BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Diketahui bahwa mikroba tersebar di alam, terdapat di lingkungan
mana saja dalam populasi campuran. Boleh dikatakan amat jarang mikroba
dijumpai sebagai satu spesies tunggal di alam. Untuk mencirikan dan
mengidentifikasikan suatu spesies mikroorganisme tertentu, pertama-tama
spesies tersebut harus dapat dipisahkan dari organisme lain, lalu
ditumbuhkan menjadi biakan murni.
Dalam mengisolasi suatu mikroorganisme, dilakukan dengan cara
yang

aseptis

untuk

menghindari

terjadinya

kontaminasi

dengan

mikroorganisme lain. Kebanyakan mikroorganisme dapat diisolasi dan

diinokulasi dalam biakan murni dengan memindahkan suatu koloni secara
cermat, mensuspensikan kembali dalam cairan dan menanamnya kembali
pada medium yang selektif.
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi
mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan
atau pewarnaan, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan
gram merupakan salah satu teknik pewarnaan atau pengecatan yang
dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi
bakteri. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan
sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan gram) dapat
digunakan untuk identifikasi awal. Dengan metode pengecatan gram,
bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan
Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding
selnya. Oleh karena itu, pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel. Dalam proses ini,
olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat
26

27

pewarna kristal violet, larutan iodium, larutan alkohol (bahan pemucat),

dan zat pewarna tandingannya berupa safranin.
B. Tujuan Praktikum
1. Praktikan memahami dan mampu melakukan proses isolasi dan
inokulasi mikroorganisme pada sampel bagian permukaan tubuh
(sela jari tangan) dengan media PCA (Plate Count Agar) dan
Media EMBA (Eosin Methylene Blue Agar).
2. Praktikan memahami dan mampu melakukan proses pengenceran
bertingkat.
3. Praktikan mengetahui morfologi bakteri secara mikroskopis
melalui metode pewarnaan gram.
C. Manfaat Praktikum
1. Mahasiswa

dapat

mengetahui

cara

isolasi

dan

inokulasi

mikroorganisme pada sampel bagian permukaan tubuh (sela jari

tangan) dengan media PCA (Plate Count Agar) dan Media EMBA
(Eosin Methylene Blue Agar).
2. Mahasiswa dapat melakukan pengenceran bertingkat.
3. Mahasiswa dapat mengetahui langkah-langkah morfologi bakteri
dengan metode pewarnaan gram.
4. Mahasiswa dapat mengetahui perbedaan bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif.
5. Mahasiswa

dapat

mengetahui

penggolongan

jenis

bakteri.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Isolasi
Dalam kehidupan sehari hari kita selalu berhubugan dengan berbagai
macam mikroorganisme, baik bakteri, kapang maupun khamir. Untuk
mempermudah dalam mempelajari jenis dan sifat mikroorganisme, maka
mikroorganisme tersebut harus diisolasi dari lingkungan dan dipelihara pada
medium yang sesuai untuk pertumbuhannya1.
Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau
memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan sehingga diperoleh kultur
murni atau biakan murni. Ada beberapa cara yang dapat dilakukan yaitu
dengan cara goresan (streak plate), cara tuang (pour plate), cara sebar (spread
plate), dan mikromanipulator2. Teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu
usaha untuk menumbuhkan mikroba diluar dari lingkungan alamiahnya.
Pemisahan

mikroorganisme

dari

lingkungannya

ini

bertujuan

untuk

memperoleh biakan bakteri yang sudah tidak bercampur lagi dengan bakteri
lainya, dan ini disebut dengan biakan murni3.
Di alam, populasi mikroorganisme tidak terpisah sendiri menurut
jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Dalam
laboratorium, populasi bakteri ini dapat diisolasi dari ekosistem tanah, air,
maupun udara. Selain itu, isolasi mikroorganisme pun dapat dilakukan dari
berbagai sampel bahan atau jaringan tubuh menjadi kultur murni yang terdiri
darisatu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat, dan kemampuan
biokimiawinya4.
Proses mengisolasi harus dilakukan dengan cara yang aseptiskarena
untuk menghindari adanya kontaminasi antara mikroorganismelainnya.
Mikroorganisme dapat diisolasi dan diinokulasi dalam biakanmurni dengan
cara memindahkannya lalu menanamnya kembali pada medium baru5.

28

29

B. Inokulasi
Teknik isolasi mikroba yaitu inokulasi yang merupakan suatu teknik
pemindahan suatu biakan tertentu dari medium yang lama ke medium yang
baru dengan tujuan untuk mendapatkan suatu biakan yang murni tanpa adanya
kontaminasi dari mikroba yang lain6.
Inokulasi penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah
pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru
dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman
bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam
hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari
terjadinya kontaminasi7. Teknik penanaman (inokulasi), teknik ini merupakan
lanjutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari
pengenceran mana saja tapi biasanya utuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni
tunggal) diambil bebrapa pengenceran terakhir.
Ada beberapa metode untuk menginokulasi bakteri sesuai dengan jenis
medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk
menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring,dilakukan metode gores
dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan
metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread
plate (metode sebar). Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu
menyimpan medium pada alat atau kontainer pada temperatur tertentu dan
periode tertentu, sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi
cocok untuk pertumbuhan bakteri. Metode gores atau streak plate
menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke permukaan medium agar
dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan, hanya sel-sel bakteri
tunggal yang terlepas dari ose dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri
tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang kemudian dapat dipindahkan
ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan murni8.

C. Media PCA (Plate Count Agar)

Mikroorganisme dapat hidup dimana saja seperti air, udara, darat,
termasuk di makanan. Pada beberapa kondisi, jumlah mikroorganisme harus

30

dibatasi, seperti mikroorganisme pada saluran pembuangan limbah dan juga

mikroorganisme pada makanan atau produk susu jumlahnya harus mengikuti
standar-standar

yang

sudah

ditetapkan.

Untuk

menghitung

jumlah

mikroorganisme tersebut biasanya sampel dari makanan atau produk susu atau
dari air limbah tersebut di uji menggunakan media Plate Count Agar (PCA)
dengan metode Total Plate Count (TPC)9.
Plate Count Agar (PCA) atau yang juga sering disebut dengan Standard
Methods Agar (SMA) merupakan sebuah media pertumbuhan mikroorganisme
yang umum digunakan untuk menghitung jumlah bakteri total (semua jenis
bakteri) yang terdapat pada setiap sampel seperti makanan, produk susu, air
limbah dan sampel-sampel lainnya yang juga biasanya menggunakan metode
Total Plate Count (TPC). Plate Count Agar (PCA) merupakan media padat,
yaitu media yang mengandung agar sehingga setelah dingin media tersebut
akan menjadi padat. Plate Count Agar (PCA) pertama kali dikembangkan
oleh Buchbinder, Baris, dan Goldstein pada tahun 1953 atas permintaan dari
American Public Health Association (APHA)9.
Komposisi Plate Count Agar (PCA) dapat bervariasi, tetapi biasanya
mengandung: 0,5% trypton, 0,25% ekstrak ragi, 0,1% glukosa, 1,5% agaragar. Plate Count Agar (PCA) mengandung glukosa dan ekstrak ragi yang
digunakan untuk menumbuhkan semua jenis bakteri. Plate Count Agar (PCA)
mengandung nutrisi yang disediakan oleh trypton, vitamin dari ekstrak ragi,
dan glukosa yang digunakan sebagai sumber energi bagi mikroorganisme
sehingga mendukung pertumbuhan dari bakteri. Plate Count Agar (PCA)
bukan merupakan media selektif karena media ini tidak hanya ditumbuhi
oleh satu jenis mikroorganisme tertentu9.

D. Media EMBA
EMB Agar adalah media yang digunakan untuk mengetahui ada atau
tidaknya bakteri coliform di dalam suatu sample. Media Eosin Methylene
Blue Agar ini mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi
untuk membedakan mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S.
aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa

31

menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam.

Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna10.
Fungsi dari eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan
warna. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal, kuman
lain bisa juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp. Hal ini
dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk
mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli10.
Media EMBA adalah medium selektif dan diferensial digunakan
untuk mengisolasi coliform fecal. Eosin Y dan metilen blue adalah
pewarna indikator pH yang bergabung untuk membentuk endapan ungu gelap
pada pH rendah (asam), mereka juga berfungsi untuk menghambat
pertumbuhan organisme
laktosa
yang

yang

berfungsi sebagai

paling

sumber

Gram
karbohidrat

positif.

Sukrosa

dapat

dan

difermentasi

mendorong pertumbuhan coliform. Fermentor yang kuat dari laktosa

atau sukrosa akan menghasilkan

jumlah

asam

yang

cukup

untuk

membentuk kompleks warna ungu tua. Pertumbuhan organisme ini akan

muncul berwarna ungu tua sampai hitam. Escherichia coli, suatu fermentor
yang kuat, sering menghasilkan warna koloni hijau metalik. Fermentor
lambat atau lemah akan menghasilkan koloni merah muda mukoid atau
berlendir. Biasanya koloni berwarna atau tidak berwarna menunjukkan
bahwa organisme fermentor

laktosa

atau

sukrosa

terserbut

bukan

merupakan coliform fecal11.

E. Bakteri
Bakteri adalah salah satu golongan organisme prokariotik (tidak memiliki
selubung inti). Bakteri sebagai makhluk hidup tentu memiliki informasi
genetik berupa DNA, tapi tidak terlokalisasi dalam tempat khusus (nukleus)
dan tidak ada membran inti. Bentuk DNA bakteri adalah sirkuler, panjang dan
biasa disebut nukleoi. Pada DNA bakteri tidak mempunyai intron dan hanya
tersusun atas akson saja. Bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal yang
tergabung menjadi plasmid yang berbentuk kecil dan sirkuler12.

32

Bakteri merupakan salah satu contoh organisme yang memilikisel tipe

prokariotik. Bakteri memiliki ukuran (panjang) berkisar antara 0,15-15.
Struktur sel bakteri terdiri dari bagian luar sebagai penutup sel dan
sitoplasma13. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua
organisme. Bakteri ada dimana-mana, di tanah, air, bahkan di dalam tubuh
makhluk hidup14.

F. Jenis Bakteri
Untuk memahami beberapa kelompok organisme, diperlukan klasifikasi.
Tes biokimia, pewarnaan gram, merupakan kriteria yang efektif untuk
klasifikasi. Hasil pewarnaan mencerminkan perbedaan dasar dan kompleks
pada sel bakteri (struktur dinding sel), sehingga dapat membagi bakteri
menjadi 2 kelompok, yaitu bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif12.
1. Bakteri Gram Negatif
a. Bakteri Gram Negatif Berbentuk Batang (Enterobacteriacea).
Bakteri gram negatif berbentuk batang habitatnya adalah usus
manusia dan binatang. Enterobacteriaceae meliputi Escherichia,
Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus).
Beberapa organisme seperti Escherichia coli merupakan flora normal
dan dapat menyebabkan penyakit sedangkan yang lain seperti
salmonella dan shigella merupakan patogen yang umum bagi
manusia.
b. Pseudomonas, Acinobacter dan Bakteri Gram Negatif Lain.
c. Vibrio Campylobacter, Helicobacter, dan Bakteri lain yang
berhubungan.
Mikroorganisme ini merupakan spesies berbentuk batang Gramnegatif yang tersebar luas di alam. Vibrio ditemukan didaerah
perairan dan permukaan air. Aeromonas banyak ditemukan di air
segar dan terkadang pada hewan berdarah dingin.
d. Haemophilus , Bordetella, dan Brucella
e. Yersinia, Franscisella dan Pasteurella

33

Berbentuk batang pendek Gram-negatif yang pleomorfik.

Organisme ini bersifat katalase positif, oksidase positif, dan
merupakan bakteri anaerob fakultatif.
2. Bakteri Gram Positif
a. Bakteri gram positif pembentuk spora : Spesies Bacillus dan
Clostridium
b. Bakteri Gram-positif Tidak Membentuk Spora: Spesies
Corynebacterium, Listeria, Propionibacterium, Actinomycetes.
c. Staphylococcus: Berbentuk bulat, biasanya tersusun bergerombol
yang tidak teratur seperti anggur.
d. Streptococcus: Merupakan bakteri gram-positif berbentuk bulat
yang mempunyai pasangan atau rantai pada pertumbuhannya12.

G. Penyakit Kesehatan Akibat Bakteri

1. Tuberkulosis Paru (TBC)
Tuberkulosis Paru atau TBC adalah penyakit yang di sebabkan
bakteri Mycobacterium tuberculosi dan Mycrobacterium bovis. Bakteri
tersebut mempunyai ukuran 0,5-4 Mikron x 0,3-0,6, micron dengan bentuk
tipis, lurus atau agak bengkok, bergranular atau tidak mempunyai
selabung, tetapi mempunyai lapisan luar tebal yang terdiri dari lipoid.
Penyakit ini di tularkan melaului udara (droplet nuclei) saat seorang pasien
TBC batuk dan percikan ludah yang mengandung bakteri tersebut terhirup
oleh orang lain saat bernafas.
2. Difteri
Difteria

merupakan

infeksi

akut

yang

disebabkan

oleh

Corynebacterium diphtheriae. Lesi primer biasanya terdapat pada

tenggorokan atau nasofaring dan dicirikan dengan adanya penyebaran
pertumbuhan pseudomembranosa keabu-abuan. Bakteri berbiak pada
tempat tersebut, dan mengeluarkan eksotoksin yang dibawa oleh darah ke
berbagai jaringan tubuh, menyebabkan hemoragik dan kerusakan nekrotik
pada berbagai organ. Strain C. diphtheriae toxigenik dan nontoxigenik
dapat menyebabkan penyakit, hanya strain yang menghasilkan toksin yang

34

menyebabkan manifestasi sistemik yang sering berhubungan dengan

penyakit yang berat atau mematikan.
C. diphtheriae merupakan bakteri bentuk batang ramping, grampositif, yang tidak tahan-asam

dan

tidak

membentuk

spora.

Sel

berukuran 0,5-1,0 (m. Pada apusan pewarnaan, terlihat sebagai sel

tunggal,

atau

palisade

(pagar)

dan

satu

dengan

yang lainnya

membentuk formasi sudut V atau L. Formasi mirip-huruf Cina ini

disebabkan oleh "snapping" pergerakan yang dilibatkan ketika dua
sel

membelah. Bentuk

C. diphtheriae secara umum berupa batang

ketika tumbuh pada media nutrisi yang lengkap.

3. Pertusis
Penyakit infeksi saluran napas akut yang terutama menyerang anakanak. Penyakit
(Haemophilus

ini

disebabkan oleh bakteri

pertusis).

Bordetella

pertusis

Bordetella
termasuk

pertusis
kelompok

kokobasilus Gram-negatif, tidak bergerak dan tidak berspora. Bakteri ini

memerlukan media untuk tumbuh seperti media darah-gliserin-kentang
(Bordet-Gengou)

yang

di

tambah

penisilin

untuk

menghambat

pertumbuhan organism lainnya. Bakteri ini berukuran panjang 0,5-1m

dan diameternya 0,2-0,3m. Penularan penyakit ini melalui droplet dan
sebagian besar bayi tertular oleh saudaranya dan kadang-kadang oleh
orangtuanya.
4. Tetanus Neonatoru
Tetanus adalah penyakit kekakuan otot (spasme) yg disebabkan oleh
eksotoksin (tetanospasmin) dari organism penyebab penyakit tetanus dan
bukan oleh organismenya sendiri. Penyakit ini disebabkan oleh bakteri
Clostridium tatani yang merupakan bakteri Gram-positif berbentuk batang
dengan spora pada sisi ujungnya sehingga mirip dengan pemukul
genderang. Bakteri tetanus bersifat obligat anaerob yaitu berbentuk
vegetative pada lingkungan tanpa oksigen dan rentan terhadap panas serta
disinfektan. Penularannya itu dengan cara Tetanus masuk kedalam tubuh
manusia biasanya melalui luka yg dalam dengan suasana anaerob (tanpa

35

oksigen) sebagai akibat dari kecelakaan, luka tusuk, luka oprasi, karies
gigi, pemotong tali pusat, dll.
5. Demam Tifoid
Demam Tifoid adalah infeksi akut pada saluran pencernaan yang di
sebabkan oleh bakteri Salmonella typhi. Salmonella adalah bakteri Gramnegatif, tidak berkapsul, mempunyai flagella dan tidak membentuk spora,
Penularan Penyakit adalah melalui air dan makanan. Bakteri salmonella
dapat bertahan lama dalam makanan. Penggunaan air minum secara masal
yang tercemar bakteri sering menyebabkan terjadinya KLB. Vektor berupa
serasngga juga berperan dalam penularan penyakit.
6. Kusta
Penyebab penyakit kusta adalah bakteri Mycobacterium leprae yang
berbentuk batang dengan ukuran panjang 1-8 mikron, lebar 0,2-0,5
mikron, biasanya berkelompok dan ada yang tersebar satu-satu, hidup
dalam sel, fan bersifat tahan asam (BTA). Bakteri kusta banyak terdapat
pada kulit tangan, daun telinga dan mukosa hidung.
7. Leptospirosis
Leptospirosis adalah infeksi akut yang di sebabkan oleh bakteri
leptospira. Penyakit ini di sebut juga Weil disease, Canicola fever,
Hemorrhagic jaundice, Mud fever, atau Swineherd disease. Genus
Lestospira

yang

termasuk

dalam

ordo

Spirochaete

dari

family

Trepanometaceae adalah bakteri yang berbentuk seperti benang dengan

panjang 6-12 m. spesies Leptospira interrogans adalah spesies yang
dapat menginfeksi manusia dan hewan. Infeksi pada manusia dapat terjadi
melalui kontak dengan air, tanah, dan lumpur yang tercemar bakteri,
kontak dengan organ, darah,dan urine hewan terinfeksi15.

H. Pencegahan
Tindakan pencegahan dapat dilakukan dengan vaksinasi, sterilisasi, dan
pasteurisasi, dan pengawetan bahan makanan.
1. Vaksinasi

36

Vaksinasi adalah pencegahan penyakit dengan pemberian vaksin,

bakteri yang sudah dilemahkan, sehingga tubuh menerima dapat terhadap
bakteri penyebab penyakit tertentu. Beberapa contoh vaksin untuk
pencegahan penyakit yang disebabkan oleh bakteri adalah vaksin kolera
untuk mencegah penyakit kolera, vaksin tifus untuk mencegah penyakit
tifus, vaksin BCG (Bacile Calmette-Guerin) untuk mencegah penyakit
TBC, vaksin DTP (Dipteria-Tetanus-Pertusis vaccines) untuk mencegah
penyakit difterie, pertusis (batuk rejan), dan tetanus), dan vaksin TCD
(Typus Chorela Disentry) untuk mencegah penyakit typus, kholera, dan
desentri.
2. Sterilisasi
Sterilisasi adalah pemusnahan bakteri misalnya dalam pengawetan
makanan. Tujuannya adalah untuk mendapatkan kondisi steril (suci hama),
metodenya disebut aseptis. Sterilisasi dapat dilakukan melalui pemanasan
dengan menggunakan udara panas atau uap air panas bertekanan tinggi.
Sterilisasi dengan udara panas menggunakan oven dengan temperatur 170
180C. Cara ini digunakan untuk mensterilisasikan peralatan di
laboratorium . Sterilisasi dengan uap air panas bertekanan tinggi dilakukan
dengan menggunakan alat yang disebut autoklaf, pada temperatur 115
134C. Autoklaf digunakan untuk sterilisasi bahan dan peralatan.
Sterilisasi pada umumnya digunakan pada industri makanan atau minuman
kaleng, penelitian bidang mikrobiologi, dan untuk memperoleh biakan
murni suatu jenis bakteri.
3. Pasteurisasi
Pasteurisasi adalah pemanasan dengan suhu 63 72 derajat celsius
selama 15 - 30 menit. Pasteurisasi dilakukan pada bahan makanan yang
tidak tahan pemanasan dalam suhu tinggi, misalnya susu. Sehingga untuk
mematikan bakteri patogen (Salmonella dan Mycobacterium) dari susu
dilakukan pasteurisasi. Dengan pasteurisasi, rasa dan aroma khas susu
dapat dipertahankan.
4. Pengawetan Bahan Makanan

BAB III
METODE PRAKTIKUM

A. Waktu Praktikum
Praktikum Isolasi dan Inokulasi Mikroorganisme dilaksanakan
pada Selasa, 19 April 2016 pukul 09.00 sampai selesai dan Praktikum
Morfologi Bakteri dilaksanakan pada Jumat, 22 April 2016 pukul 10.30
sampai selesai.
B. Tempat Praktikum
Praktikum Isolasi dan Inokulasi Mikroorganisme dilaksanakan di
Laboratorium Terpadu Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas
Diponegoro.
C. Alat yang digunakan
1. Alat Isolasi dan Inokulasi Bakteri
a. Tabung reaksi 6 buah
b. Cawan petri 4 buah
c. Jarum ose
d. Inkubator
e. Bunsen
f. Kompor
g. Kertas buram
h. Bulb 2 buah
i. Label
j. Tissu
k. Vortex
l. Pipet ukur 6 buah
m. Rak tabung reaksi
2. Alat Morfologi Bakteri
37

38

a. Mikroskop
b. Obyek glass
c. Desk glass
d. Jarum ose
e. Penjepit
f. Bunsen
g. Pipet tetes
h. Rak tabung reaksi
i. Tabung reaksi
j. Spidol
k. Beaker glass
l. Hairdryer
m. Korek api
n. Kapas
D. Bahan yang digunakan
1. Bahan Isolasi dan Inokulasi Bakteri
a. PCA media tegak
b. EMBA media tegak
c. NaCl fisiologis 0,9%
d. Kultur bakteri
e. Alkohol
f. Kapas
g. Korek api
h. Suspensi sample
2. Bahan Morfologi Bakteri
a. Biakan bakteri PCA 10-4
b. Pewarna Gram (Gram A = GV, Gram B = Lugol, Gram C =
Alkohol, Gram D = Air Fuchin)
c. NaCl fisiologis
d. Immersion oil
e. Alkohol

39

f. Aquadest
E. Teknik sampling
Pada praktikum isolasi dan inokulasi bakteri, sampel yang
digunakan yaitu bagian permukaan tubuh (sela jari tangan) dari salah satu
anggota. Waktu pengambilan sampel yaitu pada hari Selasa, 19 April 2016
pukul 08.30 WIB. Pada praktikum morfologi bakteri, sampel yang
digunakan adalah agar tegak PCA dan EMBA.
F. Metode yang digunakan
Isolasi menggunakan metode agar tuang, sementara inokulasi
menggunakan metode gores menggunakan loop ose dan menggoreskannya
ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan harapan pada
ujung goresan, hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan
menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni
tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar
didapatkan biakan murni. morfologi bakteri menggunakan metode
pewarnaaan gram. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi
dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan iodium,
larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa
safranin.

G. Skema Kerja
1. Pengambilan Sampel Mikroba Permukaan Tubuh (Tangan)
Tangan disemprot dengan alkohol 70 %

Disiapkan cotton bud dalam Na fisiologis steril

Tangan penjamah jangan disemprot dengan alkohol 70 %

Cotton bud dimasukkan ke Na fisiologis dan ditutup dengan

kapas
Sela sela jari diusap dengan cotton bud steril sebanyak 3 kali
lalu diberi label
Larutan sampel siap digunakan pada uji selanjutnya

40

Gambar 3.1 Skema Kerja Pengambilan Sampel Mikroba (Sela Jari

Tangan)

2. Teknik Pengenceran Bertingkat

5 tabung reaksi berisi 9 ml aquadest dalam keadaaan tertutup kapas
disiapkan dan diberi label pengenceran 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5

5 pipet ukur diberi label masing-masing 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5
dan suspensi

Bunsen dinyalakan dengan korek api

Tabung reaksi suspensi ditutup dan tabung reaksi pengenceran 10-1

dibuka dan mulut tabungnya didekatkan dengan api bunsen

1 ml suspensi diambil dengan pipet ukur dan dimasukkan ke tabung

pengencer 10-1 jika sudah, kedua mulut tabung dilewatkan pada api
dan ditutup kembali

Tabung reaksi pengencer 10-1 ditutup dan 10-2 dibuka dan

dipanaskan mulut tabungnya

1 ml pengencer 10-1 diambil dengan pipet ukur berlabel 10-1 dan

dipindahkan ke tabung pengencer 10-2 , lewatkan kedua mulut
tabung pada api dan ditutup

Hal yang sama dilakukan hingga pengenceran 10-5 menggunkana

pipet ukur berurutan sesuai tabel

Hasil pengenceran siap digunakan pada uji selanjutnya

41

Gambar 3.2 Skema Kerja Teknik Pengenceran Bertingkat

3. Skema Kerja Isolasi Mikroorganisme

Media tegak dipanaskan diatas kompos hingga cair

1 ml suspensi pengenceran 10-3, 10-4, 10-5 dimasukkan ke dalam

masing-masing cawan petri steril (3 buah cawan)

Media cair ditungkan ke masing-masing cawan petri yang berisi

suspensi

Media diratakan dengan menggoyangkan cawan perlahan

membentuk angka 8

Diamkan hingga media padat, semua perlakuan dalam suasana

aseptis

Cawan petri dibungkus kertas dalam posisi terbali dan diinkubasi 2

x 24 jam
Gambar 3.3 Skema Kerja Isolasi Mikroogranisme

4. Skema Kerja Inokulasi Biakan Murni

Media EMBA disiapkan dan bunsen dinyalakan

Tabung pengenceran 10-3 dipegang tangan kiri dan jarum

inokulasi dipegang tangan kanan

42

Jarum inokulasi dipanaskan hingga pijar lalu didinginkan

Jarum inokulasi dimasukkan pada tabung pengenceran 10-3

hingga membentuk gelembung pada jarum ose

Segera disentuhkan pada permukaan media baru, jangan

menekan media hingga rusak

Jarum inokulasi ditarik ke luar perlahan secara zig zag

Mulut tabung dipanaskan dan tabung disumbat kapas

Jarum inokulasi dibakar hingga pijar dan diletakkan pada

tempatnya

Cawan yang berisi media dibungkus dengan kertas buram dalam

posisi terbalik dan diinkubasi 2 x 24 jam

Diamati perubahannya
Gambar 3.4 Skema Kerja Inokulasi Biakan Murni

5. Skema kerja Morfologi Bakteri

a) Pembuatan Film
Objek glass dibilas alkohol, dikeringkan dan diberi tanda
bulatan dengan spidol

Diberi satu tetes NaCl fisiologis pada objek glass

43

Jarum ose dipanaskan hingga pijar, diangin- anginkan

Jarum ose digesekkan zig zag pada biakan bakteri PCA

10-4

Jarum ose yang sudah ada bakteri, diletakkan pada

tetesan NaCl fisiologis lalu diratakan

Dikeringkan dengan melewatkan di atas api hingga

kering
Gambar 3.5 Skema Kerja Pembuatan Film pada
Morfologi Bakteri

b) Pewarnaan Gram
Film ditetesi 1 tetes gram A (CGV) selama 30 detik

Dibilas dengan air dan dikeringkan dengan hairdryer

Ditetesi dengan 1 tetes gram B (Lugol) selama 30 detik,

dibilas dengan air dan dikeringkan dengan hairdryer

Ditetesi dengan 1 tetes gram C (Alkohol) selama 30

detik, dibilas dengan air dan dikeringkan dengan
hairdryer
Ditetesi dengan 1 tetes gram D (Air Fuchin) selama 30
detik, dibilas dengan air dan dikeringkan dengan
hairdryer

44

Preparat ditetesi dengan 1 tetes minyak imersi

Desk glass dipasang dan jangan sampai terdapat

gelembung udara

Preparat siap dilihat menggunakan mikroskop perbesaran

objektif 100x

Gambar 3.6 Skema Kerja Pewarnaan Gram pada

Morfologi Bakteri

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan
1. Isolasi dan Inokulasi Bakteri Mikroorganisme
Tabel 4.1 Hasil Pengamatan Praktikum Isolasi dan Inokulasi
Mikroorganisme
No

Pengamatan

1.

Isolasi

Sampel

Metode

Hasil

Bagian

Agar

Terdapat koloni

permukaan tubuh

Tuang

pada media agar

(sela jari tangan)

tegak, ada yang

dengan

berwarna putih dan

pengenceran 10-

kuning

,10-4, 10-5 media

PCA
2.

Inokulasi

Bagian

Media

Terdapat (sedikit)

permukaan tubuh

tegak

koloni bakteri

(sela jari tangan)

EMBA

berwarna putih

dengan

berbentuk bulat

pengenceran 10-3

Berdasarkan Tabel 4.1 pada isolasi bakteri setelah diberi

sampel dan pengenceran 10-3,10-4, 10-5 pada media PCA melalui
metode tuang, terdapat koloni pada media tegak. Pada inokulasi
bakteri setelah diberi sampel dan pengenceran 10-3

45

pada media

46

EMBA, terdapat koloni bakteri yang berwarna putih dan berbentuk

bulat.

Gambar 4.1 Pengenceran

Gambar 4.2 Hasil Isolasi Pada

10-3,10-4, 10-5

Media PCA 10-4

Gambar 4.1 Menunjukkan pengenceran yang dilakukan secara bertingkat

mulai dari 10-3,10-4, dan 10-5 . Sementara itu, Gambar 4.2 Menunjukkan hasil
isolasi pada salah satu pengenceran yaitu 10-4 terlihat koloni bakteri yang
berwarna putih dan kekuningan.
2. Morfologi Bakteri
Tabel 4.2 Hasil Pengamatan Praktikum Morfologi Bakteri
No Media Warna Bentuk
1.

Agar
tegak

merah

Batang

Gambar

Gram
Negatif

koma

PCA
10-4

Berdasarkan Tabel 4.2 Morfologi Bakteri menggunakan

media tegak PCA 10-4

yang kemudian setelah dilihat pada

mikroskop perbesaran 100x didapatkan gambar bakteri yang

47

berbentuk batang koma dan berwarna merah. Bakteri yang

berbentuk batang koma dan berwarna merah termasuk bakteri gram
negatif.
B. Pembahasan
1. Deskripsi Pengujian
a. Metode Isolasi dan Inokulasi
Sampel yang digunakan adalah bagian permukaan
tubuh (sela jari tangan). Suspensi sampel dilakukan dengan
pengenceran bertingkat (10-1 sampai 10-5). Proses isolasi
dan inokulasi dilakukan dengan cara aseptis untuk
menghindari kontaminasi silang. Dalam proses isolasi
mikroorganisme digunakan media PCA yang dituangkan ke
cawan petri dan di tuang suspensi pengenceran 10-3, 10-4
dan 10-5 lalu cawan tersebut dibungkus dengan kertas
buram dan diinkubasi 2 x 24 jam ke dalam inkubator.
Metode inokulasi menggunakan media EMBA dan
menggunakan suspensi pengenceran 10-3 . Jarum ose yang
sudah dipanaskan, dimasukkan ke tabung pengenceran dan
disentuhkan pada media EMBA dengan bentuk zig zag.
Lalu diinkubasi 2 x 24 jam ke dalam inkubator.
b. Metode Morfologi Bakteri
Metode yang digunakan dalam morfologi bakteri
yaitu dengan media PCA 10-4 karena dalam media EMBA
tidak ditemukan adanya bakteri. Media PCA 10-4
digunakan karena yang paling banyak ditumbuhi bakteri.
Pertama dilakukan pembuatan film dengan memindahkan
bakteri pada media PCA 10-4 ke objek glass dan ditetesi
dengan NaCl fisiologis lalu dikeringkan di atas api.
Kemudian dilakukan pewarnaan gram berturut turut dari

48

pewarnaan gram A (Kristal Violet), gram B (Iodium), gram

C (Alkohol) dan gram D (Safranin), selanjutnya ditetesi
dengan minyak imersi lalu preparat diamati dengan
menggunakan mikroskop (perbesaran 100x).
2. Gambaran umum sampel
Dalam praktikum ini, sampel yang digunakan adalah bagian
permukaan tubuh (sela jari tangan) penjamah. Pengambilan sampel
dilakukan dengan mengusap sela-sela jari menggunakan cotton bud
steril sebanyak 3 kali. Setelah itu, cotton bud dimasukkan ke Na
Fisiologis dan ditutup dengan kapas. Kemudian dilakukan
pengenceran dengan teknik pengenceran bertingkat sebanyak 5 kali
pengenceran (10-1 sampai 10-5). Pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5
dimasukkan ke dalam media PCA pada cawan petri yang akan
digunakan

untuk

isolasi

mikrorganisme.

Pengenceran

10-3

dimasukkan ke dalam media EMBA pada pada cawan petri yang

akan digunakan untuk inokulasi biakan murni. Mikroogranisme
pada PCA 10-4 diambil dan diletakkan pada preparat yang akan
digunakan untuk morfologi mikroorganisme.
3. Hasil Pengujian
a. Isolasi dan Inokulasi
Hasil praktikum isolasi mikroorganisme biakan
bakteri sampel sela jari tangan penjamah terdapat biakan
mikroorganisme yang berkoloni. Hal ini dapat dilihat pada
cawan dengan pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5 yang sudah
diinkubasi selama 2x 24 jam. Sedangkan hasil inokulasi
biakan murni terdapat sedikit biakan mikroorganisme
sehingga diasumsikan terdapat kesalahan saat praktikum.
b. Morfologi bakteri

49

Pada morfologi bakteri menggunakan media PCA

10-4 yang paling banyak ditumbuhi bakteri. Berdasarkan
hasil praktikum secara mikroskopis, dengan metode
pewarnaan gram didapatkan bahwa biakan bakteri memiliki
ciri-ciri yaitu bentuk bakteri batang berbentuk koma, warna
bakteri berwarna merah. Dari ciri-ciri tersebut menandakan
bahwa biakan bakteri pada media PCA 10-4 merupakan
jenis bakteri gram negatif.
4. Faktor - Faktor yang Mempengaruhi Pengujian
a. Saat pengambilan sampel inokulasi pada media EMBA
jarum ose, diduga gelembung telah menghilang terlebih
dahulu sebelum disentuhkan ke media EMBA, yang
menyebabkan sedikitnya bakteri pada media EMBA.
b. Adanya kontaminan karena kurang aseptik pada saat
praktikum sehingga menyebabkan bakteri kontaminan ikut
tumbuh.
5. Dampak
Bakteri yang hidup pada media PCA 10-4 termasuk ke
dalam bakteri gram negatif. Bakteri ini bersifat patogen, contoh
bakteri gram negatif adalah Escherichia, Shigella, Salmonella,
Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, dll yang dapat
menyebabkan penyakit pada manusia meliputi diare, salmonellosis,
dan sebagainya.

BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
1. Praktikum isolasi mikroorganisme menggunakan tangan penjamah
(sela jari tangan) sebagai sampel serta metode yang digunakan
adalah metode tuang. Isolasi mikroorganisme menghasilkan biakan
bakteri yang berkoloni ada yang berwarna kuning dan putih.
2. Praktikum inokulasi mikroorganisme biakan murni menggunakan
tangan penjamah (sela jari

tangan)

sebagai

sampel dan

menggunakan media tegak. Hasil inokulasi biakan murni

menghasilkan biakan bakteri yang kurang sempurna. Hal ini dapat
disebabkan beberapa kemungkinan seperti hilangnya gelembung
pada jarum ose sebelum disentuhkan zig zag pada media baru dan
kemungkinan lain disebabkan kurang terampilnya praktikan dalam
pengujian di laboratorium.
3. Praktikum morfologi bakteri menggunakan media tegak PCA
dengan pengenceran 10-4 . Pengamatan morfologi bakteri secara
mikroskopis melalui metode pewarnaan gram. Hasil dari praktikum
ini yaitu terbentuk biakan bakteri batang koma, warna yang terlihat
merah dan ciri-ciri tersebut menandakan bahwa biakan bakteri
termasuk golongan gram negatif.
B. Saran
1. Praktikan lebih memahami prosedur kerja sebelum melakukan
praktikum

agar

dapat

meminimalkan

kesalahan

pada

pelaksanaannya.
2. Dalam praktikum, semua harus aseptis untuk menghindari adanya
kontaminasi silang.
50

DAFTAR PUSTAKA

1. Rusli. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar. Makassar: Universitas

Muslim Indonesia. 2014
2. Buckel, KA. Ilmu Pangan. Jakarta: Universitas Indonesia. 2007
3. Dwyana, Zaraswati. Bahan Ajar Mikrobiologi Dasar. Makassar:
Universitas Hasanuddin. 2011
4. Saskia, Sinta; dkk. Praktikum Mikrobiologi Dasar. Makassar. 2006
5. https://www.academia.edu/16740977/LAPORAN_ISOLASI_DAN_INOK
ULASI_MIKROBIOLOGI_DASAR (Diakses tanggal 4 Mei 2016)
6. Ghoni, Achmad. Isolasi dan Inokulasi Bakteri. 2013
7. Dwidjoseputro. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. 1998
8. Oetomo, Hadi dan Ratna Sari. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta:
PT. Gramedia. 1990
9. http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/41660/4/Chapter%20II.pd
f (Diakses tanggal 4 Mei 2016)
10. EMB Agar. http://www.mediaagar.com/blog/emb-agar/. 2012 (Diakses
tanggal 4 Mei 2016)
11. http://digilib.unila.ac.id/1374/7/BAB%20II.pdf (Diakses tanggal 4 Mei
2016)
12. http://digilib.unila.ac.id/5690/11/13.BAB%20II.pdf (Diakses tanggal 4
Mei 2016)
13. Dwyana, Zaraswati. Buku Ajar Biologi Sel dan Molekular. Makassar:
Universitas Hasanuddin. 2014
14. Gana, D Mahata. Rahasia Bakteri. Jakarta: PT. Gramedia. 2008
15. http://www.necturajuice.com/berbagai-penyakit-yang-disebabkan-olehbakteri/ (Diakses tanggal 4 Mei 2016)

51

LAMPIRAN
1. Isolasi dan Inokulasi Mikroorganisme

Persiapan Pengenceran

Media PCA

Tahap Pengenceran

Pemasukkan larutan
pengencer ke cawan

Penggoyangan cawan

media PCA 10-3,10-4, 10-5

didiamkan hingga padat
52

Larutan di vortex

Pemasukkan media PCA ke

cawan

Pembungkusan cawan (posisi

terbalik)

Pengambilan media baru pembungkusan media EMBA

media EMBA

Penginkubasian media EMBA

dari dan PCA

2. Morfologi Bakteri

Objek glass dibilas alkohol

Buat bulatan

Digesekkan zigzag pada

diberi 1 tetes Na
fisiologis

jarum ose dipanaskan hingga

pijar

Objek glass dikeringkan Objek glass diwarnai Gram

Media PCA 10-4

A sampai D

53

Objek glass dibilasi air

Objek glass dikeringkan

A sampai Gram D

dengan hairdryer

Preparat ditetesi imersi

Desk Glass dipasang

54

Objek glass kering

Pengamatan pada mikroskop

55

56

57