LAPORAN PRAKTIKUM

BAKTERIOLOGI
Pewarnaan BTA

Nama : NOVITASARI
Nim : 16 3145 353 107
Kelompok : IV
Oleh : Nirmawati Angria,S.Si.,M.Kes

Kelas C
D IV Analis Kesehatan
STIKes Mega Rezky Makassar
2017
 BAB I
PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur
dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup
hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri
yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel
yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang
ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA
antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis,
Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae.
Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan
penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga akan digolongkan
sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan oleh bakteri Mycobacterium
tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan.
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan
kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok
bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna
pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol
asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang
tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan
reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak
berwarna.
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak
yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka
lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu
 pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada
pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada
bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen
blue.
Sebagai tenaga analis kesehatan dibutuhkan keterampilan dalam
membuat spesimen yang berguna dalam pemeriksaan spesimen di
laboratorium. Bakteri umumnya memiliki warna yang transparan maka dari itu
diperlukan pewarnaan bakteri agar bentuk dan struktur bakteri dapat terlihat
lebih jelas jika diamati dengan mikroskop cahaya. Hal tersebut yang
melatarbelakangi penulis untuk mengangkat permasalahan ini sebagai masalah
yang akan dibahas dalam laporan praktikum dengan judul Pewarnaan Bakteri
Tahan Asam (BTA) .
B. TUJUAN
1) Untuk mengetahui cara mewarnai BTA.
2) Untuk mengetahui bentuk BTA.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hamper tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan.
Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di
identifikasi adalah dengan cara metode pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut
berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan.
Bakteri juga merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik.
Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan
kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup
sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah dalam proses
identifikasi bakteri.
Pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan warna
koloni. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam.
Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan
tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus,
sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan melengkung.
Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di
dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis
biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil
pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka
penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi
sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun
biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe
metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test
yang mana menghasilkan perubahan warna reagen.
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000 X atau lebih. Sel bakteri memiliki panjang yang
beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel
spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1
sampai 0,3 m. Bentuk bakteri bermacam macam yaitu elips, bulat, batang dan
spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat
pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran,
bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri
dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks).
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa
karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun
biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna.
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang
sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba
disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel.
Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan
pengecatan kapsul.
Prinsip dasar dari teknik pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan
yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram.
Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial
memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan
metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri.
Pewarnaan diferensial artinya pewarnaan yang menggunakan lebih dari
satu macam zat warna, seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.
Sedangkan pewarnaan khusus artinya pewarnaan yang dipakai untuk mewarnai
bagian-bagian sel atau bakteri tertentu yang sukar diwarnai dengan menggunakan
pewarnaan biasa. Pewarnaan khusus dipakai untuk mewarnai bagian-bagian sel
kuman atau kuman tertentu yang sukar diwarnai.
Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat
tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus
dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam
(BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan
larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia
contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium
tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil
pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain
menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan kera.
Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan.
Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan
pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan
pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah
besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan
pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel
terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika
proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam
sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam.
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau
berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non
motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, sekali
mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat
dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai
Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki
sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan
protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak
berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini
menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari
antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel
mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M.
tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat
tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk
tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid,
protein, dan polisakarida.
Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang
panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat
(2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia.
Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk,
serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri
batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 3 m. Pada media buatan, bentuk kokoid
dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah
diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol,
tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum
dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan
mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif
berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi
yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua
media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10
dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media).
Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari
oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan
pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan
pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk
menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh
lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23C, untuk menghasilkan
pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk cepat asam daripada bentuk
patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada
bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil
tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu
yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi,
virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan
atau seluler lainnya.
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat
warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada
pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat
mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin basa yang dilarutkan
dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan
dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke
dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk
melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu
BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama
tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk
menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna
merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol
fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat
warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.
Pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-
Neelsendapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :
1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut
bakteri tahan asam (acid fast).
2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri
tidak tahan asam (non acid fast).
Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai
sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang
tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai
menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan
perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat
yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens.
Larutan kimia yang digunakan adalah alkohol asam 3% , carbol
fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi
antara lain asam alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai
fungsi membuka lapisan lilin agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus
masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat
lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri akan tetap berwarna merah
dengan latar belakang biru atau hijau.
Negatif: apabila tidak ditemukan BTA.
Positif: apabila terdapat 1 9 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 1: apabila terdapat 10 90 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 2: apabila terdapat 1 9 BTA / 1 lapang pandang.
Positif 3: apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang
 BAB III
METODELOGI
A. WAKTU DAN TEMPAT PRAKTIKUM
Sabtu,15 April 2017 Pukul:08.00-14.00 WITA di Labolatorium
mikrobiologi STIKes Mega Rezky Makasar.
B. ALAT DAN BAHAN
A. Alat dan Bahan
a. Alat
1) Objek glass
2) Tusuk gigi
3) Rak pewarnaan
4) Gegep kayu
5) Mikroskop
6) Bunseng
b. Bahan
1) Aquadest
2) Sputum/ dahak
3) Zat warna karbol fuchsin, metilen blue
4) Larutan pemucat asam alkohol
B. Prinsip kerja
Berdasarkan pada dinding bakteri yang tahan asam mengandung
lipida. Kandungan lipid ini sangat tinggi menyebabkan sel bakteri sulit
diwarnai, karena zat warna tidak dapat menembus lapisan lipid. Jadi ketika
diwarnai dengan karbol fuchsin warna tidak mudah dilunturkan oleh
pemucat, oleh karena itu digunakan pemanasan sehingga zat warna dapat
merasuk ke dalam sel bakteri yang diliputi oleh lipida.
C. Cara Kerja
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Diambil specimen menggunakan tusuk gigi yang sudah dibuat seperti
sendok.
3. Dibuat sediaan degan ukuran 23 cm yang tidak terlalu tipis dan tidak
terlalu tebal.
4. Dikeringkan di udara.
5. Difiksasi preparat dengan cara melewatkan sediaan di atas api busen
sebanyak 3 kali.
6. Ditambahkan carbol fuchsin diatasnya sampai menutupi seluruh
permukaan kaca objek glass.
7. Dipanaskan di atas api bungsen sampai ada uap jangan sampai
mendidih.
8. Dikeringkan selama 5 menit.
9. Dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan carbol fuchsin.
10. Dilakukan dekolorisasi dengan menambahkan asam alcohol 3%
sampai sediaan pucat.
11. Dicuci dengan air mengalir.
12. Dilakukan pulaksan tanding dengan menambahkan metylen blue 0,3%
selama 30 sekon.
13. Dicuci dengan air mengalir dan biarkan kering.
14. Diamati diatas mikroskop dengan pembesaran 10 untuk menentukan
fokus dan 100 (oil emersi).
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL

Perbesaran 100
B. PEMBAHASAN
Adakalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat
warna, kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus.
Akan tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya bakteri-bakteri
TBC dan basil-basil berspora. Maka dapat dikatakan bahwa itu adalah bakteri
tahan asam. Untuk menetukan sifat bakteri yang termasuk bakteri tahan asam
dan bakteri tidak tahan asam harus diwarnai dengan pewarnaan khusus. Pada
umumnya, bakteri tahan asam merupakan bakteri yang lapisan paling luar
selnya terdiri dari lapisan lilin, sehingga menyebabkan zat warna sukar masuk
ke dalam sel bakteri.
Hal inilah yang mendasari dilakukannya percobaan pewarnaan bakteri
tahan asam (BTA). Pewarnaan BTA merupakan pewarnaan yang dilakukan
untuk mengidentifikasi Bakteri Tahan Asam. Pewarnaan ini tidak spesifik
untuk Mycobacterium tuberculosis karena hasil pewarnaan BTA juga akan
positif terhadap genus Mycobacterium lain. Bakteri BTA berwarna merah dan
bakteri non BTA berwarna biru atau ungu.
Pada praktikum kali ini dilakukan pengecetan Bakteri Tahan Asam
(BTA) yang menggunakan tiga jenis cat Ziehl Neelson (ZN) yaitu carbol
fuchsin 0,3 %, asalm alcohol 3 % dan methylene blue 0,5 %. Dalam
pengecatan ini digunakan sample sputum. Sebelum dibuat apusan, objek glass
difiksasi untuk menghilangkan lemak yang menempel pada permukaanya dan
untuk menghilangkan kontaminan lain yang ada pada objek glass. Apusan
yang dibuat tidak boleh terlalu tebal agar bakteri tidak bertumpuk-tumpuk
sehingga proses pengamatan bentuk sel bakteri menjadi lebih mudah, tetapi
apusan yang dibuat juga tidak boleh terlalu tipis. Pewarnaan BTA ini
dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Ziehl Neelson yng menggunakan
3 jenis warna sebagai berikut :
Pada Pewarnaan pertama ini dengan menggunakan zat warna Carbol
Fuchsin. Karbol fuchsin merupakan pewarna dasar, yang mengandung fenol
untuk membantu melarutkan dinding sel. Fenol digunakan sebagai pelarut
untuk membantu pemasukan zat warna kedalam sel bakteri sewaktu proses
pemanasan. Tujuan memberikan pewarna karbol fuksin adalah untuk
mewarnai seluruh sel bakteri. Setelah memberikan pewarna karbol fuksin
kemudian di panaskan di atas penangas air, tetapi jangan sampai terlalu panas,
mendidih atau kering. Tujuan dari memanaskan sampel di atas penangas air
yaitu supaya pewarna karbol fuksin masuk menembus dinding sel bakteri,
karena dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak
yang sukar di tembus pewarna bakteri. Karena pengaruh fenol dari pewarna
karbol fuksin dan juga pemanasan maka lapisan lilin dan lemak dapat
ditembus pewarna karbol fuksin. Dengan pemanasan menyebabkan pelebaran
pori pori lemak bakteri tahan asam sehingga pewarna karbol fuksin dapat
masuk sewaktu dicuci dengan larutan pemucat, dan zat warna pertama tidak
mudah dilunturkan. Menunggu selama 10 menit setelah pewarnaan dengan
warna carbol fuchsin dan dilakukan pemanasan bertujuan agar cat ini dapat
diserap dan melekat sempurna pada dinding bakteri dan dinding selnya
kembali seperti semula setelah dilakukan pemanasan. Setelah 10 menit dibilas
dengan aquades. Pencucian dengan menggunakan aquades mengalir bertujuan
untuk menutup kembali lemaknya.
Kemudian sampel di tetesi asam alkohol 3 % dan didiamkan selama
30 detik. Penambahan alkohol ini berfungsi untuk membilas atau melunturkan
zat warna (decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel
bakteri sudah mampu menyerap warna carbol fuchsin maka dinding sel
tersebut akan kembali tertutup dalam pada suhu semula. Sehingga sebelum
dilakukan penambahan asam alcohol ditunggu sampai 10 menit. Saat
penambahan asam alcohol ini, maka bakteri yang bukan BTA akan
dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut karena tidak mampu
mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA. Bakteri tahan asam pada saat
dicuci dengan asam alkohol warna karbol fuksin tidak lepas atau hilang,
sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan lepas atau hilang. Menunggu
selama menit setelah penambahan larutan asam alkohol bertujuan agar zat
warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Dan setelah 30
detik dicuci kembali dengan air mengalir atau aquadest.
Setelah itu, sampel di tetesi atau di genangi dengan pewarna tandingan
metilen biru dan didiamkan selama 1 menit. Methylene Blue merupakan
pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan
dengan asam alkohol. Zat warna methylene blue masuk ke dalam sel bakteri
non BTA yang permeabilitas dinding selnya membesar akibat lapisan lipid
pada bakteri non BTA terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga menyebabkan
sel bakteri non BTA tersebut menjadi berwarna biru. Pada bakteri BTA
dinding selnya sudah terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori
mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga zat
warna methylene blue tidak dapat masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna
merah. Menunggu selama 1 menit setelah penambahan pewarna methylene
blue bertujuan agar cat ini dapat diserap sempurna pada dinding bakteri non
BTA sehingga ada perbedaan warna antara bakteri BTA dan Non BTA.
Kemudian, setelah didiamkan selama 1 menit kemudian dibilas
dengan air mengalir atau aquadest. Objek yang telah dibasuh aquades
kemudian dikeringkan dengan menggunakan kertas saring atau tissue, tidak
ditiup-tiup karena dikhawatirkan ada kontaminasi bakteri lain yang menempel
pada objek glass.
 Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan
pembilasan terhadap kaca objek dengan menggunakan aquades. Pembilasan
ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang
diberikan.
Sampel yang sudah di keringkan, di tetesi dengan emersi oil. Minyak
emersi adalah minyak yang di pakai untuk olesan pada mikroskop, yang
fungsinya untuk memperjelas objek, dan melindungi mikroskop dari debu atau
kotoran. Minyak emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan
dengan air, sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas
dibandingkan dengan tanpa minyak emersi. Lalu diamati dengan mikroskop,
dengan pembesaran 10X dan 100X.
Berdasarkan pada hasil pengamatan dengan mikroskop lensa objektif
pembesaran 10X terlihat lapang pandang berwarna biru dan sel bakteri belum
terlihat. Sedangkan pada hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop
lensa objektif pembesaran 100X terlihat sel epitel yang ukurannya semakin
besar, dan ditemukan bakteri BTA berwarna merah dan bakteri non BTA
berwarna ungu. Sehingga Pada preparat sputum ditemukan bakteri tahan asam
(BTA) berbentuk Basil berwarna dan bakteri tidak tahan asam (non BTA)
berbentuk Coccus berwarna ungu. Dengan latar belakang berwarna biru dan
sel epitel dan PMN berwarna biru tua. Dari hasil tersebut dapat didiagnosa
bahwa sputum tersebut +3 karena ditemukan >10 BTA/lapangan pandang.
Adapun hal-hal yang harus diperhatikan pada saat pewarnaan BTA ini
yaitu pada fase yang paling kritis adalah dekolorisasi yang mengakibatkan
warna yang tidak terikat oleh sel bakteri lepas dari sel, pemberian asam
alkohol jangan sampai berlebih karena akan menyebabkan overdekolorization
sehingga sel BTA hampir sama dengan Non BTA yang menyebabkan sulit
membedakannya, tetapi jangan juga terlalu sedikit dalam memberikan alkohol
(underdecolorization) karena tidak akan melunturkan warna secara sempurna
sehingga sel Non BTA bisa saja berwarna ungu mendekati warna sel BTA.
Saat pemanasan juga tidak boleh sampai mendidih karena akan menyebabkan
sel bakteri lisis. Dan kaca obyek harus selalu dicuci dengan aquades atau air
mengalir diantara penambahan pewarna untuk menghilangkan kelebihan
warna dan mempersiapkan pewarna berikutnya.
 BAB V
PENUTUP
A. KESIMPULAN
1) Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat
tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi
harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri
tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama
sewaktu dicuci dengan larutanpemucat.
2) Pada praktikunm ini kami menggunakan zat warna yang diguanakan
adalah carbol fuchsin, asam alcohol, dan metylen blue.
3) Pada praktikum kali ini hasil yang didapatkan adalah banyaknya bakteri
pada sampel bakteri Streptococcus mutans. Namun, tidak ada yang
didapatkan bakteri yang memiliki kapsul.
B. SARAN
Pada saat melakukan praktikum diharapkan agar praktikan agar pada saat
melakukan praktikum ini menggunakan APD yang lengkap supaya tidak
tertular karena sampel yang digunakan sudah positif terkena TB.
 DAFTAR PUSTAKA
Angria Nirmawati. 2017.Penuntun bakteriologi I. Makassar: STIKes Mega Rezky
Sulpia Farhika Reyaldhi Nugraha.2016.Lapotan Pewarnaan BTA. https:/
/id.scribd.com/doc/316845387 /laporan-pewarnaan-BTA.diakses 07 juli
2016