PROGRESS REPORT

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PENGECATAN BAKTERI

Disusun untuk memenuhi sebagian tugas mata kuliah praktikum mikrobiologi

Disusun oleh:
Tri Purwa Ningrum (18308141064)

PROGRAM STUDI BIOLOGI

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA
2021
A. JUDUL
Pengecatan Bakteri

B. TUJUAN
1. Mengetahui tujuan dilakukannya pewarnaan bakteri dalam kegiatan praktikum
mikrobiologi
2. Mengetahui macam-macam teknik pewarnaan bakteri dalam kegiatan
praktikum mikrobiologi
3. Mengetahui fungsi macam-macam reagen yang digunakan untuk pewarnaan
bakteri
4. Mengetahui prosedur kerja pewarnaan bakteri

C. ABSTRAK
D. KAJIAN PUSTAKA
I. Bakteri
Menurut Kenneth (2012) bakteri adalah mikroorganisme bersel tunggal
dengan komponen selular prokariot. Berdasarkan respon terhadap pewarnaan
gram, bakteri dibedakan menjadi dua macam yaitu bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif. Perbedaan dari kedua bakteri ini adalah dari struktur
dinding selnya. Dinding sel bakteri gram positif terdiri dari lapisan
peptidoglikan (ketebalan ± 20 – 80 nm, yang terletak di luar lapisan membrane
plasma), sedangkan dinding sel bakteri gram negatif memiliki lapisan
peptidoglikannya (ketebalan ± 2 – 7 nm dan dilapisi oleh membran luar dengan
ketebalan 7 – 8 nm). Bakteri gram positif memiliki peptidoglikan lebih tebal
dibandingkan bakteri gram negatif. Hal ini menjadikan bakteri ini akan terlihat
berwarna ungu dibandingkan dengan bakteri gram negatif yang akan
menghasilkan warna pink jika dilakukan pewarnaan gram (Willey et al., 2008).
II. Pewarnaan Bakteri
Salah satu tindakan penting yang perlu dilakukan terutama menyangkut
mikroorganisme adalah melakukan identifikasi terhadap mikrooganisme yang
ditemukan seperti jenis bakteri, jamur, ataupun virus. Kegiatan praktikum ini
mengkhususkan kepada identifikasi terhadap bakteri. Untuk dapat
mengidentifikasi bakteri, perlu dilakukan teknik pewarnaan yang disebut
pewarnaan gram. Pewarnaan gram adalah langkah identifikasi awal terhadap
bakteri sehingga akan diketahui bakteri tersebut termasuk ke dalam golongan
gram negatif atau positif. Pewarnaan terhadap bakteri secara garis besar, dibagi
menjadi dua, yaitu :
1. Pewarnaan Bakteri Hidup
Pewarnaan bakteri hidup dilakukan dengan menggunakan bahan warna
yang tidak toksis tetapi jarang dikerjakan karena bakteri hidup sukar
menyerap warna. Pewarnaan bakteri hidup dilakukan untuk melihat
pergerakan bakteri, serta pemeriksaannya dilakukan dengan
menggunakan tetes gantung (hanging drop)
2. Pewarnaan Bakteri Mati
Pewarnaan terhadap bakteri yang telah dimatikan disebut fixed state.
Pewarnaan bakteri mati bertujuan untuk melihat struktur luar bahkan
struktur dalam bakteri, memperjelas ukuran bakteri dan melihat reaksi
 bakteri terhadap pewarna yang diberikan sehingga dapat diketahui sifat-
sifat fisik dan kimia dari bakteri tersebut.

III. Latar Belakang Pewarnaan Bakteri

1. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air,
dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah
dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi
untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecatan
2. Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang
menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme
ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan
cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti
spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat.
IV. Tujuan Pewarnaan Bakteri
Tujuan dari pewarnaan bakteri adalah untuk mempermudah pengamatan
bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan
luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan
sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui.
V. Prinsip Pewarnaan Bakteri
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara
komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang
disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini
maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Jika ion yang
mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna
basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna
tersebut disebut pewarna asam.
VI. Faktor-Faktor yang Diperlukan dalam Pewarnaan Bakteri
1. Fiksasi
Sebelum pewarnaan dilakukan, bakteri harus difiksasi lebih dahulu,
yaitu dengan cara fisik (pemanasan atau freeze drying). Cara fisik dapat
dilakukan dengan membuat lapisan suspensi bakteri di atas gelas benda,
kemudian diangin-anginkan dan dilakukan beberapa kali di atas api
lampu spirtus. Sedangkan jika menggunakan agen kimia, maka agensia
fiksasi kimia yang digunakan yaitu campuran asam cuka dengan asam
pikrat, alkohol dengan aseton, dll). Fungsi dari fiksasi yaitu :
1) Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel
2) Mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan karboksilat, amino
primer, sulfihidril
3) Merubah afinitas pewarna bakteri
4) Mencegah terjadinya otolisis sel
5) Membunuh bakteri secara cepat dan tidak menyebabkan
perubahan bentuk atau strukturnya
 6) Melekatkan bakteri di atas gelas benda
7) Membuat sel-sel lebih kuat (keras)
2. Substrat
Tiap pewarna asam atau basa dapat bereaksi dengan konstituen-
konstituen tertentu. Oleh sebab itu substrat organik (lipid-lipid, protein-
protein, asam-asam nukleat dan karbohidrat) akan mempengaruhi
pewarnaan biologi. Sehingga dapat dibedakan sel-sel yang :
1) Basofil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri basa
2) Asidofil atau oksifil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna
bakteri asam
3) Sudanolfil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri
yang dapat larut dalam minyak
3. Intensifikasi pewarnaan
Dapat dilakukan melalui beberapa cara diantaranya yaitu dengan
mempertinggi kadar pewarna bakteri atau menambah suatu mordan
4. Pelunturan pewarna bakteri (Decolorizer)
Decolorizer digunakan untuk mendapatkan kontras yang baik pada
bayangan mikroskop. Pada umumnya sel-sel yang sukar untuk
dipewarna bakteri akan lebih sukar untuk didekolorisasi (contohnya,
pada pewarnaan acid fast pada Mycobacterium). Sebaliknya, sel-sel
yang mudah diwarna akan lebih mudah pula didekolorisasi. Jenis-jenis
peluntur pewarna bakteri antara lain :
1) Peluntur pewarna bakteri yang lemah (alkohol, air, minyak
cengkeh, aseton dan gliserin).
2) Peluntur pewarna bakteri asam (HCL, H2SO4, HNO3 dan
campuran asam-asam tersebut dengan alkohol).
3) Peluntur pewarna bakteri basis (KOH, NaOH, sabun dan garam-
garam basa)
4) Garam-garam logam berat (AgNO3, CuSO4, dll)
5) Garam-garam logam ringan (NA2SO4, MgSO4, dll).
VII. Zat Warna Pada Pewarnaan Bakteri
Secara kimiawi, zat pewarna sel bakteri terdiri dari komponen organik
yang mengandung cincin benzena, dilengkapi dengan gugus kromofor dan
auksokrom.

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam.
Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut
kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian
yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif. Zat warna
basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan
 didinding sel, membran sel dan sitoplasma saat proses pewarnaan. Muatan
positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel,
sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai
latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini
tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel.

VIII. Metode Pewarnaan Bakteri

A. Pewarnaan Sederhana :

1. Pewarnaan positif atau pewarnaan langsung (Pewarna Basa)

Pewarnaan langsung (positif) artinya langsung mewarnai
struktur mikroorganisme. Umumnya zat pewarna merupakan garam-
garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif atau negatif,
dimana salah satu ion-ion tersebut berwarna. Jika suatu sel bakteri yang
dinding selnya bermuatan relatif negatif bersatu dengan ion yang
bermuatan positif dari suatu pewarna, maka menyebabkan sel bakteri
tersebut terwarnai. Zat pewarna dapat dikelompokkan menjadi dua
group, yaitu zat pewarna yang bersifat basa dan zat pewarna yang
bersifat asam. Jika ion positif dari zat pewarna yang mengandung warna
tersebut, maka pewarna tersebut adalah pewarna basa. Dan bila warna
tersebut berada pada ion yang bermuatan negatif, maka pewarna tersebut
adalah pewarna asam.
2. Pewarnaan negatif atau pewarnaan tak langsung (Pewarna Asam)
Pewarnaan negatif merupakan cara pewarnaan tidak langsung
karena yang diwarna adalah latar belakangnya, sedangkan bakterinya
sendiri tidak mengalami pewarnaan. Pewarna bakteri yang banyak
digunakan dalam pewarnaan negatif adalah Nigrosin dan tinta cina.
Karena daya mewarnai pada zat ini berada pada ion negatif dan tidak
bereaksi dengan ion negatif lainnya dari sel bakteri, maka pewarna ini
tidak mewarnai sel. Dalam hal ini, yang terwarnai adalah lingkungan
sekitar sel. Dalam kondisi ini, bentuk-bentuk dan ukuran sel bakteri
dapat diamati dengan jelas.

B. Pewarnaan Diferensial (menggunakan lebih dari satu jenis zat pewarna) :

 Pengelompokan Bakteri
1. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan salah satu cara pewarnaan yang
paling sering dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi, dimana bakteri
dapat dibedakan menjadi dua grup, yaitu bakteri gram positif dan gram
negatif. Prinsip dari pewarnaan ini adalah perbedaan komponen dinding
sel bakteri : besar kecilnya kandungan peptidoglikan dan keberadaan
membran luar yang mempengaruhi kemampuan dinding sel mengikat
warna dasar (crystal violet). Pewarnaan gram merupakan pewarnaan
differensial karena membedakan bakteri yang bersifat gram positif dan
gram negatif. Selain itu ada pula bakteri yang bersifat gram variabel.
Bakteri-bakteri ini mempunyai sifat intermedier antara gram positif dan
negatif, sehingga terkadang bersifat gram positif dan sebaliknya.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat jenis larutan, yaitu
larutan zat warna basa, mordant, pencuci zat warna, dan satu zat warna
lainnya (counterstain) yang berbeda dari zat warna yang pertama.
Pewarnaan gram meliputi 4 tingkatan, yaitu :
1) Pemberian pewarna bakteri utama (larutan crystal violet, yang
berwarna ungu).
2) Mordant, yaitu zat yang dapat menaikkan afinitas atau
pengikatan antara sel dengan zat warna. Beberapa contoh
mordant misalnya asam, basa, garam metal, dan yodium.
Dengan adanya mordant, zat warna akan lebih sukar tercuci.
3) Pencucian (dekolorisasi) dengan larutan alkohol. Pencuci warna
digunakan untuk menghilangkan zat warna dari sel bakteri.
Beberapa sel bakteri lebih mudah melepaskan zat warna
daripada sel-sel lainnya. Dalam pewarnaan gram dan pewarnaan
diferensial lainnya, perbedaan dari bakteri disebabkan oleh
perbedaan dalam kecepatan melepaskan zat warna oleh sel
4) Counterstain, Zat warna kedua yang digunakan setelah sel dicuci
dengan larutan pencuci disebut “counterstain” yang berbeda
warnanya dari zat warna pertama. Sel-sel yang tidak dapat segera
melepaskan zat warna setelah pencucian akan tetap berwarna
seperti zat warna pertama, sedangkan sel-sel yang dapat segera
melepaskan zat warna setelah pencucian akan mengikat zat
warna kedua.
 Cara Kerja Pewarnaan Gram :
Dalam perwarnaan gram, mula-mula sel bakteri diwarnai dengan zat
warna basa yaitu kristal violet, diikuti perlakuan menggunakan suatu
mordant yaitu larutan yodium (lugol). Ketika sediaan dilarutkan dengan
kristal violet lalu kemudian iodin, warna ungu dari larutan kristal violet
ini akan ditahan oleh struktur peptidoglikan bakteri ditambah dengan
penahanan oleh larutan iodin. Sel kemudian dicuci dengan alkohol untuk
menghilangkan violet kristal. Setelah dicuci, kemudian diwarnai dengan
“counterstain” yaitu safranin.
Sel-sel yang tidak dapat melepaskan warna dan akan tetap
berwarna seperti warna kristal violet, yaitu biru-ungu disebut bakteri
gram-positif. Dikarenakan pori-pori peptidoglikan yang sempit
ditambah dengan adanya iodin maka zat warna ungu akan sulit terhapus
ketika sediaan disirami alkohol yang bisa menghapus zat warna ungu
dari kristal violet tadi sehingga akan tetap terlihat berwarna ungu.
Sedanglan sel-sel yang dapat melepaskan violet kristal dan mengikat
safranin sehingga berwarna merah-merah muda disebut bakteri gram-
negatif. Karena struktur pori peptidoglikan dari bakteri gram negatif
yang lebih besar, maka akan lebih mudah bagi larutan alkohol untuk
menetralisir atau menghapus zat warna ungu yang ada di peptidoglikan
sehingga akan terlihat warna pink setelah pemberian safranin (Willey et
al., 2008).
2. Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan tahan asam adalah pewarnaan yang dapat mengukur
ketahanan sel yang telah diwarnai terhadap pencucian dengan asam.
Ketahan-asaman dari bakteri dan aktinomicetes tertentu berhubungan
dengan banyaknya lapisan lemak. Pewarnaan ini terutama digunakan
untuk diagnosa dan studi penyakit-penyakit yang disebabkan oleh
species-species tahan asam seperti penyebab TBC dan lepra. Pewarna
dasar yang digunakan adalah karbol fuhsin panas, dan pencucinya
adalah alkohol asam. Setelah itu, sediaan diberi warna pembanding.
Pada pewarnaan bakteri asam menggunakan metode Ziehl-
Neelsen (juga disebut Hot Stain), bakteri tahan asam akan berwarna
merah karena menyerap pewarna karbol fuchsin yang dipanaskan,
karena pada saat pemanasan dinding sel bakteri yang memiliki banyak
lemak membuka sehingga pewarna dapat terserap. Namun tidak dapat
dilunturkan dengan asam alkohol karena pada saat suhu normal lemak
pada dinding sel bakteri kembali menutup, sehingga ketika diwarnai
dengan pewarna tandingan, yaitu Methylene Blue, warnanya tetap
merah.

 Penampakan Struktur Bakteri

1. Pewarnaan Flagella
 Flagel merupakan salah satu alat gerak bakteri. Flagel
mengakibatkan bakteri dapat bergerak berputar. Penyusun flagel adalah
sub unit protein yang disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul
rendah. Berdasarkan jumlah dan letak flagelnya, bakteri dibedakan
menjadi monotrik, lopotrik, amfitrik, peritrik dan atrik. Prinsip
pewarnaan flagella adalah membuat organel tersebut dapat dilihat
dengan cara melapisinya dengan mordant dalam jumlah yang cukup.
Dua metode pewarnaan flagella, yaitu metode Gray dan metode Leifson.
Metode Gray digunakan untuk mendapat hasil yang lebih baik
dan mengena walaupun dalam metode ini tidak dilakukan pencelupan
yang khusus. Pada pewarnaan flagella larutan kristal violet bertindak
sebagai pewarna utama, sedangkan asam tannic dan alumunium kalium
sulfat bertindak sebagai mordant. Kristal violet akan membentuk
endapan disekitar flagel, sehingga meningkatkan ukuran nyata flagel.
2. Pewarnaan Kapsula
Fungsi pewarnaan ini adalah untuk melihat apakah bakteri yang
diamati berkapsul atau tidak. Kapsula adalah lapisan lendir yang
terdapat di sekeliling bakteri jenis tertentu, yang terdiri dari polisakarida,
glikoprotein atau polipeptida. Senyawa ini disekresikan oleh sel untuk
melindungi sel dari material aktif lingkungannya. Pewarnaan kapsul
tidak dapat dilakukan sebagaimana melakukan pewarnaan sederhana,
pewarnaan kapsul dilakukan dengan menggabungkan prosedur dari
pewarnaan sederhana dan pewarnaan negatif. Masalahnya adalah ketika
kita memanaskan preparat dengan suhu yang sangat tinggi kapsul akan
hancur, sedangkan apabila kita tidak melakukan pemanasan pada
preparat, bakteri tidak dapat menempel dengan erat dan dapat hilang
ketika kita mencuci preparat.
Pewarnaan kapsul menggunakan pewarna Kristal Violet dan
sebagai pelunturnya adalah Copper Sulfate. Kristal violet memberikan
warna ungu gelap terhadap sel bakteri dan kapsul. Namun kapsul
bersifat nonionic, sehingga pewarna utama tidak dapat meresap dengan
kuat pada kapsul bakteri. Copper sulfate bertindak sebagai peluntur
sekaligus counterstain, sehingga mengubah warna yang sebelumnya
ungu gelap menjadi biru muda atau pink. Maka dari itu pada pewarnaan
kapsul, kapsul akan transparan sedangkan sel bakteri dan latar
belakangnya akan berwarna biru muda atau pink.
3. Pewarnaan Spora
Endospora merupakan alat survival bagi bakteri tertentu untuk
`istirahat` (dorman) selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan
atau ekstrim. Endopora memiliki dinding yang sangat tebal dan
kompleks hingga resisten terhadap kondisi ekstrim lingkungan.
Endospora mampu `berkecambah` kembali menjadi sel vegetatif yang
aktif bila kondisi lingkungan telah kembali normal. Terdapat beberapa
metode pewarnaan spora bakteri, diantaranya yaitu metode Schaeffer-
Fulton dan metode Dorner. Pada metode Schaeffer-fulton, pewarna yang
digunakan adalah hijau malaksit dan safranin, sedangkan pada metode
Dorner, pewarna yang digunakan adalah carbol fuchsin yang dipanaskan
dan negrosin.
 Pewarna dasar yang digunakan yaitu pewarna malakit hijau. Zat
ini mampu mewarnai sel maupun spora bakteri. Karena endospora sel
biasanya telah memiliki lapisan khusus yang sulit ditembus zat pewarna,
maka pemanasan dibutuhkan selama proses pengikatan warna dasar
untuk membantu proses penetrasi zat warna. Setelah pemberian warna
dasar, spora dan sel vegetatif bakteri akan terwarna hijau. Pencuci warna
dasar yang digunakan adalah air yang mengalir. Pewarna dasar yang ada
di dinding sel akan hilang sementara yang telah terperangkap dalam
spora akan bertahan. Sel vegetatif bakteri menjadi tak berwarna
sementara spora tetap terwarna hijau. Sel vegetatif bakteri ini kemudian
diwarnai dengan warna pembanding safranin. Dinding sel yang
menyerap safranin terwarna merah muda sementara spora tetap terwarna
hijau.
4. Pewarnaan Nukleus
Pewarnaan nukleus merupakan pewarnaan yang tujuannya untuk
mewarnai nukleus saja. Salah satu teknik pewarnaan nukleus yang
banyak digunakan yaitu teknik pewarnaan hematoksilin. Hematoksilin
akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan
senyawaan lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga. Jenis
hematoksilin yangsering dipakai adalah mayer, delafied, Erlich, Bullard
dan Bohmer, sedangkan counter staining yang dipakai adalah eosin,
safranin, dan phloxine.
Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa, artinya zat ini
mewarnai unsur basofilik jaringan. Hematoksilin memulas inti dan
strukutur asam lainnya dari sel (seperti bagian sitoplasma yang kaya-
RNA dan matriks tulang rawan) menjadi biru. Eosin bersifat asam
sehingga akan memulas komponen asidofilik jaringan seperti
mitokondria, granula sekretoris dan kolagen. Eosin mewarnai
sitoplasma dan kolagen menjadi warna merah muda. Oleh karena itu
prinsip dari pewarnaan adalah terjadinya afinitas antara jaringan dengan
bahan pewarna, baik secara langsung, yaitu bahan cat dengan jaringan
dapat berikatan secara langsung, atau secara tidak langsung, yaitu bahan
cat dengan jaringan tidak dapat berikatan secara langsung, kecuali diberi
bahan perantara yang biasa disebut sebagai mordan (Setiawan, 2016).
Hasil pembacaan atau standar pengecatan hematoksilin-Eosin
(HE) yang baik (3+) menunjukan warna biru terang pada inti sel, warna
merah (eosin) pada sitoplasma dan jaringan ikat serta warna pada
preparat seragam (Ariyadi et al. 2017).

E. METODE PENELITIAN
Waktu Pelaksanaan :
Studi literatur : 1 April 2021 –
Alat dan Bahan :
1) Alat tulis
 2) Jurnal
3) Makalah
4) Referensi Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
5) Komputer/Laptop
6) Handphone
7) Sambungan Internet
Prosedur Kerja :
Kegiatan : Studi literatur
Mengumpulkan literatur (jurnal, ebook, buku, dll) mikrobiologi mengenai
definisi, tujuan, macam-macam teknik, serta prosedur kerja pewarnaan
bakteri dalam praktikum Mikrobiologi

Mengkaji makna pewarnaan bakteri kemudian mengidentifikasi tujuan

pewarnaan bakteri, macam-macam teknik pewarnaan bakteri serta prosedur
kerja pewarnaan bakteri yang digunakan dalam praktikum Mikroorganisme

Menyusun dan menampilkan hasil kajian literatur dengan metode deskriptif,

sedangkan penyusunan hasil kajian mengenai prosedur kerja ditampilkan
dengan diagram alir agar lebih mudah dipahami

Menyusun kesimpulan dari hasil dan pembahasan kajian studi literatur yang
telah dilakukan
F. HASIL DAN PEMBAHASAN

Kegiatan 1 : Pewarnaan Sederhana dan Differensial

Tabel 1. Perbedaan Antara Pengecatan Sederhana dan Differensial

Kajian Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Differensial
Pewarnaan yang hanya menggunakan satu jenis zat Pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu jenis
Definisi
pewarna. zat pewarna
Memberikan perbedaan yang kontras antara bakteri dan Mendifferensiasi bakteri golongan gram positif
latar belakang. Pewarnaan sederhana dilakukan ketika dengan gram negatif berdasarkan ketebalan dinding
Tujuan
kita ingin mengetahui informasi tentang bentuk dan selnya.
ukuran sel bakteri.
Prinsip dasar pewarnaan ini adalah karena adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan
senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan asam dan
pewarna basa.
Prinsip Dasar
 Pewarna asam : terjadi apabila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral
dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan
ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh
pewarna asam misalnya: tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat, eosin, dll.
 Pewarna basa : terjadi apabila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri
dan sel bakteri ini jadi berwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilen biru, kristal violet,
safranin, dan lain-lain.
Methylen Blue  Methylen blue 3 gram, Potasium
Hidroksida 10%, Etanol 95% 300 ml
Kristal Violet  kristal violet 2 gram, Etil Alkohol
Reagen 95% 20 ml, Amonium Oksalat 0,8 gram, Akuades steril
100 ml
Carbol Fuchsin  Fuchsin dasar 0,3 gram, Etanol 95%
10 ml, Fenol 5 ml, Akuades steril 95 ml
Interpretasi Hasil Methylen Blue  Biru
Kristal Violet  Ungu
Pewarnaan
Carbol Fuchsin  Merah

Tabel 2. Prosedur Kerja Pengecatan Sederhana

Skema

Metode Prosedur Kerja Interpretasi Hasil

Pewarnaan
1. Siapkan kultur murni bakteri yang akan diwarnai. Methylen Blue  Biru
Pengecatan
2. Secara aseptis ambil 1 ulasan jarum ose kultur bakteri pada permukaan kaca preparat Kristal Violet  Ungu
sederhana yang telah ditetesi akuades steril. Carbol Fuchsin  Merah
3. Ratakan hingga tidak ada ulasan yang menumpuk.
 4. Fiksasi panas dengan cara melewatkan kaca preparat diatas api bunsen sebanyak 3
kali. Fiksasi berfungsi untuk mematikan bakteri namun tetap mempertahankan bentuk
dan komponen sel.
5. Teteskan pewarna sederhana diseluruh permukaan ulasan dengan memilih salah satu
pewarna sesuai dengan kebutuhan. Tunggu pewarna agar meresap pada dinding sel
bakteri. Methylene Blue (60 detik), Crystal Violet (30 detik) dan Carbol Fuchsin (20
detik).
6. Bilas pewarna dengan akuades steril dan tunggu hingga cukup kering atau dapat
diserap dengan tissue.
7. Setelah kering, tutup permukaan ulasan dengan penutup kaca dan sampel siap diamati
dibawah mikroskop.

Tabel 3. Prosedur Kerja Pewarnaan Gram

Kajian Hasil
Tujuan Mendifferensiasi/membedakan bakteri golongan gram positif dengan gram negatif berdasarkan ketebalan dinding selnya.
Reagen Kristal violet, Gram iodine, atau lugol, safranin
1. Buat apusan dari tiap bakteri yang diberikan asisten.
2. Teteskan pewarna dasar crystal violet, biarkan terendam selama 1 – 2 menit.
3. Cuci kelebihan pewarna dengan air mengalir secara hati-hati.
4. Tetesi apusan dengan lugol atau Gram iodin, biarkan selama 1-2 menit.
5. Buang kelebihan reagen, jangan dicuci dengan air.
Prosedur
6. Rendam apusan dalam alkohol 96 % selama 30 detik.
7. Cuci apusan dengan air mengalir secara hati-hati.
8. Warnai dengan safranin selama 1 menit sebagai warna pembanding
9. Cuci kembali safranin yag berlebih di air mengalir lalu dikeringkan (blot)
10. Amati apusan di bawah mikroskop, gambar serta beri keterangan.
 Ilustrasi

Tabel 4. Prosedur Kerja Pewarnaan Tahan Asam

Kajian Hasil
Mengukur ketahanan sel yang telah diwarnai terhadap pencucian dengan asam. Ketahan-asaman dari bakteri dan
Tujuan
aktinomicetes tertentu berhubungan dengan banyaknya lapisan lemak.
Reagen Metilen blue, Karbol Fuhsin
1. Biakan Mycobacterium dan E. Coli
2. Larutan karbol fuhsin.
3. Larutan alkohol asam (64 ml HCl dalam 1000 ml larutan ethanol 95 %)
Alat & Bahan
4. Larutan metilen blue.
5. Penangas air dengan platform
6. Kaca objek
Prosedur 1. Buat apusan dari mycobacterium dan E. coli pada kaca objek dan fiksasi.
 2. Tempatkan sediaan pada plat kawat diatas penangas air.
3. Letakkan sepotong kertas isap pada apusan dan basahi dengan pewarna karbol fuhsin, dan jaga jangan sampai
apusan menjadi kering dengan terus memberi pewarna. Hindari pemberian zar warna berlebih. Lakukan hal ini
selama 5 - 10 menit.
4. Cuci dengan air.
5. Cuci dengan alkohol asam selama 10 - 30 detik.
6. Warnai dengan metilen blue selama 30 detik tanpa pemanasan.
7. Cuci dengan air dan keringkan.
8. Amati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. (ingat minyak imersi). Bakteri yang tahan asam akan
berwarna merah dan yang tidak tahan asam akan terwarna biru.

Ilustrasi

Tabel 5. Prosedur Kerja Pewarnaan Kapsula

Kajian Hasil
 Tujuan Untuk melihat apakah bakteri yang diamati berkapsul atau tidak.
Reagen Karbol fuhsin, Kristal violet
1. Biakan bakteri Alkaligenes viscous, atau Aerobacter aerogenes pada susu atau agar
2. Asam asetet glacial
3. Karbol fuhsin
Alat & Bahan 4. CuSO4 20 %
5. Larutan kristal violet 1 %
6. Larutan garam fisiologis
7. Gelas tutup
 Cara kerja (Metoda Welch)
1. Letakkan 5-6 loop biakan dalam susu pada kaca objek.
2. Tutup dengan asam asetat glacial, dan biarkan tidak lebih dari 10 detik.
3. Cuci dengan menuangkan karbol fuhsin, dan biarkan pewarna mengalir.
4. Cuci karbol fuhsin dengan larutan garam fisiologis ; jangan gunakan air.
5. Tutup dengan kaca penutup, dan amati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 kali (ingat memakai minyak
imersi). Kapsula akan berwarna merah muda dan sel berwarna merah tua.
Prosedur
 Cara kerja (Metoda Anthony)
1. Buat apusan sebagai berikut : Kalau digunakan kultur susu, sebarkan satu loop pada kaca objek dan biarkan kering.
Kalau digunakan kaldu dextrosa, atau kultur agar, letakkan setetes serum pada kaca objek dan suspensikan kultur ke
dalamnya, dan sebarkan sehingga membentuk lapisan tipis dan biarkan kering diudara.
2. Warnai dengan kristal violet 1 % selama 2 menit dan jangan dipanaskan.
3. Cuci dengan larutan CuSO4 20 %.
4. Keringkan dan amati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 kali dengan minyak imersi.
 Ilustrasi

Tabel 6. Prosedur Kerja Pewarnaan Flagella

Kajian Hasil
Untuk mewarnai bagian flagella. Flagella merupakan salah satu alat gerak bakteri. Flagella mengakibatkan bakteri dapat
Tujuan
bergerak berputar.
Reagen
Alat & Bahan
Prosedur
 Ilustrasi

Tabel 7. Prosedur Kerja Pewarnaan Spora

Kajian Hasil
Tujuan Untuk mengetahui ada atau tidaknya spora, bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetatif juga dapat diidentifikasi.
Malachite green 5%
Reagen
Safranin 0,5%
1. Biakan Bacillus subtilis berumur 48-72 jam dalam agar miring AN
2. Karbol fuchin dan metilen blue
3. Kaca objek bersih
Alat & Bahan
4. Ose
5. Bunsen atau lampu spiritus
6. Mikroskop, minyak emersi, kertas lensa dan xylol
1. Buat olesan bakteri pada kaca objek lalu letakkan kertas saring di atasnya. Letakkan kaca objek tersebut pada besi.
Genangi olesan bakteri dengan malachite green sambil dipanasi dengan nyala api kecil. Pemanasan diatur supaya
jangan sampai mendidih atau mengering. Dapat ditambahkan beberapa tetes malachite green selama pemanasan
untuk mencegah pengeringan. Olesan bakteri tersebut digenangi malachite green selama 5-10 menit.
Prosedur
2. Biarkan kaca objek sampai dingin selama 1 menit
3. Cuci kelebihan zat warna dengan air mengalir
4. Tetesi olesan bakteri dengan safranin selama 1 menit
5. Cuci dengan air mengalir
 6. Keringkan dengan kertas saring
7. Amati dengan mikroskop 1000x menggunakan minyak emersi

Ilustrasi