MODUL III PEWARNAAN PERCOBAAN 5 PEWARNAAN SEDERHANA I. TUJUAN 1. Mengenal dasar teori pewarnaan biologis 2.

Mengetahui cara kerja pewarnaan sederhana 3. Mengamati dan membedakan bentuk morfologi dan susunan sel-sel bakteri

II.

PRINSIP PERCOBAAN Bakteri akan terwarna oleh satu jenis pewarna. Pewarna basa yang bermuatan positif akan mewarnai dinding sel bakteri yang bermuatan negatif. Pewarna asam bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding selsehingga sel tidak terlihat berwarnapewarna basa yang paling umum adalah metilen biru, karbolfuchsin, dan kristal violet. Pewarna asam antara lain larutan nigrosin dan tinta cina. Pewarnaan ini bertujuan agar bakteri dapat diamati dengan manggunakan mikroskop.

III.

TEORI DASAR Bakteri merupakan organisme yang sangat kecil, tidak berwarna, serta transparan. Mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga dikembangkan teknik pewarnaan sel bakteri. Pewarnaan secara kimia didefinisikan sebagai senyawa organik yang terdiri dari benzena, kromofor, auksokrom. Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadinya ikatan ion karena adanya muatan listrik. Berdasarkan adanya muatan listrik ini, dapat dibedakan pewarnaan asam dan basa. Teknik pewarnaan asam dan basa disebut pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana adalah teknik pewarnaan yang hanya menggunakan satu jenis pewarna. Pewarnaan berfungsi untuk mengamati morfologi bentuk atau susunan sel dengan bantuan mikroskop.

Pembuatan preparat bakteri : 1. Mempersiapkan kaca objek : kaca objek harus bersih dari dan bebas lemak (menggunakan alkohol 70%), untuk membuat apusan dari bakteri yang akan diwarnai 2. Mempersiapkan apusan : apusan yang baik adalah tipis dan yang kering terlihat seperti lapisan yang yang tipis. Apusan ini dapat berasal dari biakan cair dan biakan padat 3. Fiksasi dengan pemanasan : apusan bakteri pada kaca objek bila tidak direkatkan dengan kuatdapat terhapus dalam proses pewarnaan lebih lanjut. Proses pelekatan apusan pada kaca objek dilakukan dengan berbagai cara diantaranya dengan prmbakaran di atas api IV. ALAT DAN BAHAN

1. Pewarnaan Basa No Alat 1. Pembakar bunsen 2. Mikroskop dan Kaca objek Bahan Minyak emersi Biakan murni Escherichia coli, Bacillus cereus, Sarcina lutea dan staphylococcus aureus yang berumur 24 jam Reagen metilen biru, karbol fuchsin, dan kristal violet

3. 4. 5.

Jarum inokulasi Botol semprot dan Kertas isap Pensil kaca/spidol

2. Pewarnaan Asam No Alat 1. Pembakar bunsen 2. Mikroskop dan Kaca objek Bahan Minyak immersi Biakan murni Bacillus cereus, Staphilococcus aureus, dan Sarcina lutes yang berumur 24 jam Tinta cina, larutan nigrosin, dan larutan eosin

3. 4. 5.

Jarum inokulasi Botol semprot dan Kertas isap Pensil kaca/spidol

V.

CARA KERJA A. Pembuatan apusan bakteri dari biakan cair dan padat No 1. Biakan Cair Biakan padat

Letakkan satu sampai dua loop Ambil satu tetes jarum lalu penuh subtansi sel pada kaca letakkan di bagian tengah kaca preparat yang bersih preparat 2.

Gerakkan jarum secara melingkar Pindahkan sedikit inokulum bakteri untuk meratakan suspensi menjadi dari agar miring ke atas tetes air.

3.

lebih tipis secukupnya Fiksasi

Ratakan keduanya Fiksasi

Biarkan apusan mengering

Lakukan pemanasan atau fiksasi apusan di atas api dengan melakukannya beberapa kali

B. Pewarnaan Basa/ pewarnaan positif No. Cara Kerja 1 Apusan dari masing-masing bakteri yang telah difiksasi ditetesi satu jenis pewarna. Biarkan terendam selama waktu yang lama. Karbol fuchsin selama 15-30 detik, kristal violet selama 20-60 detik, dan metilen biru selama 1-2 menit. 2 Cuci pewarna dengan air mengalir, selama langkah ini, pegang slide paralel dengan aliran air sehingga dapat mengurangi kehilangan bakteri dari apusan 3 Keringkan dengan cara isap dengan kertas isap, jangan di lap. Lakukan untuk tiap bakteri dengan tiap pewarna 4 Amati bakteri yang telah ditetesi munyak emirsi di mikroskop dengan perbesaran 1000x. Gambar bentuk dan susunan serta tuliskan warna yang terlihat Visualisasi Pengerjaan

C. Pewarnaan Asam/pewarnaan negatif No. Cara Kerja 1 Letakkan 1 tetes nigrosin pada ujung kaca objek. 2 Letakkan 1 atau 2 mata jarum inokulasi biakan bakteri pada tetesan tinta, suspensikan dengan baik Visualisasi Pengerjaan

Dengan menggunakan kaca objek lain, apuskan suspensi bakteri tadi pada seluruh permukaan kaca objek. Biarkan mengering, jangan dipanaskan Amati bakteri yang telah diemersi pada mikroskop. Gambar bentuk dan warna bakteri yang diamati

VI.

HASIL PENGAMATAN a. Pewarnaan Basa/pewarnaan positif Hasil pengamatan Terlihat bakteri berbentuk batang, berwarna ungu, dan tidak berkoloni

No 1.

Biakan Biakan cair Pseudomonas (KP-6)

Ditetesi Kristal violet

Visualisasi pengamatan

Fuchsin

Terlihat bakteri berbentuk batang, berwarna merah, dan tidak berkoloni

Kultur campuran (KP-5)

Kristal violet

Fuchsin

Terlihat bakteri berwarna ungu yang berbedabeda bentuknya. Ada bakteri yang berbentuk kubus, batang, maupun segitiga. Terlihat bakteri berwarna merah dan kebanyakan

berbentuk koma/fibrio. Ada yang berkoloni dan ada yang tidak berkoloni

2.

Biakan padat Bacillus (KP-5)

Kristal violet

Terlihat bakteri berwarna ungu, berbentuk basil, dan berkoloni

b. Pewarnaan asam/pewarnaan negatif No. 1. Percobaan Biakan padat Bacillus (KP-6) Ditetesi Nigrosin Hasil pengamatan Terlihat bakteri yang tidak berwarna (transparan) dan sekelilingnya berwarna biru kehitaman. Bakteri terlihat berbentuk batang. Terlihat kontaminan berbentuk bulat besar berwarna cerah. Visualisasi pengamatan

VII.

ANALISIS Pewarnaan basa pada Pseudomonas dan kultur campuran menunjukkan bahwa sel bakteri tersebut dapat menyerap warna (kristal violet berwarna ungu dan fuchsil berwarna merah). Bakteri tidak begitu jelas terlihat di mikroskop karena pemberian warna yang tidak merata sehingga bakteri tidak begitu terlihat jelas. Untuk pewarnaan basa/positif pada bakteri bacillus, digunakan satu larutan pewarna yaitu larutan kristal violet. dan bakteri jenis Bacillus d e n g a n p e m b e s a r a n 1 0 0 x 1 0 b e r b e n t u k b a t a n g (basil) dengan warna pink/merah muda. T e r w a r n a i n ya b a k t e r i o l e h p e w a r n a b a s a d i s e b a b k a n karena bakteri kaya akan asamamino dan mengandung muatan n e g a t i f s e p e r t i k e l o m p o k f o s f a t . S i f a t i n i b e r e a k s i dengan zat warna yang bermuatan positif. Sitoplasma bakteri bakteriu m u m n y a

bermuatan negatif sement ara pewarna memiliki muatan positif s e h i n g g a p e w a r n a a k a n t e r i k a t o l e h s i t o p l a s m a d a n a k h i r n ya s e l m e n j a d i t e r w a r n a i . Dalam pewarnaan bakteri ini dilakukan fiksasi yang bertujuan untuk memperkuat perlekatan warna dan bakteri pada kaca preparat. Fiksasi tidak bolehdilakukan terlalu lama sebab dapat mengakibatkan perubahan bentuk struktur bakteri yang diamati dari bentuk normalnya. Hal ini disebabkan karena semakin lamanya fiksasi,maka suhu yang dihasilkan dari fiksasi tersebut akan semakin tinggi sehingga bentuk bakteri akan mengalami lisisnya cairan dan menyebabkan bentuk yang diamati nantinyaakan berbeda dari bentuk aslinya. Pada asam/negatif pada bacillus digunakan suatu larutan pewarna yaitu nigrosin. Pada Bacillus dengan pembesaran 100x10 terlihat bernbentuk batang (basil) berwarna bening dengan warna lingkungan h i t a m a t a u g e l a p . L i n g k u n g a n ya n g b e r w a r n a h i t a m d i s e b a b k a n o l e h p e w a r n a ya n g digunakan adalah nigrosin yang memiliki warna dasar hitam. Hal ini karena, zat pewarna asam membawa suatu muatan negatif m a k a p a d a s e l ya n g p e r m u k a a n n ya j u g a n e g a t i f a k a n d i t o l a k o l e h sitoplasma sel sehingga zat warna ini akan berkaitan d e n g a n l i n g k u n g a n y a n g mengelilingi sel dan bagian dalam sel akan tetap berwarna bening. pada pengamatan bacillus dengan pewarnaan asam terlihat bentuk lain yang merupakan delembung udara. Adanya gelembung udara ini disebabkan karena kurang rapihnya praktikan pada saat mengapuskan bakteri pada kaca objek setelah diberi nigrosin. Praktikan mencoba menganalisis penyebab hasil praktikum yang tidak sesuai dengan referensi. Kesalahan saat pembilasan krital violet dengan air. Bakteri dapat saja ikut hanyut bersama air, sehingga hilang dari preparat dan tidak bisa diamati. Zat warna yang diteteskan terlalu sedikit sehingga pewarna tidak meresap ke peptidoglycan bakteri atau sehingga bakteri sulit ditemukan. Zat warna yang diteteskan berlebihan mengakibatkan suspensi bakteri yang terlalu padat sehingga jika diamati selnya bertumpuk dan cahaya mikroskop tidak dapat menembus bakteri. Selain itu, cairan yang berlebihan akan mengisi sel bakteri dan menonaktifkan/mematikan bakteri. Kehati-hatian saat mengeringkan apusan di atas bunsen yang terlalu dekat dengan api sehingga menyebabkan zat warna ikut menguap atau menyebabkan bakteri mati. Praktikan kesulitan untuk menemukan gambar mikroorganisme saat menggunakan mikroskop. VIII. KESIMPULAN 1. T u j u a n d i l a k u k a n p e w a r n a a n a d a l a h u n t u k m e m p e r m u d a h
pengamatan bentuk s e l bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, danmelihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui.

2. Bentuk nakteri yang terlihat adalah, bentuk batang untuk pseudomonas dan bacillus serta bentuk yang berbeda-beda terlihat pada kultur campuran.

3. Dengan menggunakan pewarnaan sederhana, praktikan hanya dapat mengamati morfologi dari bakteri. 4. Timbulnya warna disebabkan karena adanya ikatan ion antara dinding sel dengan senyawa aktif pada pewarna yang disebut kromogen 5. Pewarnaan asam tidak mewarnai sel karena sama-sama bermuatan negatif, sedangkan pewarna basa mewarnai sel karena bermuatan positif. XI. DAFTAR PUSTAKA Pelczar dan Chan. Dasar-Dasar Mikrobiologi. 2008. Jakarta : Universitas Indonesia. Sternit dan Lester. Microbiology for Environmental and Public Health Engineers. 1988. London : E&F N Spon LTd. hlm. : 82 http://www.scribd.com/doc/31810329/PEWARNAAN-BAKTERI