LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM

BAKTERIOLOGI I

DOSEN PEMBIMBING :
Suliati, S.Pd, S.Si, M.Kes
Musholli Himmatun Nabilah, S.Tr.Kes

DISUSUN OLEH :
Muhammad Hafidhon Sonny (P27834123046)

PRODI SARJANA TERAPAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENTRIAN KESEHATAN SURABAYA
2023/2024
 TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI

Pendahuluan
Tujuan dan Prinsip Pewarnaan Bakteri
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, begitu pula dengan bakteri Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras bila disuspensikan dengan air. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel
bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pewarnaan. Hal
tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi
dinding sel bakteri melalui serangkaian pewarnaan (Jimmo, 2008).
Morfologi bakteri dapat dibagi dalam tiga bentuk utama, yaitu kokus, batang, dan
spiral yang dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah "pewarna
sederhana" dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam
zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-
pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan
zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Secara kimiawi, pewarna merupakan senyawa organik dengan cincin benzena
dengan golongan kromofor atau auksokrom. Benzena merupakan larutan organik tidak
berwarna Kromogen merupakan senyawa berwarna tetapi bukan pewarna. Kromofor
merupakan golongan senyawa kimia yang digunakan untuk mewarnai bakteri memiliki
rumus bangun cincin benzen Auksokrom merupakan senyawa kimia yang mengandung
gugus auksokromyang menyebabkan timbulnya warna dan yang menentukan sifat
disosiasi elektrolitnya atau membawa sifat ionisasi dari kromogen (mampu membentuk
garam) dan berikatan dengan serat atau jaringan.
Agar pewarnaan berjalan cepat, perlu bantuan intesifier, dapat berupa bahan kimia,
misalnya fenol, deterjen, atau agen fisis, misalnya pemanasan dengan api. Di samping
itu, pada proses pewarnaan bakteri diperlukan mordant, yaitu suatu bahan yang dapat
memperkuat ikatan bahan pewarna dengan bakteri yang diwarnai.
Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pewarnaan Bakteri
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, dengan asam
encer maka semua zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan
terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal
ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Teknik pewarnaan pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu
pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif, pewarnaan diferensial dan pewarnaan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan yang sudah
difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana Prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan di antara sel- sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik
pewarnaan diferensial Sedangkan pewarnaan struktural hanya mewarnai satu bagian
dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam
pewarnaan ini adalah pewarnaan endospora, flagella dan pewarnaan kapsul (Waluyo,
2010).
 Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan
cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan Penggunaan zat warna
memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng
mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003)
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi
(Rizki, 2008).
Pewarnaan
Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk;
1. mempermudah melihat morfologi, baik bakteri, ragi, maupun fungi.
2. memperjelas ukuran dan morfologi.
3. melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.
4. melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat- sifat fisik dan
kimia dapat diketahui.
Langkah-langkah utama teknik pewarnaan, antara lain :
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis. 2.
Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan
2. kimia seperti sabun, formalin, fenol.
3. Aplikasi zat warna tunggal atau lebih dari 1 zat warna
Semua prosedur pewarnaan mikrobiologis membutuhkan preparasi smear sebelum
perlakuan pada tiap teknik spesifik pewarnaan yang tercantum dibawah ini. Tekniknya
meskipun sulit, memerlukan ketelitian yang cukup untuk preparasinya. Peraturan dasar
berikut harus diikuti secara cermat :
1. Preparasi pada slide: Kebersihan merupakan hal yang penting untuk preparasi
smear mikroba. Lemak atau minyak dari jari pada slide harus dihilangkan dengan
memcuci slide dengan sabun dan air atau bubuk gosok, diikuti dengan bilasan air
dan bilas dengan alkohol 95% Slide harus dikeringkan dan disimpan pada
laplaboratorium sampai siap digunakan.
2. Preparasi smear: hindari terlalu tebal, ketebalan smear sangat penting. Smear yang
baik hanya sekali, jika sudah kering, akan nampak lapisan putih yang tipis. Untuk
pembuatan dari kultur broth atau kultur medium padat memerlukan teknik yang
berbeda.
a) Kultur Broth (cair), yaitu atu atau dua loop suspensi sel langsung letakkan pada
slide dengan loop inokulasi steril dan oleskan merata pada area tertentu kira-
kira 3.
b) Kultur dari medium padat, yaitu kultur organisme pada medium padat cukup
tebal, ketebalan pertumbuhan ada dipermukaan dan dianjurkan tidak langsung
dipindahkan ke slide. Kultur ini harus diencerkan terlebih dahulu dengan
meletakkan satu loop penuh air pada slide kemudian sel akan diemulsikan
Pindahkan sel dari kultur yang diingikan menggunakan jarum inokulasi steril.
Hanya ujung jarum yang disentuhkan pada kultur untuk menghindari
 pemindahan terlalu banyak sel. Suspensi dilakukan dengan meratakan sel
dengan gerakan sirkuler pada tetes air dengan ujung jarum. Terakhir smear
harus berupa area seukuran koin logam dan nampak semitransparan, rata, dan
putih tipis. Sebelum melanjutkan prosedur, smear harus kering sempurna.
3. Fiksasi Panas, yaitu jika slide tidak difiksasi, smear bakteri akan tercuci selama
prosedur pewarnaan. Hal tersebut dihindari dengan fiksasi panas, selama
melakukan fiksasi protein bakteri terkoagulasi dan menempel pada permukaan
slide, Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang
dikering-udarakan dua atau tiga kali pada api bunsen.
Fiksasi berguna untuk ;
a. Melekatkan spesimen pada gelas objek;
b. Membunuh bakteri tanpa merusak morfologinya;
c. Memudahkan bakteri untuk diwarnai;
d. Menyimpan slide yang belum sempat diwarnai.
Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel
bakteri terhadap zat pewarna. Pewarnaan bakteri pada dasarnya dapat dikerjakan pada
bakteri yang masih hidup, tetapi hal ini sulit sehingga pewarnaan pada umumnya
dilakukan pada bakteri yang telah dimatikan. Pewarnaan bakteri dalam keadaan hidup
atau living state dilakukan dengan menggunakan bahan warna yang tidak toksis tetapi
jarang dikerjakan karena bakteri hidup sukar menyerap warna. Cara pemeriksaan Iiving
state biasanya dilakukan untuk melihat pergerakan bakteri dan untuk melihat bakteri
yang sukar diwarnai dengan cara-cara biasa. Pemeriksaan bakteri yang menggunakan
living state adalah dengan wet mount dan hanging drop (tetes gantung). Pewarnaan
bakteri mati umumnya dilakukan pada pemeriksaan mikrobiologis. Pewarnaan terhadap
bakteri yang telah dimatikan disebut fixed state.
Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut:
1. Pewarnaan Sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen atau air fukhsin) tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang
paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil,
spirilum) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan
bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya
bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan
dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk
melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak
digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-
karbol (5 detik).
 Tujuan
Tujuan dari pewarnaa sederhana adalah untuk mengidentifikasi morfologi (bentuk)
sel bakteri.
 Prinsip
Prinsip pewarnaan sederhana, yaitu sitoplasma pada bakteri yang bersifat basofilik
(suka basa) akan mengikat zat warna pada pewarnaan sederhana yang bersifat basa
sehingga menghasilkan warna pada bagian dinding bakteri.
 Pewarna/Reagen
Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan sederhana, anatar lain :
1. Methylene blue
2. Gentian Violet
3. Safranin atau air fuchsin
 Metode
Metode yang digunakan dalam pewarnaaan sederhana, yaitu slide.
 Sampel
Sampel yang digunakan dalam pewarnaann sederhana, yaitu kultur bakteri.
 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam pewarnaan sederhana sebagai berikut.
1. Aquades
2. Alkohol 96%
3. Objek glass
4. Jembatan pewarna
5. Pipet tetes
6. Bunsen
7. Penjepit kayu/pinset
8. Ose mata
9. Timer
 Prosedur Kerja
Sebelum pewarnaan langkah awal yang dilakukan, yaitu menyiapkan sediaan/preparat.
Berikut adalah tata cara dalam membuat sediaan/preparat.
1. Bersihkan objek glas menggunakan alkohol 96% untuk menghilangkanlemak
yang menempel.
2. Buatlah gambar oval di tengah objek glas sebagai acuan untuk
penempelan bakteri pada objek glas.

3. Fikasi terlebih dahulu, setelah itu tunggu sampai objek glas kering kemudian
tambahkan PZ steril sekitar 1-2 ose ke dalam area yang telah digambar
sebelumnya secara melingkar (seperti bentuk obat nyamuk). Penggunaan ini
berlaku untuk mengencerkan bakteri agar tidak menggumpal/memadat (khusus
untuk bakteri yang ditanam pada media padat).
4. Ambilah kultur bakteri sekitar 1 ose, lalu campur dengan PZ steril di atas objek
glas secara melingkar.
5. Keringkan, kemudian fiksasi kembali, dan letakkan pada jembatan pewarnaan.
 Apabila sediaan/preparat sudah siap, maka mulailah melakukan pewarnaan. Cara
pewarnaan sederhana sebagai berikut.
1. Jika sudah difiksasi, maka genangi preparat dengan zat warna (Methylene
Blue/Safranin atau air fuchsin/Gentian violet) sampai menutupi gambar yang
bertanda oval selama 2 menit.
2. Bilas dengan air mengalir, lalu keringkan.
Langkah terakhir, yaitu lakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan
perbesaran 100x dengan menambahkan oil imersi di atas preparat sebelum
diteliti.
 Hasil
Hasil akhir pada pewarnaan sederhana dengan zat warna;
a. methylene blue : bakteri akan berwarna biru.
b. gentian violet : bakteri akan berwarna ungu.
c. Safranin : bakteri akan berwarna merah.
 HASIL PEMERIKSAAN PEWARNAAN SEDERHANA

Hari/Tanggal : Senin, 26 Februari 2024

Bahan sampel : Kultur bakteri Staphylococcus Epidermidis, Escherichia
coli,Klebsiella Pneumoniae dan Staphylococcus
Saprophyticus.
Hasil pemeriksaan :
NO Nama Bakteri Teknik Gambar Hasil Analisis
Pewarnaan

1. Staphylococcus Pewarnaan Staphylococcus

Epidermidis Sederhana Epidermidis ditambah
(Safranin) dengan pewarna safranin
memiliki bentuk kokus
dan memiliki warna
merah

2. Bacilus subtilis Pewarnaan Bakteri bacilus subtilis

Sederhana ditambah dengan
(Safranin) pewarna safranin
memiliki bentuk basil
dan bakteri memiliki
warna merah

3. Escherichia coli Pewarnaan Bakteri escherichia coli

Sederhana ditambah dengan
(Methylene Blue) pewarna methylene blue
memiliki bentuk basil
dan bakteri terlihat
berwarna biru

4. Klebsiella Pewarnaan Klebsiella Pneumoniae

Pneumoniae Sederhana ketika ditambah pewarna
(Gentient Violet) Gentient Violet memiliki
bentuk basil dan
memiliki warna ungu
 Psedumonas ketika
Pewarnaan ditambah pewarna
5. pseudomonas Sederhana Gentient Violet memiliki
(Gentient Violet) bentuk basil dan
berwarna ungu

Pembahasan :
Pewarnaan Sederhana merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam zat warna
(biru metilen atau air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana,
merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri
(kokus, basil, spirilum) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitumewarnai
sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Bakteri yang diamati menggunakan
pewarnaan sederhana ini akan bereaksi dengan zat warna gentiant violet, safranin, dan methylene
blue. Pada hasil praktikum dengan identifikasi bentuk bakteri dari kelima bakteri tersebut
pewarnaan dapat membantu kita dalam mengidentifikasi morfologi dari bakteri mulai dari bakteri
Staphylococcus Epidermidis yang memiliki bentuk kokus, bacilus subtilis yang memiliki bentuk
basil, escherichia coli memiliki bentuk basil, Klebsiella Pneumoniae memiliki bentuk basil dan
psedumonas memiliki bentuk basil.
TUGAS
1. Apa yang dimaksud dengan pewarnaan sederhana?
2. Sebutkan macam-macam pewarna yang bisa digunakan?
3. Bagaimana cara pewarnaan sederhana?

JAWABAN PERTANYAAN

1. Merupakan pewarnaan yang paling umum digunakan untuk melihat berbagai macam tipe
morfologi bakteri dalam bentuk kokus, basil, spiral.
2. Gentian violet, methylene blue,dan spiral.
3. Prosedur sebagai berikut :
 Siapkan objek glass
 Bersihkan dengan alkohol 96% agar terbebas dari lemak
 Gambar bentuk oval di objek glass
 Lakukan fiksasi tunggu dingin kemudian ambil PZ steril 1-2 ose lalu taruh diatas objek
glass yang bertanda tunggu sampai kering
 Ambil 1 ose bakteri kemudian campur dengan PZ steril diatas objek glass seperti bentuk
obat nyamuk, kemudian tunggu sampai kering
 Fiksasi preparat supaa bakteri menempel kemudian taruh di jembatan pewarnaan
 Genangi preparat dengan salah satu warna selama 2 menit bilas dengan air lalu
keringkan
 Kemudian lihat pada mikroskop objektif 100X dengan oil imersi
2. Pewarnaan Differensial
Dibagi pewarnaan gram dan tahan asam
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram- negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853- 1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococus
dan bakteri Klebsiella pneumonia.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu
bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap
cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding
selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme
yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp contoh bakteri yang
tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies
tertentu dari genus Nocardia Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki
sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga
menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang
umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa,
seperti pewarnaansederhana atau Gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu ;
 Zat warna utama (violet kristal).
 Mordan (larutan lodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk
mengintensifkan warna utama.
 Pencuci atau peluntur zat warna (alkohol/ aseton) yaitu pelarut organik yang
digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
 Zat warna kedua atau cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan
alkohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-
negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna pembanding (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi
berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan
kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukandalam 4 tahap yaitu:
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen
dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel
 dan membran sitoplasma organisme gram positif sedangkan penyingkiran zat lipida
dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan
hilang dari sel Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi
peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau
multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikanterdapat
didalam.
3. Lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari beratkering,
tidak mengandung asam tekoat.
4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnyakristal
violet.
6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat.
9. Peka terhadap streptomisin.
10. Toksin yang dibentuk Endotoksin.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada
yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat
ringan. Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungukristal.
5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.
8. Tidak peka terhadap streptomisin.
9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin.

Berikut adalah cara melakukan pewarnaan Gram :

a. Tujuan
Tujuan dari pewarnaan Gram, yaitu untuk membedakan bakteri grampositif dan
bakteri gram negatif.
b. Prinsip
Prinsip dari pewarnaan Gram, yaitu bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan gram,
 sedangkan bakteri gram-positif akan mempertahankanzat warna metil ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol.
c. Reagen
Reagen yang digunakan dalam pewarnaan Gram, antara lain :
1) Gentian Violet
2) Larutan iodine/Lugol
3) Alkohol 96%
4) Safranin
d. Metode
Metode yang digunakan dalam pewarnaan Gram, yaitu metode slide.
e. Sampel
Sampel yang digunakan dalam pewearnaan Gram, yaitu kultur bakteri.
f. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam pewarnaan Gram sebagai berikut.
1) Aquades
2) Alkohol 96%
3) Objek glass
4) Jembatan pewarna
5) Pipet tetes
6) Bunsen
7) Penjepit kayu/pinset
8) Ose mata
9) Timer
g. Prosedur Kerja
Sebelum pewarnaan langkah awal yang dilakukan, yaitu menyiapkan sediaan/
preparat. Berikut adalah tata cara dalam membuat sediaan/preparat.
1) Bersihkan objek glas menggunakan alkohol 96% untuk menghilangkan lemak yang
menempel.
2) Buatlah gambar oval di tengah objek glas sebagai acuan untuk penempelan bakteri
pada objek glas.
3) Fikasi terlebih dahulu, setelah itu tunggu sampai objek glas kering kemudian
tambahkan PZ steril sekitar 1-2 ose ke dalam area yang telah digambar sebelumnya
secara melingkar (seperti bentuk obat nyamuk). Penggunaan ini berlaku untuk
mengencerkan bakteri agar tidak menggumpal/memadat (khusus untuk bakteri yang
ditanampada media padat).
4) Ambilah kultur bakteri sekitar 1 ose, lalu campur dengan PZ steril di atas objek glas
secara melingkar.
5) Keringkan, kemudian fiksasi kembali, dan letakkan pada jembatan pewarnaan.
Apabila sediaan/preparat sudah siap, maka mulailah melakukan pewarnaan. Cara
pewarnaan gram sebagai berikut.
1) Teteskan gentian violet (zat warna 1) pada daerah apusan, lalu biarkan selama 20
detik.
2) Bilas menggunakan aquades pada ujung preparat, jangan mengenai secara langsung
daerah apusan, lalu tunggu selama 2 detik.
 3) Tetsekan larutan iodin pada daerah permukaan apusan, lalu biarkan selama 30 detik
sampai 1 menit.
4) Bilas perlahan menggunakan alkohol 96% sampai tidak terdapat zat warna.
5) Bilas menggunakan aquades pada ujung preparat, jangan mengenai secara langsung
daerah apusan, lalu tunggu selama 2 detik.
6) Tetskan zat warna safranin atau air fuchsin (zat warna 2), kemudian biarkan selama
20 detik.
7) Cuci menggunakan aquades, biarkan selama 2 detik, lalu keringkan. Apabila sudah
kering maka amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x lensa objektif
dengan ditetsi oil imersi pada permukaan preparat yang akan diamati.
h. Hasil
Hasil dari pewarnaan gram pada bakteri jika diamati di bawah mikroskop,yaitu:
1) bakteri gram positif : akan berwarna ungu
2) bakteri gram negatif : akan berwarna merah
 HASIL PEMERIKSAAN PEWARNAAN GRAM

Hari/Tanggal : Senin, 26 Februari 2024

Bahan sampel : Kultur bakteri Staphylococcus Aureus, Escherichia coli,
KlebsiellaPneumoniae dan Staphylococcus Saprophyticus.
Hasil pemeriksaan :
NO Nama Bakteri Teknik Gambar Hasil Analisis
Pewarnaan
Bakteri Staphylococcus
1. Staphylococcus Pewarnaan Gram Aureus dengan
Aureus pewarnaan sederhana
memilikibentuk bulat
kokus dan bewarna
ungu.

Bakteri Staphylococcus
2. Pseudomonas Pewarnaan Gram Saprophyticus dengan
Pewarnaan gram
memiliki bentuk bulat
kokus dan bewarna
ungu.

Bakteri Escherichia coli

3. Escherichia coli Pewarnaan Gram dengan Pewarnaan
grammemiliki bentuk
batang basil dan
bewarna merah.

Bakteri Klebsiella
4. Klebsiella Pewarnaan Gram Pneumoniae dengan
Pneumoniae Pewarnaan gram
memiliki bentuk batang
basil dan bewarna
merah.

Pembahasan :
Pewarnaan gram merupakan salah satu pewarnaan diferensial yang menggunakanzat warna lebih
dari satu. B akteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan gram sedangkan bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna
metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol. Pewarnaan gram ini membutuhkan 4 pewarna yaitu
gentian violet, larutan iodine/lugol, alkohol 96%,dan safranin. Hasil pengamatan dapat dilihat
bahwa pewarnaan gram bakteri StaphylococcusAureus dan StaphylococcusSaprophyticus memiliki
bentuk kokus dan warna ungu sedangakan bakteri Escherichia coli dan KlebsiellaPneumoniae
berbentuk basil dan berwarna merah seperti yang ada pada prinsip.
TUGAS
1. Pewarnaan gram termasuk jenis pewarnaan apa?
2. Apa perbedaan gram positif dan gram negatif?
3. Bagaimana cara pewarnaan gram?

JAWABAN PERTANYAAN
1. Pewarnaan differensial karena menggunakan lebih dari satu zat warna.
2. Gram positif : struktur dinding selnya tebal sekitar 15-80 mn, berlapis tunggal atau
monolayer, bersifat lebih rentan terhadap penisilin, tidak peka terhadap streptomisin
sedangkan untuk gram negatif : struktur dinding selnya tipis sekitar 10-15 nm berlapis tiga
atau multilayer, kurang rentan terhadap senyawa penisilin dan peka terhadap streptomisin.
3. Prosedur cara pewarnaan
1) Siapkan objek glass
2) Kemudian bersihkan objek glas menggunakan alkohol 96% untuk menghilangkan
lemak yang menempel.
3) Buatlah gambar oval di tengah obyek glass.
4) Teteskan zat warna safranin atau air fuchsin (zat warna 2), kemudian biarkan selama
20 detik. Cuci menggunakan aquades, biarkan selama 2 detik, lalu keringkan.
5) Apabila sudah kering maka amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x lensa
objektif dengan ditetsi oil imersi pada permukaan preparat yang akan diamati.
• Pewarnaan Bakteri Tahan Asam
Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam
konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberizat
warna khusus misalnya Carbol fuchsin melalui proses pemanasan, maka akanmenyerap
zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh pelunturyang kuat
sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam
(BTA).
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri
penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis. Ada beberapa cara
pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen
(Anonymous, 2009).

(sumber : ucsfbenioffchildrens.or)

Bakteri Tahan Asam (merah) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)
 Tujuan
Tujuan dari pewarnaan BTA, yaitu untuk mengetahui adanya Bakteri Tahan Asam
(BTA).
 Prinsip
Prinsip dari pewarnaan BTA, yaitu Dinding BTA yang tebal (mengandung lapisan lilin)
pori-porinya akan terbuka ketika dalam tahap pemanasan sehingga zat pewarna Carbol
fuchsin akan diserap dan menyebabkan BTA berwarna merah.
 Reagen
Reagen yang dibutuhkan dalam pewarnaan BTA, yaitu :
• Carbol fuchsin
• HCl-Alkohol 5%
• Methylene Blue.
 Metode
Metode pewarnaan BTA ada 2, yaitu Ziehl Neelsen dan Kinyoun Gabbet.
 Sampel
Sampel yang digunakan pada pewarnaan BTA, yaitu dahak (sputum).
  Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam pewarnaan BTA sebagai berikut.
• Aquades
• Alkohol 96%
• Objek glass
• Jembatan pewarna
• Pipet tetes
• Bunsen
• Penjepit kayu/pinset
• Ose mata
• Timer
 Prosedur Kerja
Sebelum pewarnaan langkah awal yang dilakukan, yaitu menyiapkan sediaan/preparat.
Berikut adalah tata cara dalam membuat sediaan/preparat.
• Bersihkan objek glas menggunakan alkohol 96% untuk menghilangkanlemak yang
menempel.
• Buatlah gambar oval di tengah objek glas sebagai acuan untukpenempelan
bakteri pada objek glas.
• Fiksasi terlebih dahulu, setelah itu tunggu sampai objek glas kering .
• Ambilah sampel sputum dalam botol plastic (pot urin) dengan bantuan tusuk gigi.
lakukan dengan keadaan steril didekat api (bunsen). Sebagai catatan, ambil bagian
sampel yang purulen (warna pekat (hijau)).
• Letakkan pada permukaan objek glas yang telah terdapat gambar oval, kemudian usap
secara melingkar memnuhi gambar oval tersebut.
• Keringkan lalu, fiksasi kembali, dan letakkan pada jembatan pewarnaan.
Apabila sediaan/preparat sudah siap, maka mulailah melakukan pewarnaan. Cara
pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA) menggunakan metode Ziehl Neelsen, sebagai
berikut.
a) Genangi sediaan/preparat dengan pewarna Carbol Fucshin.
b) Panaskan di atas Bunsen sampai mengeluarkan uap putih.
c) Setelah itu, genangi dengan HCl-Alkohol 5% sampai pewarna CarbolFucshin tidak ada
(luntur).
d) Teteskan Methylene Blue, lalu diamkan sekitar 5 menit agar warnameresap.
e) Bilas menggunakan air dan keringkan
f) Jika sudah kering lakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran objektif
100x ditambah oil imersi pada permukaan sediaan/preparat.
Cara kedua, yaitu dengan metode pewarnaan Kinyoun-Gabbet. Prosedur pewarnaan
Kinyoun-Gabbet (KG) sebagai berikut :
a) Siapkan sediaan/preparat yang akna dilakukan pewarnaan, letakkan padajembatan
pewarnaan.
b) Genangi dengan zat warna Kinyoun selama 3 menit.
c) Bilas dengan air pada ujung prparat.
d) Genangi dengan zat warna Gabbet selama 2 menit.
e) Bilas dengan iar pada ujung prparat. Kemudian tunggu sampai kering.
f) Apabila sudah kering, laulkan pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran
100x lensa objektif dan tambahkan oil imersi dalamproses pengamatan tersebut pada
permukaan preparat.
 HASIL PEMERIKSAAN PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM (BTA)

Hari/Tanggal : Selasa, 27 Februari 2024

Bahan sampel :Sputum (dahak)
Hasil pemeriksaan :
Identitas Metode
Gambar Hasil Analisis
Sampel Pewarnaan

Dari hasil sampel 1tidak

ditemukan adanya Bakteri
Tahan Asam (BTA). BTA
Sampel 1 Ziehl-Neelsen ditandai dengan adanya
bakteri berbentuk batang
basil berwarna merah.

Pada sampel 2 juga tidak

ditemukan Bakteri Tahan
Asam (BTA). BTA
Kinyoun Gabbet ditandai dengan adanya
Sampel 2
bakteri berbentuk basil
batang dan berwarna
merah.
 Pembahasan :
Pewarnaan bakteri tahan asam (BTA) bertujuan untuk mengidentifikasi adanya BTA yang
ditandai dengan bakteri berwarna merah dan berbentuk batang (basil). Dinding BTA yang tebal
(mengandung lapisan lilin) pori-porinya akan terbuka ketika dalam tahap pemanasan sehingga
zat pewarna Carbol Fuchsin akan diserap. Hal inilah yang menyebabkan BTA berwarna merah.
Reagen atau pewarna yang digunakan dalam proses pewarnaan BTA dengan metode Ziehl
Neelsen, yaitu Carbol fuchsin (menyebabkan timbulnya warna merah pada pewarnaan bakteri),
HCl-Alkohol 5% (sebagai peluntur dalam pewarnaan bakteri), dan Methylene Blue
(menyebabkan timbulnya warna biru).
Pada pengamatan di bawah mikroskop bahwa sampel sputum (dahak) untuk satu pasien
dengan inisial S hasilnya negatif. Tidak ditemukan adanya bakteri tahan asam (BTA). Jika
mengacu pada literatur maka pada pewarnaan BTA bakteri akan berwarna merah yang
berbentuk batang. Hasil pengamatan menggunakan pewarnaan Ziehl-Neelsen pada sampel 1
yang terlihat merupakan sisa zat pewarna yang digunakan dan ditemukan bakteri tidak tahan
asam (bewarna biru). Pada sampel 2, pemeriksaan dilakukan dengan pewarnaan Kinyoun
Gabbet yang terlihat hanya sisa bercak pewarna (biru dari pewarna Methylene Blue) dan tidak
teridentifikasi adanya bakteri BTA. Kedua hal tersebut kemungkinan terjadi karena adanya
kesalahan selama proses pewarnaan. Pertama, kurang maksimal dalam melakukan fiksasi
akibatnya bakteri tidak menempel dengansempurna pada objek glass sehingga ketika dilakukan
pewarnaan bakteri ikut luntur saat prosespembilasaan dengan air. Maka hasil akhir yang terlihat
saat pengamatan di bawah mikroskop hanya sisa noda pewarna saja. Kedua, salah dalam
pengambilan sputum. Pengambilan sputum harus memilih bagian yang purulent (kuning
kehijauan) dan strukturnya kental. Ketiga, sampel yang digunakan bukanlah dahak melainkan
air liur yang teksturnya kental.
TUGAS
1. Pewarnaan BTA termasuk jenis pewarnaan apa?
2. Bagaimana cara pewarnaan KG?
3. Bagaimana cara pewarnaan ZN?

JAWABAN PERTANYAAN
1. Pewarnaan differensial merupakan pewarnaan menggunakan lebih dari satu zat
warna.
2. Cara pewarnaan Kinyoun-Gabbet (KG) sebagai berikut :
a. Siapkan preparat kemudian letakkan pada jembatan pewarnaan.
b. Tetesi dengan zat warna Kinyoun selama 3 menit.
c. Buang kemudian cuci dengan air.
d. Tetesi dengan zat warna Gabbet selama 2 menit.
e. Buang kemudian bilas dengan air. Kemudian tunggu sampai kering.
f. Lakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x lensa
objektif dan tambahkan oil imersi.
3. Cara pewarnaan Ziehl-Neelsen sebagai berikut :
a. Siapkan preparat kemudian letakkan pada jembatan pewarnaan.
b. Genangi preparat dengan pewarna Carbol Fucshin.
c. Panaskan sampai mengeluarkan uap putih kemudian cuci dengan air.
d. Genangi dengan HCl alkohol 5% sampai pewarna Carbol Fucshin sampai larut.
e. Teteskan Methylene Blue diamkan selama 5 menit
f. Bilas menggunakan air kemudian keringkan
g. Lihat di mikroskop objektif 100X setelah preparat kering.
 3. Pewarnaan Khusus untuk Melihat Struktur Khusus Bakteri
Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu pada bakteri terdiri dari pewarnaan
spora dan pewarnaan kapsul.

A. Pewarnaan Spora
Bakteri memiliki komponen-komponen khusus, salah satunya spora. Padakonteks
bakteri spora yang dimaksud yaitu endospora, bagian terluar bakteri yangberperan untuk
melindungi bakteri pada kondisi ekstrem atau kondisi lingkungan yang tidak menentu,
seperti kekeringan dan kondisi yang sangat panas atau suhu tinggi. Adanya endospora
ini memungkinkan bakteri dapat bertahan hidup. Untukmengidentifikasi ada tidaknya
spora dalam bakteri diperlukan pewarnaan khusus,yaitu pewarnaan Shcaeffer Fulton
dan pewarnaan Klein. Keduanya memiliki prinsip yang sama, sediaan/preparat yang
telah digenangi oleh zat pewarna harus dipanaskan agar pori-pori dinding bakteri
membuka sehingga zat warna akan diserap oleh bakteri (khususnya spora bakteri).

1. Pewarnaan Schaeffer Fulton

Pada pewarnaan ini bakteri yang digunakan adalah bakteri Bacillus subfilis
yang dibiakkan dalam media cair.
a. Tujuan
Tujuan dari pewarnaan ini adalah untuk mengidentifikasi adanya sporadalam bakteri.
b. Prinsip
Dalam proses pewarnaan dilakukan pemanasan karena dinding bakteri yang berspora
tebal sehingga pori-pori pada dinding bakteri terbuka danzat warna melasit green akan
diserap baik. Pori-pori tersebut akan menutup ketika dibilas dengan air untuk mengunci
zat warna. Akan tetapi, pada badan bakteri zat warna melasit green akan dilepas dan
menangkap warna kedua, yaitu safranin.
c. Reagen
Reagen atau zat warna yang dibutuhkan dalam pewarnaan SchaefferFulton, antara
lain :
a) Malachite Green
b) Safranin
d. Sampel
Sampel yang digunakan dalam pewarnaan Schaeffer Fulton, yaitukultur bakteri
Bacillus subtilis.
e. Alat dan bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam pewarnaan Schaeffer Fulton
sebagai berikut.
a) Aquades
b) Alkohol 96%
c) Objek glass
d) Jembatan pewarna
e) Pipet tetes
f) Bunsen
g) Penjepit kayu/pinset
h) Ose mata
i) Timer
f. Langkah kerja
Sebelum pewarnaan langkah awal yang dilakukan, yaitu menyiapkan sediaan/preparat.
Berikut adalah tata cara dalam membuat sediaan/preparat.
1) Bersihkan objek glass menggunakan alkohol 96% untukmenghilangkan
lemak yang menempel.
2) Buatlah gambar oval di tengah objek glas sebagai acuan untukpenempelan bakteri
pada objek glas.
3) Fikasi terlebih dahulu, setelah itu tunggu sampai objek glaskering.
4) Ambilah bakteri pada tabung reaksi sekitar 1 ose.
5) Letakkan pada permukaan objek glas yang telah terdapat gambaroval, kemudian usap
secara spiral kecil dari tepi ke dalam pada gambar oval tersebut.
6) Kemudian tunggu sampai kering, lalu fiksasi.
7) Setelah selesai fiksasi, letakkan pada jembatan pewarnaan untuk melanjutkan ke tahap
berikutnya.
Apabila sediaan/preparat sudah siap, maka mulailah melakukan pewarnaan. Cara
pewarnaan bakteri berspora metode Schaefer Fulton sebagai berikut.
a) Letakkan sediaan/preparat dalam jembatan pengamatan.
b) Genangi dengan zat warna Malachite green, kemudian panaskanselama 5 menit.
c) Bilas dengan air melewati ujung preparat.
d) Genangi dengan safranin selama 30 detik.
e) Bilas dengan air, kemudian keringkan.
f) Jika sudah kering, maka amati di bawah mikroskop untuk melihatada tidaknya spora
dalam bakteri dengan perbesaran 100x lensa objektif dengan menambahkan oil imersi
pada permukaan preparat untuk memperjelas pengamatan.

Dengan pewarnaan cara Shaeffer Fulton spora berwarna hijau dan vegetatif bakteri
berwarna merah. Berikut gambar dari hasil pewarnaan spora ShaefferFulton
 (sumber : id.wikipedia.org)

2. Pewarnaan Klein
Pada pewarnaan ini bakteri yang digunakan adalah bakteri Bacillus subtilis
yang dibiakkan dalam media padat.
a. Tujuan
Tujuan dari pewarnaan ini adalah untuk mengidentifikasi adanya sporadalam bakteri.
b. Prinsip
Dalam proses pewarnaan dilakukan pemanasan karena dinding bakteri yang berspora
tebal sehingga pori-pori pada dinding bakteri terbuka dan zat warna Fucshin akan diserap
baik. Pori-pori tersebut akan menutup ketika dibilas dengan air sehingga meskipun
dibilas kedua kalinya dengan Alkohol tidak bisa luntur. Sedangkan pada badan bakteri
zat warna fucshin akan dilepas dan menangkap warna kedua, yaitu Methylene Blue.
c. Reagen
Reagen atau zat warna yang dibutuhkan dalam pewarnaan Klein, antaralain :
1) Carbol Fuchsin
2) Methylene Blue
d. Sampel
Sampel yang digunakan dalam pewarnaan Klein, yaitu kultur bakteri
Bacillus subtilis.
e. Alat
Alat dan bahan yang digunakan dalam pewarnaan Klein sebagai berikut.
1) Aquades
2) Alkohol 96%
3) Objek glass
4) Jembatan pewarna
5) Pipet tetes
6) Bunsen
7) Penjepit kayu/pinset
8) Ose mata
9) Timer
f. Langkah kerja
Sebelum pewarnaan langkah awal yang dilakukan, yaitu menyiapkan sediaan/ preparat.
Berikut adalah tata cara dalam membuat sediaan/prearat.
1) Bersihkan objek glas menggunakan alkohol 96% untuk menghilangkan lemak yang
menempel.
2) Buatlah gambar oval di tengah objek glas sebagai acuan untuk penempelan bakteri pada
objek glas.
3) Fikasi terlebih dahulu, setelah itu tunggu sampai objek glas kering kemudian tambahkan
PZ steril sekitar 1-2 ose ke dalam area yang telah digambar sebelumnya secara
melingkar (seperti bentuk obat nyamuk). Penggunaan ini berlaku untuk mengencerkan
bakteri agar tidak menggumpal/memadat (khusus untuk bakteri yang ditanam pada
media padat).
4) Ambilah kultur bakteri sekitar 1 ose, lalu campur dengan PZ steril di atas objek glas
secara melingkar.
5) Keringkan, kemudian fiksasi kembali, dan letakkan pada jembatanpewarnaan.
Apabila sediaan/preparat sudah siap, maka mulailah melakukan pewarnaan. Cara
pewarnaan Klein sebagai berikut.
1) Letakkan sediaan/preparat dalam jembatan pengamatan.
2) Genangi dengan zat warna Carbol Fuchsin kemudian panaskanselama 6 menit
3) Genangi dengan 𝐻2𝑆𝑂4 1% selama 2 detik.
4) Kemudian bilas dengan Alkohol sampai zat warna Carbol Fuchsin
luntur.
5) Bilas dengan air melalui ujung preparat.
6) Genangi dengan Methylene Blue selama 1 menit.
7) Bilas dengan air, kemudian keringkan.
8) Jika sudah kering, maka amati di bawah mikroskop untuk melihat ada tidaknya spora
dalam bakteri dengan perbesaran 100x lensa objektif dengan menambahkan oil imersi
pada permukaan preparatuntuk memperjelas pengamatan.

Pada pewarnaan Klein spora berwarna merah dan vegetatif bakteri berwarnabiru,
demikian pula dengan latar belakangnya berwarna biru.
 (sumber: https://pixnio.com)

Berikut adalah contoh bakteri berspora pada pewarnaan Klein berdasarkanpada letak
spora.

Sentral Spora berada diposisi Sub terminal

tengah Spora berada
hampir
mendekati ujung

Terminal Spora berada diujung

 HASIL PEMERIKSAAN PEWARNAAN BAKTERI BERSPORA

Hari/Tanggal :Rabu,26 maret 2024

Bahan sampel :Kultur bakteri Bacillus subtilitus
Hasil pemeriksaan :
Metode
Nama Bakteri Gambar Hasil Analisis
Pewarnaan

Hasil mikroskop bakteri

Bacillus subtilis terlihat
Bacillus
Schaeffer adanya spora bakteri
subtilitus
Fulton dengan posisi terminal.
(Media
Spora berwarna ungu
padat)
transparan dan vegetatif
bakteri berwarna ungu
gelap
 Hasil mikroskop bakteri
Bacillus subtilis yang
dikultur pada media padat
Bacillus Pewarnaan dengan pewarnaan Klein
subtilitus Klein terlihat adanya spora
(Media padat)
dalam bakteri. spora
berada di ujung bakteri
(terminal).

Pembahasan :
Bakteri memiliki komponen-komponen khusus, salah satunya spora. Pada konteks bakteri
spora yang dimaksud yaitu endospora merupakan bagian terluar bakteri yang berperan untuk
melindungi bakteri pada kondisi ekstrem atau kondisi lingkungan yang tidak menentu, seperti
kekeringan dan kondisi yang sangat panas atau suhu tinggi. Adanya endospora ini
memungkinkan bakteri dapat bertahan hidup. Untuk mengidentifikasi ada tidaknya spora
dalam bakteri diperlukan pewarnaan khusus, yaitu pewarnaan Shcaeffer Fulton dan pewarnaan
Klein.
Metode Shaeffer Fulton menggunakan 2 zat warna primer (reagen), yaitu Malachite Green
dan safranin. Dalam proses pewarnaan dilakukan pemanasan karena dinding bakteri yang
berspora tebal sehingga pori-pori pada dinding bakteri terbuka dan zat warna Malachite Green
akan diserap baik. Metode Klein menggunakan 2 zat warna primer (reagen), yaitu Carbol
Fuchsin dan Methylene Blue. Dalam proses pewarnaan dilakukan pemanasan karena dinding
bakteri yang berspora tebal sehingga pori-pori pada dinding bakteri terbuka dan zat warna
Carbol Fucshin akan diserap baik oleh bakteri.
TUGAS
1. Pewarnaan spora termasuk jenis pewarnaan apa?
2. Bagaimana cara pewarnaan Schaeffer Fulton?
3. Sebutkan 3 letak spora!

JAWABAN PERTANYAAN
1. Pewarnaan khusus untuk mengidentiikasi struktur tertentu pada bakteri salah satunya
spora.
2. Pewarnaan spora Cara pewarnaan Schaeffer Fulton sebagai berikut :
a) Siapkan preparat yang akan dilakukan pewarnaan spora.
b) Kemudian letakkan padajembatan pewarnaan.
c) Genangi dengan zat warna Malachite green, kemudian panaskan selama 5
menit.
d) Bilas dengan air melewati ujung preparat.
e) Genangi dengan safranin selama 30 detik.
f) Bilas dengan air, kemudian keringkan.
g) Jika sudah kering, amati di bawah mikroskop untuk melihat ada tidaknya spora
dalam bakteri dengan perbesaran 100x lensa objektif dengan menambahkan oil
imersi pada permukaan preparat untuk memperjelas pengamatan.

3. Letak spora ada bakteri terbia menjadi 3 kelompok, yaitu :

Sentral Sub terminal Terminal

 B. Pewarnaan Kapsul
Kapsul adalah lapisan terluar dari bakteri yang berasal dari sintesa polimer
ekstrasel (pada umumnya polisakarida) yang berkondensasi dan membentuk lapisan
disekeliling sel disebut kapsul. Pada medium agar, koloni kapsul tampak sebagai
koloni berlendir.
1. Tujuan
Tujuan dari pewarnaan kapsul adalah untuk mengidentifikasi adanya komponen
tertentu pada bakteri, yaitu kapsul.
2. Prinsip
Prinsip pewarnaan bakteri berkapsul, yaitu kapsul bakteri akan mengikat zat warna
𝐶𝑢𝑆𝑂4 yang menghasilkan warna biru pursi sedangkan badan bakteri akan mengikat
zat warna gentian violet sehingga menyebabkan badan bakteri berwarna ungu.
3. Metode
Metode yang digunakan dalam pewarnaan bakteri berkapsul, yaitu Burry and Gins.
4. Sampel
Sampel yang digunakan dalam pewarnaan kapsul, yaitu biakan bakteri
Klebsiella pneumonia dalam biakan susu murni.
5. Reagen
Reagen yang digunakan dalam pewarnaan kapsul, antara lain :
a) Gentian violet 0,5%
b) 𝐶𝑢𝑆𝑂4 20%.
6. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam pewarnaan kapsul sebagai berikut.
a) Aquades
b) Alkohol 96%
c) Objek glass
d) Jembatan pewarna
e) Pipet tetes
f) Bunsen
g) Penjepit kayu/pinset
h) Ose mata
i) Timer
7. Prosedur Kerja
Sebelum pewarnaan langkah awal yang dilakukan, yaitu menyiapkan sediaan/
preparat. Berikut adalah tata cara dalam membuat sediaan/preparat.
1) Bersihkan objek glas menggunakan alkohol 96% untuk menghilangkanlemak yang
menempel.
2) Buatlah gambar oval di tengah objek glas sebagai acuan untukpenempelan
bakteri pada objek glas.
3) Fikasi terlebih dahulu, setelah itu tunggu sampai objek glas kering.
4) Ambilah kultur bakteri sekitar 1 ose, lalu letakkan di atas objek glassecara
melingkar sampai memenuhi gambar oval yang telah di tandai.
5) Keringkan, kemudian fiksasi kembali, dan letakkan pada jembatan pewarnaan.
Apabila sediaan/preparat sudah siap, maka mulailah melakukan pewarnaan. Cara
pewarnaan bakteri berkapsul sebagai berikut.
1) Genangi sediaan dengan zat warna gentian violet ) 0,5% sekitar 1 sampai 5 menit
1) Kemudian bilas dengan zat warna 𝐶𝑢𝑆𝑂4 20%
2) Jika sudah, buang larutan zat warna tanpa dibilas dengan air, lalu keringkan.
3) Apabila telah kering, lakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran
100x lensa objektif dengan menambahkan oil imersi di ataspermukaan preparat.

Hasil dari pewarnan bakteri berkapsul apabila diaamati di bawah mikroskop, yaitu
kapsul bakteri berwarna biru pursi/muda (dari 𝐶𝑢𝑆𝑂4) dan badan bakteri berwarna
ungu. Berikut adalah contoh bakteri berkapsul.

(sumber : https://paramedicsworld.com)
 HASIL PEMERIKSAAN PEWARNAAN BAKTERI BERKAPSUL

Hari/Tanggal :Rabu, 21 Maret 2024

Bahan sampel :Kultur bakteri Klebsiella pneumoniae
Hasil pemeriksaan :
Nama Teknik
Gambar Hasil analisis
Bakteri Pewarnaan

Pada gambar di samping

Klebsiella Pewarnaan terlihat bahwa terdapat
kapsul kapsul pada bakteri.
pneumoniae

Pembahasan :
Pewarnaan berkapsul merupakan pewarnaan khusus yang ditujukan untuk melihat komponen
dari bakteri, yaitu kapsul pada bakteri. Bakteri yang berkapsul sudah pasti berlendir. Prinsip
pewarnaan bakteri berkapsul, yaitu kapsul bakteri akan mengikat zatwarna 𝐶𝑢𝑆𝑂4 yang
menghasilkan warna biru pursi sedangkan badan bakteriakan mengikat zat warna gentian
violet sehingga menyebabkan badan bakteri berwarna ungu.Untuk kadar dari masing-masing
reagen, gentian violet 0,5% dan 𝐶𝑢𝑆𝑂4 20%. Hasil praktikum bakteri yang dikultur terdapat
kapsul yang melindungi badan bakteri tersebut tetapi, kapsulnya terlihat sangat tipis.
Kemungkinan besar yang menyebabkan kapsul pada bakteri Klebsiella pneumoniae terlihat
tipis , disebabkan terlalu lama dalam melakukan fiksasi sediaan/preparat sehingga dapat
menyebabkan kapsul bakteri mengalami kerusakan dan tidak dapat diamati di bawah
mikroskop.
TUGAS
1. Pewarnaan kapsul termasuk jenis pewarnaan apa?
2. Bagaimana cara pewarnaan Burry Gins?
3. Sebutkan macam-macam pewarna yang digunakan untuk pewarnaan kapsul!

JAWABAN PERTANYAAN
1. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dalam bakteri salah satunya adalah
kapsul pada bakteri.

2. Cara pewarnaan Burry Gins sebagai berikut :

a) Siapkan preparat yang akan dilakukan pewarnaan
b) Letakkan pada jembatan pewarnaan.
c) Genangi sediaan dengan zat warna gentian violet 0,5% selama 1 sampai 5 menit
d) Lalu bilas dengan zat warna 𝐶𝑢𝑆𝑂4 20%.
e) Kemudian buang larutan zat warna tanpa dibilas dengan air, lalu keringkan
f) Apabila sudah kering, lakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan
perbesaran 100x lensa objektif dengan menambahkan oil imersi di atas
permukaan preparat.
3. Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan kapsul sebagai berikut :
 Gentian violet 0,5%
 𝐶𝑢𝑆𝑂4 20%
 4. Pewarnaan Metakromasi
Granula metakromatik dimiliki oleh Corynebacterium diphtheriae, jika diwarnai
dalam sediaan, granula tersebut akan berwarna lain daripada zat warna yang digunakan.
Granula metakromatik yang terdiri atas volutin, granula glikogen serta granula lemak.
Selain ditemukan pada Corynebacterium diphtheriae juga di algae dan protozoa.
Granula metakromatik mengandung polifosfat, asam ribonukleat, dan protein. Granula
ini merupakan cadangan makanan atau sumber cadangan energi bagi bakteri. Pada dalam
sitoplasma dapat ditemukan granula metakromatik yang tersebut di dalam sediaan
mikroskopik. Granula metakromatik sering ditemukan pada jenis- jenis kuman patogen
tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. Granula metakromatik dapat
diwarnai dengan pewarnaan metakromasi, misalnya pewarnaan cara Neisser. Pada
pewarnaan metakromasi tersebut, hasil pewarnaan berbeda dengan bahan pewarna yang
digunakan.
a) Tujuan
Tujuan dari pewarnaan metakromasi, yaitu untuk melihat bentuk dan letak granula pada
bakteri.
b) Prinsip
Prinsip dari pewarnaan metakromasi, yaitu granula (metakromatis) akan mengikat
Neisser AB warna biru keunguan sedangkan badan bakteri mengikat neisser C warna
coklat orange.
c) Metode
Metode yang digunakan pada pewarnaan metakromasi, yaitu metode direct.
d) Sampel
Sampel yang digunakan pada pewarnaan metakromasi, yaitu; (a) biakan bakteri
Corynebacterium diphtheria, dan (b) swab tenggorakan atau swab hidung.
e) Reagen
Reagen yang dibutuhkan pada pewarnaan metakromasi, antara lain :
1. Neisser A
2. Neisser B
3. Neisser C
f) Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam pewarnaan metakromasi sebagai berikut.
1. Aquades
2. Alkohol 96%
3. Objek glass
4. Jembatan pewarna
5. Pipet tetes
6. Bunsen
7. Penjepit kayu/pinset
8. Ose mata
9. Timer
g) Prosedur Kerja
1. Menyiapkan obyek glass yang steril dalam artian bebas lemak.
2. Memfiksasi diatas nyala api.
3. Mengambil swab tenggorok dan diletakkan di tengah-tengah obyek glass.
4. Menunggu sampai kering alami dan memfiksasi diatas nyala api.
5. Genangi sediaan dengan campuran zat warna Neisser A dan Neisser B dengan
perbandingan 2:1 selama 1 menit.
6. Bilas dengan air kemudian genangi sediaan dengan zat warna Neisser Cselama 30
detik (tanpa dibilas), kemudian
7. Dikeringkan dengan kertas penghisap, ditetesi minyak imersi dan dilihatdibawah
mikroskop dengan perbesaran 100 kali.
Dengan pewarnaan ini bakteri Corynebacterium diphtheriae tampak sebagai batang
berwarna kuning kecoklatan dan pada kedua granulanya berwarna ungu kehitaman,
sehingga bentuknya menyerupai halter. Pada pewarnaan terakhir (zat warna crysoidin)
tidak boleh dibilas dengan air karena zat warna crysoidin dilunturkan dengan air.
h) Hasil
Hasl akhir dari pewarnaan metakromasi, yaitu terdapat bakteri dengan tonjolan granula
di kedua ujung atau salah satu ujung bakteri. Tubuh bakteri (batang) berwarna kuning
kecoklatan dan granula berwarna ungu kehitaman.
Berikut contoh hasil pewarnaan granula dengan Metode Neisser.

(sumber : dinkespapuabarat.wordpress.com)
 HASIL PEMERIKSAAN PEWARNAAN METAKROMASI
(BAKTERIBER GRANULA)

Hari/Tanggal :Selasa,27 Februari 2024

Bahan sampel :Swab tenggorokan Hasil
pemeriksaan :
No. Metode
Gambar Hasil analisis
pewarnaan

Pada gambar di samping,

terlihat bahwa tidak
terdapat bakteri
Corynebacterium
diphtheria. Bakteri ini jika
dilakukan pewarnaan
menggunakan zat warna
Neisser akan memberikan
hasil badan bakteri
berwarna kuning
kecoklatan dan granula
Metode pewarnaan berwarna ungu kehitaman.
1. Neisser
Sedangkan pada hasil di
samping nampak warna
biru hal tersebut
merupakan noda
pewarnaan bukan suatu
bakteri.sedangkan warna
orange berbentuk bulat
kemungkinan adalah sel
mukosa yang ikut terambil
pada saat melakukan swab.
Pada hasil disamping juga
ditemukan flora normal
yang terdapat pada
tenggorokan.
Pembahasan :
Pewarnaan metakromasi merupakan pewarnaan bakteri yang bertujuan untuk
mengidentifikasiadanya granula pada bakteri. Target bakteri bergranula yang dimaksud
merupakan bakteri penyebab penyakit difteri, yaitu Corynebacterium diphtheria. Metode yang
paling umum digunakan, yaitu Neisser. Berdasarkan pada prinsip pewarnaannya, granula pada
bakteri ketikadilakukan pewarnaan akan mengikat zat warna Neisser A dan B yang
memberikan hasil warnabiru keunguan, sedangkan Neisser C akan diikat oleh badan bakteri
yang memberikan hasil
 warna kuning kecoklatan. Pada hasil pengamatan tidak terdapat bakteri Corynebacterium
diphtheria. Yang nampak warna biru hal tersebut merupakan noda pewarnaan bukan bakteri.

TUGAS
1. Pewarnaan granula termasuk jenis pewarnaan apa?
2. Bagaimana cara pewarnaan Neisser?
3. Sebutkan 3 macam pewarnaan Neisser?

JAWABAN PERTANYAAN
1. Pewarnaan granula termasuk ke dalam jenis pewarnaan khusus, yaitu untuk
mengidentifikasi adanya komponen tertentu pada bakteri, salah satunya adalah granula pada
bakteri.

2. Cara pewarnaan Neisser sebagai berikut :

a) Siapkan sediaan/preparat yang akan dilakukan pewarnaan, letakkan pada jembatan
pewarnaan.
b) Teteskan reagen Neisser A dan B pada permukaan sediaan/preparat dengan perbandingan
2:1 (2 untuk Neisser A dan 1 untuk Neisser B).
c) Tunggu sekitar 1 menit sampai zat warna reagen Neisser A dan B terserap olehbakteri.
d) Selanjutnya, bilas menggunakan air di bagian ujung sediaan/preparat jangan sampai
mengenai secara langsung bagian usapan bakteri.
e) Genangi dengan reagen Neisser C selama 30 detik, kemudian keringkan tanpa harus dibilas
menggunakan air.
f) Setelah kering, lakukan pengamatan di bawah mikroskop untuk melihat ada tidaknya bakteri
Corynebacterium diphtheria pada perbesaran 100x lensa objektif (tambahkan oil imersi ada
permukaan sediaan/preparat).

3. Ada 3 macam zat warna yang digunakan dalam pewarnaan Neisser, yaitu :
a) Neisser A
b) Neisser B
c) Neisser C