PENGUJIAN SIFAT FISIOLOGI DAN BIOKIMIA MIKROBA

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

Oleh :
NOVERTA ASTRI TRISNANTA
191910601015
KELOMPOK 1

PROGRAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN

JURUSAN TEKNIK SIPIL
FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS JEMBER
2020
I. Judul: Pengujian Sifat Fisiologi dan Biokimia Mikroba

II. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah dapat mengetahui sifat fisiologi dan biokimia
mikroba, mampu melakukan beberapa uji fisiologi dan biokimia mikroba.

III. Metode Praktikum

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum percobaan ini antara lain, jarum ose,
lampu bunsen, gelas benda (obyek glass), gelas penutup (cover glass), mikroskop dan
botol semprot.

3.1.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum percobaan ini antara lain, biakan
bakteri umur 24 jam (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas fluorescens, dan Salmonella typhi), alkohol 70%, spiritus, larutan
pewarna kristal violet (Gram A), larutan yodium (Gram B), larutan alkohol 96%
(larutan pencuci/Gram C), larutan safranin (pewarna D), air steril.
3.2 Langkah Kerja
3.2.1 Pewarnaan Gram

Pewarnaan
Gram
 disiapkan mikroskop, biakan murni bakteri umur 24 jam, gelas benda,
gelas penutup
 dibuat suspensi bakteri dari biakan murni bakteri umur 24 jam.
 dicuci gelas benda dengan alkohol 70%. Ambil 1 loop jarum Ose
suspensi bakteri dan ratakan pada gelas benda kemudian fiksasi di atas
lampu Bunsen.
 diteteskan 2-3 tetes Gram A, diamkan selama 1 menit. Cuci
menggunakan air steril mengalir dan keringkan
 diteteskan 2-3 tetes Gram B, diamkan selama 1 menit. Cuci
menggunakan air steril mengalir dan keringkan
 diteteskan 2-3 tetes Gram C diamkan selama 30 detik. Cuci
menggunakan air steril mengalir dan keringkan
 diteteskan 2-3 tetes Gram D, diamkan selama 1 menit. Cuci
menggunakan air steril mengalir dan keringkan
 diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 x 100 (1000x)
 dilakukan cara kerja secara aseptik. Foto hasil pengamatan dan tempel
pada Tabel 7 atau catat hasilnya (bakteri berwarna ungu termasuk Gram
positif, bakteri berwarna merah termasuk Gram negatif).

Hasil
3.2.2 Uji KOH 3%

Uji KOH 3%

 disiapkan biakan murni bakteri umur 24 jam, gelas benda

 dicuci gelas benda dengan alkohol 70%
 diteteskan 2 tetes larutan KOH 3% pada gelas benda dan ambil 1 loop
jarum Ose koloni bakteri
 diaduk secara merata dengan jarum Ose dan angkat jarum Ose untuk
mengamati terbentuknya lendir)
 dilakukan cara kerja secara aseptik
 diamati, apabila terbentuk lendir mengindikasikan bakteri Gram negatif,
bila tidak terbentuk lendir mengindikasikan bakteri Gram positif
 difoto hasil pengamatan dan ditempel di tabel hasil

Hasil

3.2.3 Uji Katalase

Uji Katalase
 disiapkan biakan murni bakteri umur 24 jam, gelas benda
 dicuci gelas benda dengan alkohol 70%
 diteteskan 2 tetes H2O2 3% pada gelas benda yang bersih
 diambil 1 loop jarum Ose biakan bakteri, oleskan pada gelas benda yang
sudah ditetesi H2O2 3%
 dicampur suspensi secara perlahan menggunakan jarum Ose
 dilakukan cara kerja secara aseptik
 diamati hasil yang positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-
gelembung
 difoto hasil pengamatan dan tempel di tabel hasil

Hasil
IV. Hasil dan Pembahasan
4.1 Tabel Hasil
Pewarnaan Katalase
Uji Bentuk KOH
Gram (H2O2)
Terbentuk
Basil
Gelembung
Tidak
Bacillus subtilis +
Berlendir

Terbentuk
Kokus
Gelembung
Staphylococcus Tidak
+
aureus Berlendir

Terbentuk
Kokobasil
Gelembung
Escherichia coli - Berlendir

Terbentuk
Basil
Gelembung
Pseudomonas
- Berlendir
fluorescens
 Terbentuk
Basil
Gelembung
Salmonella typhi - Berlendir

4.2 Pembahasan
Mikroorganisme pada suatu lingkungan alami merupakan populasi campuran
dari berbagai jenis baik mikroorganisme pada air tanah, air, udara, makanan maupun
yang terdapat pada tumbuhan. Pemisahan bakteri diperlukan untuk mengetahui jenis,
mempelajari kultural, morfologi, fisiologi, dan karakteristik. Teknik pemisahan
tersebut disebut isolasi yang disertai dengan pemurnian. Pengertian isolasi bakteri
yaitu suatu proses mengambil bakteri dari medium atau dari lingkungan asalnya lalu
menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni
(Singleton & Saainsbury, 2006).
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengadsorbsi atau pun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat
warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme karena zat warna mengadsorbsi
dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme dengan lingkungannya
ditingkatkan. Karakterisasi merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan untuk
mengobservasi bakteri maupun kapang hasil isolasi (isolat). Kegiatan karakterisasi
dapat dilakukan berdasarkan sifat sitologi (bentuk sel, gerak atau motilitas, sifat Gram
dan endospora), sifat morfologi, dan sifat fisiologi. Uji sifat morfologi mencakup
sifat-sifat koloni, seperti ukuran, bentuk, warna dan tepian, sedangkan uji sifat
fisiologi diantaranya uji hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis protein dan uji
katalase (Subandi, 2009).
Mikroba merupakan organisme yang mempunyai sifat fisiologi dan biokimia
tertentu di dalam metabolismenya. Uji fisiologis dilakukan untuk mengetahui
kemampuan fisiologis bakteri Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi. Uji fisiologis biasanya identik
dengan uji biokimia. Sifat fisiologi bakteri mempelajari mekanisme dan sistematika
bakteri meliputi kebutuhan dasar, struktur bakteri, resproduksi, dan perubahan-
perubahan yang mungkin terjadi (Fallo, 2016).
Uji sifat fisiologi dan biokimia pada percobaan ini yaitu menggunakan uji
pewarnaan gram, uji KOH 3%, dan uji H2O2 3% atau uji katalase. Metode pewarnaan
gram dapat membedakan tipe dinding sel penyusun (warna) dan bentuk bakteri.
Pewarnaan Gram dan spora dapat dilakukan dalam uji sifat sitologi suatu bakteri.
Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna dasar
(Kristal violet) setelah pencucian alkohol 70%. Bakteri Gram positif terlihat berwarna
ungu karena dinding selnya mengikat kristal violet lebih kuat, sedangkan sel gram
negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah membesar dan
kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol. Pewarnaan spora dilakukan untuk
mengetahui ada atau tidaknya spora pada bakteri. Spora dapat terbentuk saat kondisi
tidak memungkinkan pertumbuhan bakteri. Spora juga mampu mengikat warna lebih
cepat dan sukar melepaskannya (Fardiaz, 2007).
Tahapan pewarnaan gram diawali dengan menyemprotkan alkohol 70% pada
gelas objek dan kemudian fiksasi di atas lampu Bunsen. Gelas objek yang sudah steril
ditetesi akuades, kemudian ambil 1 loop jarum Ose bulat suspensi bakteri dan ratakan
pada gelas benda dan fiksasi di atas lampu Bunsen. Kemudian diteteskan 2-3 tetes
larutan pewarna kristal violet (Gram A) dan diamkan selama 1 menit dan setelah itu
cuci menggunakan akuades dan keringkan. Jika sudah kering tetestkan lagi larutan
yodium (Gram B) dan diamkan selama 1 menit, cuci dengan akuades lalu keringkan.
Teteskan lagi dengan larutan alkohol 96% (larutan pencuci/Gram C) dan didiamkan
selama 30 detik lalu dicuci dengan akuades dan keringkan. Setelah itu teteskan lagi
dengan larutan safranin (pewarna D) diamkan 1 menit lalu cuci dengan akuades dan
keringkan. Amati hasilnya dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 x
100 (1000x), apabila bakteri berwarna ungu termasuk Gram positif, bakteri berwarna
merah termasuk Gram negatif.

Gambar 4.1 penambahan akuades Gambar 4.2 Pengambilan suspensi bakteri

`
Gambar 4.3 Pewarnaan gram Gambar 4.4 Pencucian dengan akuades
Larutan pewarna kristal violet (Gram A) merupakan pewarna primer (utama)
yang akan memberi warna mikroorganisme target. Fungsi Crystal Violet yaitu
bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat
asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna
(Ungu). Larutan yodium (Gram B) merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang
berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Fungsi
pemberian yodium pada pengecatan gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Larutan alkohol 96% (larutan pencuci/Gram C)
merupakan Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan
kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada
pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu
Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu dan bakteri menjadi tidak
berwarna. Larutan safranin (pewarna D) merupakan pewarna tandingan atau pewarna
sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan
pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain , memberikan
warna pada mikroorganisme non target.

Gambar 4.5 Bacillus subtilis Gambar 4.6 Staphylococcus aureus

Gambar 4.7 Escherichia coli Gambar 4.8 Pseudomonas fluorescens

Gambar 4.9 Streptococcus thermophiles

 Hasil pengamatan pewarnaan gram pada bakteri berbeda-beda. Bacillus subtilis
dan Staphylococcus aureus menghasilkan warna ungu kebiruan yang mana warna
tersebut menandakan bahwa Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus merupakan
bakteri gram positif. Bacillus subtilis menunjukan bentuk basil dan Staphylococcus
aureus bentuknya berupa kokus. Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, dan
Salmonella typhi setelah melakukan tahapan pewarnaan gram ketiga bakteri ini
menghasilkan warna merah. Warna merah ini menandakan bahwa Escherichia coli,
Pseudomonas fluorescens, dan Salmonella typhi merupakan gram negatif.
Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, dan Salmonella typhi memiliki bentuk
yang berturut-turut yaitu kokobasil, basil, dan basil.
Uji KOH 3% merupakan metode yang lebih mudah dan praktis dibanding
prosedur pewarnaan gram. Metode gram dengan pengujian KOH 3% merupakan
metode identifikasi bakteri yang baik dalam menentukan jenis dominan bakteri yang
aktif yang ditandai dengan adanya lendir. KOH akan menyerang lemak (bilayer
lipid) dan membuat sel bakteri Gram negatif pecah sedangkan Gram positif tidak
terpengaruh. Penentuan sifat gram dengan KOH 3% memiliki hasil yang sama
dengan pengujian pewarnaan gram. Pengujian KOH 3% pada bakteri
mengindikasikan bakteri gram (+) memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang
tipis sedangkan gram (-) berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di ruang
periplasma. KOH akan menyerang lemak (bilayer lipid) dan membuat sel gram (-)
pecah. Sel yang pecah akan melepaskan materi genetik (DNA) yang merupakan
substansi melimpah di dalam sel bakteri. Molekul DNA sangat panjang bersifat sticky
strings (menyerupai lendir, getah atau dapat berarti lengket) yang memberikan hasil
seperti lendir saat diangkat dengan jarum inokulum (Edwin, 2011).
Tahapan uji KOH 3% diawali dengan menyemprotkan alkohol 70% pada gelas
objek dan kemudian fiksasi di atas lampu Bunsen. Gelas objek yang sudah steril
ditetesi akuades, kemudian ambil 1 loop jarum Ose bulat suspensi bakteri dan ratakan
pada gelas benda dan fiksasi di atas lampu Bunsen. Teteskan 2 tetes larutan KOH 3%
pada gelas benda dan ambil 1 loop jarum Ose koloni bakteri. Aduk secara merata
dengan jarum Ose dan angkat jarum Ose untuk mengamati terbentuknya lendir. Bila
terbentuk lendir mengindikasikan bakteri Gram negatif, bila tidak terbentuk lendir
mengindikasikan bakteri Gram positif.
Hasil yang diperoleh dalam uji KOH 3% pada percobaan ini diperoleh bahwa
bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus menunjukkan bentuk tidak
berlendir, artinya tergolong gram positif yang mempunyai ciri, memiliki dinding sel
yang tebal dan lemak yang tipis. Sedangkan bakteri Escherichia coli , Pseudomonas
fluorescens, dan Streptococcus thermophilus menunjukkan bentuk berlendir yang
berarti tergolong gram negatif dengan ciri, memiliki lemak tebal dan berdinding sel
tipis yang berada di ruang periplasma.
Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri yang
diuji. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat memecah H2O2
menjadi H2O dan O2. Uji ini dengan langkah mengambil: 1 mata ose koloni dari
media BAP letakan pada objek glass yang steril, ratakan koloni jangan sampai
menumpuk, kemudian ditetesi dengan 1-2 tetes H2O2 3%, amati ada atau tidaknya
gelembung jika ada gelembung maka uji katalase positif sebaliknya jika tidak ada
gelembung maka uji katalase negative. Uji Katalase digunakan karena berdasarkan,
Bakteri pereduksi H2O2 menghasilkan enzim katalase yang mampu mengkatalis
reduksi H2O2 .
2H2O2 2H2O + O2
Parameter uji katalase yaitu ditandai dengan adanya gelembung, hasil (+)
terbentuk gelembung dan hasil (-) tidak terbentuk gelembung.
Tahapan uji katalase menggunakan H2O2 3% diawali dengan menyemprotkan
alkohol 70% pada gelas objek dan kemudian fiksasi di atas lampu Bunsen. Gelas
objek yang sudah steril ditetesi akuades, kemudian ambil 1 loop jarum Ose bulat
suspensi bakteri dan ratakan pada gelas benda dan fiksasi di atas lampu Bunsen.
Teteskan 2 tetes H2O2 3% pada gelas benda yang bersih. Ambil 1 loop jarum Ose
biakan bakteri, oleskan pada gelas benda yang sudah ditetesi H2O2 3%. Campur
suspensi secara perlahan menggunakan jarum Ose. Lakukan cara kerja secara aseptik.
Hasil yang positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung.
Hasil yang diperoleh pada uji katalase ini diperoleh data bahwa semua bakteri
(Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli , Pseudomonas
fluorescens, dan Streptococcus thermophilus) menunjukkan terbentuknya gelembung
yang berarti bahwa ada pembentukkan gas Oksigen (O2) sebagai hasil pemecahan
H2O2 oleh enzim katalase yang diproduksi oleh bakteri tersebut. Hal ini juga
menunjukkan bahwa ada pembentukkan gas Oksigen (O2) sebagai hasil pemecahan
H2O2 oleh enzim katalase yang diproduksi oleh bakteri tersebut.
V. Penutup
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang didapatkan dari percobaan Pengujian Sifat Fisiologi dan
Biokimia Mikroba ini adalah pada uji pewarnaan gram didapatkan hasil, bakteri
Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus menunjukkan warna biru keunguan yang
merupakan gram positif, sedangkan pada bakteri Escherichia coli , Pseudomonas
fluorescens, dan Streptococcus thermophilus menunjukkan warna merah yang
merupakan hasil gram negatif. Hasil yang diperoleh dalam uji KOH 3% diperoleh
bahwa bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus menunjukkan bentuk tidak
berlendir, artinya tergolong gram, sedangkan bakteri Escherichia coli , Pseudomonas
fluorescens, dan Streptococcus thermophilus menunjukkan bentuk berlendir yang
berarti tergolong gram negatif. Hasil yang diperoleh pada uji katalase ini diperoleh
data bahwa semua bakteri (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli
, Pseudomonas fluorescens, dan Streptococcus thermophilus) menunjukkan
terbentuknya gelembung yang berarti bahwa ada pembentukkan gas Oksigen (O2)
sebagai hasil pemecahan H2O2 oleh enzim katalase yang diproduksi oleh bakteri
tersebut.
5.2 Saran
Saran pada saat melakukan percobaan ini adalah melakukan praktikum dengan
lebih teliti dan hati-hati. Perbedaan yang ada dalam beberapa percobaan sangat di
harapkan ketika praktikum harus dalam keadaan steril. Hal tersebut dapat
mempengaruhi hasil percobaan sehingga bisa mendapatkan hasil yang akurat.
 DAFTAR PUSTAKA

Fallo. 2016. Isolasi dan Uji Biokimia Bakteri Selulolitik Asal Saluran Pencernaan

Rayap Pekerja (Macrotermes spp.). Jurnal Pendidikan Biologi, 27-29.

Farrdiaz Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Hardiansyah. 2020. Identifikasi Plant Growth Promoting Rhizobacteria pada Rizosfer

Bambu Duri dengan Gram KOH 3%. Agrotechnology, 41-46.

Singleton & Saainsbury. 2006. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology

3rd edition. England : Jhon Wiley and Sons, Sussex.

Subandi,U Mikrobiologi dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta. Wapedia

Mikrobiologi Dasar. Jatinangor: Fmipa Unpad.

 LAMPIRAN

Buku
Jurnal