengalir secara perlahan.
 Teteskan Alkohol 70% diatas sediaan hingga warna unggu larut/pucat (luntur)
lalu bilas sediaan dengan aquadest mengalir secara perlahan.
 Teteskan fuchsin diatas sediaan lalu diamkan selama 2 menit. Bilas kembali
sediaan dengan aquadest mengalir secara perlahan dan keringkan dengan tissue.
 Amati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri dengan pembesaran
100x. Jangan lupa menggunakan minyak imersi kaca objek.

VIII. HASIL

Metode Gambar Keterangan

- Pengamatan perbesaran 100x
- Zat warna yang di gunakan : Gentian
Violet
- Zat penghilang : Alkohol
Sederhana
- Bakteri berbentuk Staphylococcus aerus
tampak bulat seperti coccus bergerombol,
dan tersusun seperti buah anggur
(Staphylococcus)
Gram - pengamatan perbesaran 100x
- Zat warna yang di gunakan :
• Zat warna primer : gentian violet
• Zat warna pengikat : lugol
• Penghilang warna : alkohol
• Zat warna sekunder : fuchsin
- Bentuk Staphylococcus aureus tampak
 seperti bulat (coccus), bergerombol, dan
tersusun seperti buah anggur
(Staphylococcus)
- Menghasilkan warna ungu dan termasuk
dalam golongan bakteri gram positif

IX. Pembahasan
Pewarnaan Sederhana

Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen, sehingga tidak berwarnadan hampir

tidak terlihat karena tidak kontras dengan media dimana mereka hidup. Oleh karena itu,
perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop.Pada
praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa pewarnaan sederhana. Pewarnaan
sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum digunakan. Berbagai macan tipe
morfologi bakteri seperticoccus, bacillus, dan sebagainya dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya menggunakan
satu macam zat warna saja.

Pewarnaan Gram

Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa pewarnaan gram.

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yangsangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam
langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya
lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak padamembran
sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram
positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan
membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang
berada di antara dua lapismembran sel.

Dari hasil pengamatan mikroskop sampel suspensi campuran bakteri E. coli dan
S. Aureus dapat teramati dengan ciri S. Aureus berbentuk coccusdengan warna violet
 yang menandakan bakteri tersebut bakteri gram positif,sedangkan E. coli berbentuk basil
dengan warna merah yang menandakan bakteri tersebut bakteri gram negatif. Pada
sampel yang kedua yaitu sampelsuspensi campuran bakteri E. coli dan  B. subfilis dapat
teramati dengan ciri bakteri B. subfilis berbentuk basil dengan warna violet yang
menandakan bakteri tersebut bakteri gram positif. Sedangkan bakteri E. coli sama
sepertisampel pertama.Beberapa perbedaan sifat yang terlihat antara bakteri gram positif
dan bakteri gram negatif yaitu bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan
zat warna violet sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini akan berwarna biru atau
violet di bawah mikroskop, sedangkan bakterigram negatif akan berwarna merah atau
merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini di dasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang
tebal di banding bakteri gram negatif sehingga bakteri gram positif dapat mempertahan
warna ungu

X. Kesimpulan

Dapat mengamati ukuran, bentuk dan struktur –  struktur tertentu dari bakteri,
yang menggunakan satu macam zat warna dengan hasil morfologi bakteri berbentuk
coccus dan pada perwarnaan gram Dapat mengamati dua kelompok bakteri yaitu gram
positif dan gram negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan gram, dengan
hasil bakteri S. Aureus dan bakteri B. subfilis sebagai bakteri gram positif, lalu bakteri E.
coli sebagai gram negatif. Dapat memahami setiap langkah dan reaksi –  reaksi kimia
yang terjadi dalam proses tersebut yang dapat di lihat dari pewarna yang bereaksi dengan
sel bakteri.

XI. Daftar Pustaka

Iman Firmansyah, (2015) Pewarnaan Gram,

https://www.academia.edu/11703944/Pewarnaan_Gram

Iman Firmansyah, (2015) Pewarnaan Sederhana

https://www.academia.edu/11704012/Pewarnaan_Sederhana
 Mengetahui

Jakarta, 29 april 2022

Dosen pembimbing Praktikan

Husjain Djajaningrat, SKM, Mkes Widi Dwi Kuncoro