LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI I

PEWARNAAN GRAM

DISUSUN OLEH:

NAMA : NOVERYAN YUSUF MALOTA

NIM : B1D120055

KELAS : 2020 B

KELOMPOK : 3 (TIGA)

PROGRAM STUDI DIV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

FAKULTAS TEKNOLOGI KESEHATAN
UNIVERSITAS MEGAREZKY
MAKASSAR
2021
 LEMBAR PENGESAHAN
Judul Praktikum : Pewarnaan Gram
Nama : Noveryan Yusuf Malota
Nim : B1D120055
Hari/Tanggal : Kamis, 12 Agustus 2021
Kelompok : 3 (Tiga)
Rekan Kerja :1. Putri
2. Amelia Padanun
3. Almedia Ando
4. Johanis Sebastianus Letsoin
5. Sari Ulan
Penilaian:

Makassar, 13 Agustus 2021

Asisten Praktikan

Habibah Gali, S.Tr.Kes Noveryan Yusuf Malota

Nim: B1D120055

Dosen Pembimbing

Nirmawati Angria S.Si. M.Kes

NIDN: 091 8068 702
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bakteri merupakan mikroorganisme yang jumlahnya paling banyak dan

tempat hidupnya tersebar luas mulai dari tanah, air, tubuh manusia, sampai

hidup di organisme lain. Bakteri yang terdapat di dalam tubuh manusia

bersifat komensal, namun ada juga beberapa yang bersifat patogen. Bakteri

dapat diklasifikasikan dari bentuk tubuhnya menjadi tiga kelompok utama,

yaitu coccus (bulat), basil (batang), dan spirochaetes (heliks). Bakteri ini juga

dapat membentuk formasi sepasang (diplo), rantai (strepto), dan rangkaian

seperti anggur (staphilo). (Muthiah, dkk. 2017)

Bakteri memiliki ukuran yang sangat kecil berkisar 0,2 µm sampai 5 µm

sehingga tak dapat dilihat dengan mata telanjang. Struktur sel bakteri terdiri

dari dinding sel, membran sitoplasma, mesosom, sitoplasma, nukleosida,

ribosom, cytoplasmic inclusions, serta struktur eksternal yang terdiri dari

flagella, fimbrae, pili, glycocalyx dan kapsul. (Muthiah, dkk. 2017)

Dinding sel berfungsi untuk memberi bentuk dan kekuatan sel. Selain itu

juga berperan dalam memelihara tekanan osmosis cairan intraseluler sel.

Disamping itu yang tak kalah pentingnya adalah fungsinya dalam pembelahan

sel, pertumbuhan dan komunikasi antar sel. (Hafsan. 2011)

B. Tujuan Praktikum

Untuk mengidentifikasi dan mengamati bakteri gram positif dan bakteri

gram negatif melalui pewarnaan gram.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri berasal dari kata “bakterion” (bahasa Yunani) yang berarti tongkat

atau batang. Sekarang namanya dipakai untuk menyebutkan sekelompok

mikroorganisme yang bersel satu, berbiak dengan pembelahan diri, serta demikian

kecilnya sehingga hanya tampak dengan mikroskop. (Amini. 2017)

Bakteri merupakan salah satu mikroba yang tergolong prokariot, yaitu

suatu struktur sel yang tidak mempunyai inti sejati (inti yang tidak dikelilingi oleh

membran inti). Sedangkan komponen genetisnya terdapat di dalam molekul DNA

tunggal yang letaknya bebas di dalam sitoplasma (Hafsan. 2011)

Hampir semua sel prokariot mempunyai dinding sel kecuali Mikoplasma

atau Pleuropneumonia like Organism (PPLO) dan Archeae. Dinding sel berfungsi

untuk memberi bentuk dan kekuatan sel. Selain itu juga berperan dalam

memelihara tekanan osmosis cairan intraseluler sel. Disamping itu yang tak kalah

pentingnya adalah fungsinya dalam pembelahan sel, pertumbuhan dan komunikasi

antar sel. (Hafsan. 2011)

Dinding bakteri gram positif mengandung peptidoglikan kira-kira 90%

dari bobot kering dinding selnya. Namun biasanya terdiri dari selapis sel yang

sangat tebal (10- 50 nm). Selain peptidoglikan dijumpai pula berbagai polimer

polisakarida serta poliposfat yang dikenal sebagai asam teikoat (Latin “teichos”

berarti dinding). Asam-asam ini berupa polimer yang larut dalam air dan

berwujud dalam dua bentuk utama yaitu asam teikoat ribitol (alkohol gula dengan

5 atom C) dan asam teikoat gliserol (alkohol gula dengan 3 atom C) yang
dihubungkan satu sama lain melalui jembatan pospodiester. Karena satu ujung

asam teikoat yang terikat dengan membran dan berasosiasi dengan lipida dalam

membran sel, maka disebut pula sebagai asam lipoteikoat. Asam teikoat terletak

diantara membran sitoplasma dan lapisan peptidoglikan, dan mencuat ke atas

melalui selaput pori-pori pada membran sitoplasma dan peptidoglikan, fungsi

asam teikoat belum sepenuhnya diketahui, namun diduga mengatur pembelahan

sel yang normal. Hal ini dapat dilihat pada sel yang kehilangan kemampuannya

untuk ,membuat asam teikoat akan gagal/ cacat dalam pembelahan. (Hafsan.

2011)

Karena asam teikoat bermuatan negatif, maka lapisan ini juga

mempengaruhi muatan negatif pada permukaan sel. Di samping itu dengan

muatan negatif tersebut dapat membantu transformasi ion ke dalam atau keluar sel

serta berfungsi dalam penyimpanan Posfor. (Hafsan. 2011)

Dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai susunan kimiawi yang lebih

kompleks dibandingkan dengan dinding sel bakteri gram positif. Dinding sel

bakteri Gram negatif mengandung peptidoglikan yang terhitung rendah, jarang

melebihi 10% dari bobot kering dindingnya. Letak lapisan peptidoglikan mula-

mula dipertelakan oleh W. Weidel pada dinding sel Esherichia coli, yaitu terletak

pada lapisan dalam dari struktur lapis ganda dinding sel dan berupa kantong yang

sangat tipis. (Hafsan. 2011)

Struktur peptidoglikan pada kebanyakan bakteri Gram negatif yaitu

jembatan-jembatan tetra-peptida terjadi secara bebas dan bahkan tidak dijalin

sama sekali seperti halnya bakteri Gram positif. Di samping itu struktur
peptidoglikan pada umumnya hanya mengandung asam meso-diaminopimelat

(meso-DAP) tanpa ada lisin. (Hafsan. 2011)

Perbedaan utama pula yang dapat dijumpai pada dinding bakteri Gram

negatif ialah dinding selnya terdapat lapisan dinding luar yang disebut “outer wall

layer” yang mempunyai struktur menyerupai membran sitoplasma yang tidak

diketemukan pada dinding sel bakteri Gram positif. Oleh karena lapisan tersebut

menyerupai membran sitoplasma maka disebut sebagai lapisan “membran luar”.

Lapisan ini mempunyai susunan yang kompleks, tidak hanya terdiri dari

posfolipida saja seperti pada membran sitoplasma tetapi juga mengandung lipida,

protein, dan polisakarida. Lipida dan polisakarida ini berhubungan erat dan

membentuk struktur khas yang disebut Lipopolisakarida atau LPS. (Hafsan. 2011)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan

gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini

diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram

(1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. (Putri,

dkk. 2017)

Pada pewarnaan Gram, hasil yang didapat akan ditentukan dari komposisi

dinding sel bakteri. Pada pewarnaan Gram ini, reagen yang digunakan ada 4 jenis,

yaitu Kristal violet, iodine, alkohol dan safranin. Bakteri Gram positif akan

mempertahankan warna ungu dari kristalviolet sehingga ketika diamati dengan

mikroskop akan menunjukkan warna ungu sedangkan bakteri Gram negative tidak
dapat mempertahankan warna ungu dari Kristal violet tetapi zat warna safranin

dapat terserap pada dinding sel sehingga akan memperlihatkan warna merah. Uji

biokimia untuk gram negative adalah uji oksidasi sedangkan untuk gram positif

dapat dilakukan pewarnaan endospora (Putri, dkk. 2017)

Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)

ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif

menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk

mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding

sel mereka. (Putri, dkk. 2017).

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan

mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara

bakteri gram negative tidak. Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel.

Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol,

sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram

positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah

pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat

dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Putri,

dkk. 2017)

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil

ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau

ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah
muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan

pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Putri, dkk. 2017)

Bakteri gram positif menunjukkan warna biru atau ungu dengan

pewarnaan ini, sedangkan bakteri gram negatif menunjukkan warna merah.

Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah

didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif

mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam presentase lebih

tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum

pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar

permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan

menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan

pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol,

pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga

pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu, yang merupakan

warna dari Kristal Violet. (Putri, dkk. 2017)

 BAB III

METODE PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

1. Waktu

Hari : Kamis

Tanggal : 12 Agustus 2021

Waktu : 09:00-Selesai

2. Tempat

Adapun tempat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah

Laboratorium Mikrobiologi, Lantai 1, DIV Teknologi laboratorium medis,

Universitas Megarezky Makassar.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

a) Objek glass

b) Ose bulat

c) Gegep Kayu

d) Bunsen

e) Mikroskop

f) Pipet tetes

2. Bahan

a) Safranin

b) Kristal violet

c) Lugol
 d) Alkohol 96%

e) Oil emersi

f) Biakan

C. Prinsip Kerja

Dinding sel bakteri gram positif terdiri dari peptidoglikan yang tebal,

sedangkan dinding sel bakteri gram negatif mempunyai kandungan lipid yang

tinggi dibandingkan dinding sel bakteri gram positif. Pada bakteri gram

positif akan terbentuk persenyawaan kompleks Kristal violet yang tidak larut

dalam pemucat. Pada gram negatif memiliki kandungan Lipid yang tebal,

lipid ini akan larut dalam alkohol dan aseton yang digunakan sebagai larutan

pemucat, sehingga pori-pori dinding sel membesar dan meningkatkan daya

larut kompleks Kristal violet pada dinding sel bakteri gram negatif. Sehingga

penambahan zat warna terakhir menyebabkan sel bakteri warna merah,

karena persenyawaan kompleks Kristal violet larut dan dinding sel kemudian

mengikat zat warna terakhir

D. Cara Kerja

1. Diambil preparat dan ose bulat lalu fiksasi diatas api bunsen

2. Diambil biakan bakteri menggunakan ose bulat lalu dibuat ulesan diatas

preparat

3. Difiksasi di atas api bunsen dengan cara dilewatkan 2-3 kali

4. Diteteskan zat warna kristal violet menggunakan pipet tetes dan tunggu

selama 1 menit

5. Dicuci dengan air mengalir

6. Diteteskan larutan lugol dan tunggu selama 1 menit

7. Dicuci dengan air mengalir

8. Diteteskan dengan alkohol 96% sedikit demi sedikit hingga terlihat pucat

9. Dicuci dengan air mengalir

10. Diteteskan safranin dan tunggu selama 1 menit

11. Dicuci dengan air mengalir

12. Dibiarkan mengering lalu amati dibawah mikroskop dengan perbesaran

40x dan 100x (menggunakan oil emersi)

 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

Gambar 1.2 (Gambar pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x)

B. Pembahasan

Praktikum ini dimulai dengan melakukan sterilisasi pada ose dan preparat

dengan cara difiksasi diatas api bunsen. Sterilisasi bertujuan untuk

memusnahkan atau mengeliminasi semua mikroorganisme termasuk spora

bakteri yang resisten dalam alat yang akan digunakan. Langkah selanjutnya

yaitu mengambil biakan bakteri menggunakan ose bulat dan membuat ulasan

diatas preparat.

Dalam membuat ulasan tidak boleh terlalu tebal atau tipis. Pada olesan

yang tebal sel-sel yang terwarnai tidak akan memucat secepat seperti olesan

dengan kerapatan sel yang normal. Sehingga bakteri tetap terwarnai oleh

warna primer. Setelah itu di fiksasi di atas api dengan cara di lewat-lewatkan
tidak terlalu dengan api agar bakteri tidak mati. Fiksasi dalam tahap ini

bertujuan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur

selnya, mempermudah pengecatan dan sediaan tahan untuk sisimpan dika

belum dicat.

Tahap selanjutnya yaitu pemberian zat warna Kristal violet. Kristal violet

akan mewarnai seluruh permukaan bakteri gram positif dan negatif. Pewarna

ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri.

Selanjutnya ditunggu selama 1 menit lalu di bilas dibawah air mengalir dan

dikeringkan.

Selanjutnya pemberian larutan lugol’s iodine. Adanya larutan lugol

menyebabkan meningkatnya afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri.

Setelah pemberian lugol selanjutnya ditunggu selama 1 menit lalu dibilas

dibawah air mengalir dan dikeringkan.

Tahap selanjutnya pemberian larutan pemucat seperti alkohol 96%.

Pemberian alkohol 96% menyebabkan terbentuknya pori-pori pada gram

negatif yang memiliki banyak lapisan lemak (lipid larut dalam etanol). Dalam

pemberian larutan pemucat dilakukan sedikit demi sedikit dan jangan sampai

terlalu banyak (overdecolorize), setelah itu dicuci dengan air mengalir

Tahap terakhir yaitu pemberian zat pewarna lawan (counter stain), yaitu

safranin. Fungsi zat pewarna lawan adalah akan memberikan warna pink atau

merah pada bakteri gram negatif, sedangkan pada bakteri gram positif tetap

berwarna ungu. Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi

dan sitologi.
 Berdasarkan hasil pengamatan, ditemukan Bakteri yang berbentuk basil

dan berwarna merah. Sehingga bisa disimpulkan bahwa bakteri yang diamati

merupakan bakteri Gram Negatif. Contoh bakteri Gram Negatif berbentuk

batang (Enterobacteriacea) meliputi Escherichia, Shigella, Salmonella,

Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus. Beberapa organisme seperti

Escherichia coli merupakan flora normal dan dapat menyebabkan penyakit,

sedangkan yang lain seperti salmonella dan shigella merupakan patogen yang

umum bagi manusia

 BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikum kali ini, kami menemukan

bakteri dengan tanda berwarna merah dan berbentuk basil. Dari warna

morfologi pada tubuhnya dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut

merupakan bakteri gram negatif

 DAFTAR PUSTAKA

Amini, Galila Aisyah Latif. 2017. Mikrobiologi Kebidanan. Jakarta: Fakultas

Kedokteran dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Hafsan. 2011. Mikrobiologi Umum. Makassar: Alauddin Press
Muthiah, Hishna, dkk. 2017. Pemanfaatan Ekstrak Etil Asetat Buah Merah
Sebagai Zat Warna Primer Pada Teknik Pengecatan Negatif Kapsul
Bakteri. Bandung: J Ked Gi Unpad
Putri, Meganada Hiaranya, dkk. (2017). Mikrobiologi, Jakarta: Kemenkes RI.