ACARA IV IDENTIFIKASI BAKTERI : UJI MORFOLOGI KOLONI DAN MORFOLOGI SEL

A. TUJUAN 1. MORFOLOGI KOLONI Mengidentifikasi bermacam-macam bentuk morfologi koloni bakteri yang tumbuh dalam bermacam-macam media berdasarkan konsistensi media pertumbuhannya
2. MORFOLOGI SEL

Mengidentifikasi karakter morfologi sel individual yang meliputi : ada tidaknya flagela (sifat motilitas), bentuk dan rangkaian sel, ada tidaknya spora dan reaksi-reaksi sel bakteri terhadap pengecatan (sifat Gram dan acid fast) a. Gerakan bakteri Untuk melihat pergerakan bakteri di bawah mikroskop maupun pada media pertumbuhan b. Pengecatan bakteri Untuk mempelajari jenis-jenis pengecatan bakteri dan melihat bentuk sel, rangkaian sel, sifat gram (gram negatif dan gram positif), sifat tahan asam (acid fast dan non acid fast) dan ada tidaknya spora.

B. DASAR TEORI Bakteri merupakan mikrobia uniseluler yang termasuk dalam kelas Shizomycetes. Pada umumnya bakteri tersebar luas di alam. Ada yang hidup

bebas, bersifat saprofitik, parasit atau patogen pada manusia, binatang atau tumbuhan. Ada beberapa jenis bakteri yang bersifat fotosintetik. Ada tiga bentuk dasar bakteri yaitu bentuk bulat (coccus), batang (bacillus), dan melilit (spiral) (Irianto, 2007). Mikroorganisme merupakan jasad berukuran mikroskopis yang beraneka ragam bentuk dan jenisnya, punya sejumlah ciri yang perlu dipahami untuk mengadakan klasifikasi dan identifikasi. Ciri pokok mikroorganisme dapat dibedakan dalam beberapa kategori yaitu ciri morfologi, kultural, susunan kimia, metabolik, anigenik, patogenitas, dan ciri ekologis. Ciri-ciri mikroorganisme meliputi banyak hal yaitu, ukuran, struktur, pengatur sel, bentuk perkembangan, reaksi terhadap cat, motilitas, dan susunan flagella. Berbeda dengan ciri determinasi mengenai ciri morfologi ini butuh pemahaman tentang sel-sel individu dalam suatu kultur murni. Tubuh mikroorganisme sangat kecil dan ukurannya bisa dinyatakan dengan mikrometer. Suatu mikrometer sama dengan 0,001 mm atau kira-kira 0,0004 inch (Tarigan, 1988). Pengecatan adalah pewarnaan mikroba-mikroba dengan suatu cat (dye) yang mengutamakan struktur tertentu saja, misalnya bagian-bagian sel. Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengabsorbsi atau membiaskan cahay (Tarigan, 1988). Dalam mikrobiologi, dikenal beberapa cara pengecatan, yaitu : 1. Pengecatan sederhana (simple staining) Hanya menggunakan 1 macam zat warna untuk meningkatkan kontras antar mikroorganisme dan sekelilingnya. Zat warna yang biasanya digunakan zat warna basa seperti kristal violet, biru metylen, karbol fuksin basa, safranin atau hijau malakit, kadang digunakan juga zat warna negatiev dan zat warna asa,. Pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk, ukuran, penataan mikroorganisme. 2. Pengecatan differensial (differential staining)

Pengematana jelas tentang perbedaan antara sel bakteri / bagian sel bakteri. Bertujuan untuk mengetahui bagian-bagian sel bakteri terhadap cat dan mengetahui bagian-bagian sel bakteri yang tidak dapat diamati dengan pengecatan sederhana (Tarigan, 1988).

Mikrobia tidak punya ciri anatomi yang jelas, sehingga identifikasi bakteri didasarkan pada morfologi, sifat biakkan, dan sifat biokimia. Mikroorganise yang akan diisolasi dapat berupa biakan murni atau populasi campuran. Bila biakan tercemar, dilakukan pemurnian terlebih dahulu. Setelah didapat biakan murni dapat dilakukan serangkaian uji untuk memperoleh ciri morfologi dan biokimia isolat. Setiap uji yang dilakukan harus menggunakan kontrol untuk mengetahui apakah media serta reagens yang digunakan benar dan tepat. Rujukan yang dipakai dalam identifikasi adalah Bergeys Manual of Systematic Bacteriology yang didasarkan pada morfologi, sifat faali, dan sifat biokimia bakteri (Lay, 1994).

C. PROSEDUR KERJA 1. MORFOLOGI KOLONI

a. Morfologi Koloni Bakteri dalam Media Cair

Alat dan Bahan Media nutrien cair (NB) dalam tabung reaksi Jarum ose Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)

Skema Kerja

Siapkan media nutrien cair (NB) yang telah disterilkan. Inokulasikan secara aseptik biakan murni isolat bakteri tanah sludge dengan menggunakan ose (1-2 ose) pada media NB. Inkubasikan pada suhu kamar selama 24-48 jam. Amati pertumbuhan biakan bakteri pada permukaan media, kekeruhan, bau dan ada tidaknya endapan. Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri). Perhatian : pada saat pengamatan, dilarang melakukan penggojogan tabung! Tentukan karakter bakteri tersebut berdasarkan kebutuhannya akan O2 (aerob, fakultatif anaerob, anaerob).

b. Morfologi Koloni Bakteri dalam Media Agar Tegak

Alat dan Bahan Media NA tegak dalam tabung reaksi Jarum inokulasi Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)

Skema Kerja Siapkan medium NA tegak steril. Inokulasikan secara aseptik biakan murni isolat bakteri tanah sludge dengan menggunakanjarum inokulasi secara tusukan sampai ke dalam tabung. Perhatikan : penanaman secara tusukan tidak boleh sampai dasar tabung! Inkubasikan pada suhu kamar selama 24- 48 jam. Amati pertumbuhannya, merata atau tidak, pertumbuhannya baik pada bagian permukaan atau bagian dasar, bagaimana bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan (filiform, echinulate, beaded, villous, rhizoid, arborescent) (lihat Jutono dkk., 1980 atau lihat alat peraga di laboratorium!). Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri).

c. Morfologi Koloni Bakteri dalam Media Agar Miring

Alat dan Bahan Media NA miring dalam tabung reaksi Jarum ose / Jarum inokulasi Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)

Skema Kerja Media NA miring steril diinokulasi secara aseptik dengan dengan biakan murni isolat bakteri tanah sludge menggunakan ose/jarum inokulasi secara goresan lurus. Inkubasi pada suhu kamar selama 24-48 jam. Amati pertumbuhan : tipis, sedang, lebat atau tidak ada, bentuk pertumbuhan pada goresan (filiform, echinulate, beaded, spreading, arborescent, rhizoid, plumose), elevasi, kilat, topografi, warna, bau, dan konsistensinya (lihat Jutono dkk., 1980 atau lihat alat peraga di laboratorium!). Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri).

d. Morfologi Bakteri dalam Media Cawan Agar

Alat dan Bahan Jarum ose Media NA dalam petri (cawan agar) Isolat munri bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)

Skema Kerja

Inokulasikan secara aseptik 1 ose biakan murni isolat bakteri tanah sludge ke dalam cawan agar secara streak plate. Perhatikan jalur dan arah goresan! (lihat kembali Acara II.4c). Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24-48 jam. Perhatikan dan amati koloni-koloni terpisah yang terbentuk. Amati pertumbuhan : pertumbuhan koloni di permukaan atau di bawah permukaan media, bentuk koloni, permukaan koloni, elevasi, bentuk tepi dan bentuk struktur dalam (lihat Jutono dkk., 1980 atau lihat alat peraga di laboratorium!). Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri).

2. MORFOLOGI SEL
a. Gerakan Bakteri

(1) Gerakan Bakteri dengan Metode Tetes Gantung / Hanging Drop Alat dan Bahan
Mikroskop cahaya

Gelas benda cekung dan gelas penutup Tusuk gigi Vaselin Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)

Skema Kerja Dengan menggunakan tusuk gigi, tempatkanlah 4 gumpalan vaselin pada ujung-ujung gelas penutup. Letakkan 1 ose isolat murni bakteri tanah sludge pada gelas penutup (jika media padat,tambahkan kultur dengan air). Kemudian tempelkan gelas penutup bervaselin pada gelas benda cekung. Pastikan bahwa kultur isolat yang akan diamati tepat berada di bagian yang cekung dari gelas benda. Balikkan gelas penutup pada gelas benda dengan hati-hati sedemikian sehingga ujung-ujung vaselin pada gelas benda berlekatan dengan baik pada gelas penutup. Amati dengan perbesaran lemah/kuat ada tidaknya gerakan bakteri (hati-hati dengan adanya gerakan "brownian"

(2) Gerakan Bakteri dengan Cara Tusukan Alat dan Bahan Media semisolid dengan kandungan agar 0,20,4 % Jarum inokulasi Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)

Skema Kerja Inokulasikan isolat murni bakteri tanah sludge pada media semi solid (0,2-0,4% agar) steril dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Inkubasikan pada temperatur kamar selama 24-48 jam. Amati hasil pertumbuhan dan gambarkan. Amati ada tidaknya gerakan bakteri.

b. Pengecatan-Pengecatan Bakteri
(1) Pengecatan Gram

Alat dan Bahan Mikroskop cahaya Crystal violet (Gram A) Larutan iodine (Gram B) Alkohol 96% (Gram C) Safranin (Gram D) Minyak immersi Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)

 Gelas benda Jarum ose

Skema Kerja Buatlah pulasan bakteri di atas objek gelas, keringkan dan fiksasi dengan api (lihat kembali Acara I). Teteskan cat crystal violet (Gram A) dan diamkan 30-60 detik. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir. Teteskan larutan iodine (Gram B) dan diamkan selama 1-2 menit. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan peluntur) dengan alkohol (Gram C) (kira-kira 20 detik, hati-hati jangan sampai berlebihan yang mengakibatkan kesalahan hasil). Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin (Gram D) selama 10-20 detik. Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak immersi.

 Gambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi keterangan mengenai warna sel bakteri yang menunjukkan sifat gram dan bentuk sel.

(2) Pengecatan Acid Fast (Ziehl Neelsen) Alat dan Bahan Gelas objek Mikroskop Cat ziehl Neelsen carbolfuchsin (ZN A) Peluntur (Alkohol 96%) (ZN B) Metylen blue (ZN C) Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)

Skema Kerja Buatlan pulasan bakteri, dan fiksasi di atas bunsen. Tutupkan dengan sepotong kertas filter, tambahkan larutan carbolfuchsin (ZN A), panaskan di atas bunsen dengan nyala kecil (hati-hati!), diamkan selama 5-10 menit. Dinginkan, cuci dengan air mengalir dan angin-anginkan.

 Cuci dengan larutan peluntur alkohol 96% (ZN B) sambil digoyanggoyangkan sampai seluruh pulasan tak nampak. Cuci dengan air mengalir, keringkan. Bubuhkan dengan cat penutup metylen biru (ZN C) selama 20-30 detik. Cuci, keringkan dan amati dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak immersi. Gambar hasil-hasil pengamatan. Beri keterangan mengenai bentuk sel, warna dan reaksi pengecatan.

(3) Pengecatan Spora

Alat dan Bahan Malachitte green 5% Safranin Mikroskop Minyak immersi Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)

 Gelas benda Jarum ose

Skema Kerja Pengecatan Spora metode Schaefler dan Fulton Buatlah pulasan bakteri dan fiksasi di atas bunsen (Acara I). Tetesi dengan Malachite green berlebihan dan biarkan selama 1 menit. Panasi dengan cara melalukannya di atas nyala lampu bunsen sampai menguap selama menit. Cuci dengan air mengalir selama menit dan keringanginkan. Tambahkan cat safranin selama 5 menit. Cuci, keringanginkan dan amati dengan mikroskop perbesaran kuat (1000x) dengan minyak imersi. Gambar hasil-hasil pengamatan : bentuk sel dan letak spora (sentral, terminal atau sub terminal)

Skema Kerja Pengecatan Spora metode Bartholomew dan Mittwer Buatlah pulasan bakteri dan fiksasi di atas bunsen (Acara I).

 Tetesi dengan Malachite green selama 10 menit (jangan dipanasi!). Cuci dengan air mengalir selama 10 detik dan keringanginkan. Tambahkan cat safranin selama 5-10 detik. Cuci dan amati dengan mikroskop perbesaran kuat (1000x). Gambar hasil-hasil pengamatan : bentuk sel dan letak spora (sentral, terminal atau sub terminal)