BAB II

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL

Pada hasil isolasi mikroorganisme dalam praktikum dengan menggunakan sampel nugget
dan yakult, kita bisa lihat bahwa sampel nugget lebih banyak terdapat koloni dibandingkan
dengan yakult pada cawan petri, dikarenakan Yakult (Yakuruto) adalah
minuman probiotik mirip yogurt yang dibuat dari fermentasi skimmedmilk dan gula dengan
bakteri Lactobacillus casei. Karena L. casei Shirota dapat ditemui dalam sistem pencernaan,
Yakult dipromosikan sebagai minuman yang baik untuk kesehatan. Minuman yang mengandung
bakteri yang bermanfaat untuk menekan pertumbuhan bakteri jahat. Namanya berasal
dari jahurto, bahasa Esperanto untuk “yoghurt” (Suyitno, 1990).33 sedangkan sampel pada
nugget akibat terdapat bakteri yang banyak dikarenakan dalam beberapa penelitian pernah
ditemukan beberapa bakteri pada produk daging olahan, termasuk nugget, seperti Esherichia Coli,
Staphylococus aureus, Salmonella sp, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Clostridium
Perfingens, dan Bacillus cereus. Bakteri- bakteri ini secara umum dapat ditemukan pada produk
daging olahan maupun bia didapat dari kontaminasi lingkungan sekitar (Alterkruse, Hyman,
Klontz, et al, 2008; Akbar dan Anal, 2013;Yavas dan Bligin,2010;BPOM,2009)
Jadi jumlah colony pada bahan pangan nugget yang kelompok kami uji banyak
mengandung banyak bakteri, melebihi ambang batas SNI dikarenakan sebelum kami praktikum
dilap mikro sebelumnya sudah bahan pangan nugget disimpan disuhu ruang selama kurang lebih
24 jam dengan suhu yg tdk terkontrol
 PEMBAHASAN

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya

dalam suatu medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu
dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi
mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam
mikroorganisme saja. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan
dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel
yang tetap pada tempatnya (Krisno, 2011).

Isolasi suatu mikrobia ialah memisahkan mikrobia tersebut dari lingkungannya di alam
dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Isolasi harus diketahui cara-
cara menanam dan menumbuhkan mikrobia pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk
pertumbuhannya. Memindahkan bakteri dari medium lama kedalam medium yang baru
diperlukan ketelitian dan pengsterilan alat-alat yang digunakan, supaya dapat dihindari terjadinya
kontaminasi. Pada pemindahan bakteri dicawan petri setelah agar baru, maka cawan petri
tersebut harus dibalik, hal ini berfungsi untuk menghindari adanya tetesan air yang mungkin
melekat pada dinding tutup cawan petri (Alam dkk. 2013)

Bakteri mudah ditemukan di air, udara dan tanah. Mereka hidup dalam suatu koloni, baik
bersimbiose, bebas ataupun parasit pada makhluk hidup. Jumlah bakteri di alam sangat
melimpah dengan keragaman yang sangat tinggi. Untuk mempelajari kehidupan dan keragaman
bakteri, diperlukan suatu usaha untuk mengembakbiakkan mereka dalam skala laboratorium.
Pengembangbiakan ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri dari sumber isolat, seperti tanah,
udara, sisa makanan, dan lain-lain, dalam media yang mengandung nutrisi. Media pertumbuhan
bakteri sangat beragam, mulai dari media selektif, media penyubur, media diferensial, dll.
Masing-masing media memiliki fungsi berbeda dan digunakan tergantung tujuan dari praktikan.
Dalam mempelajari sifat pertumbuhan dari masing-masing jenis mikroorganisme, maka
mikroorganisme tersebut harus dipisahkan satu dengan yang lainnya, sehingga didapatkan kultur
murni yang disebut isolat. Kultur murni merupakan suatu biakan yang terdiri dari sel-sel dari
satu species atau satu galur mikroorganisme. Kultur murni diperoleh dengan cara isolasi
menggunakan metode tuang maupun gores (Elfita, 2010).
 Pengertian dan Tujuan Penggoresan Kuadran

Pada praktikum kali ini pengisolasian dilakukan dengan teknik cawan gores dan
menggunakan metode kuadran, yaitu membuat cawan terbagi menjadi kuadran-kuadran. Metode
ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh
hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari
pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan
terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan.Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang
benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Cara ini
dilakukan dengan membagi 3-4 cawan petri. Ose steril yang telah disiapkan diletakkan pada
sumber isolat , kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan petri berisi media steril.
Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal disatu cawan. Ose disterilkan lagi
dengan api bunsen. Setelah kering, ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya
pada sisi cawan ke dua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores. (Pelczar,
1986).

Berbagai macam mikroorganisme dapat ditemukan di alam dalam populasi yang

heterogen. Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan
satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam
mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba
akan membentuk suatu kolonisel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo,1996)

Dalam kegiatan mikrobiologi pembuatan isolasi dilakukan dengan cara mengambil

sampel mikroba dari lingkungan yang ingin diteliti. Dari sampel tersebut kemudian
dikultur/dibiakan dengan menggunakan media universal atau media selektif, tergantung tujuan
yang ingin dicapai. Untuk mendapatkan atau menumbuhkan jenis mikroorganisme tertentu, maka
dilakukan isolasi. Dengan isolasi inilah dapat diidentifikasi jenis bakteri tertentu baik dari
kelimpahan maupun morfologinya. Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau
memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya sehingga diperoleh kultur murni atau biakan
murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel
tunggal (Pelczar, 1986).

Tujuan dari pemindahan biakan untuk menguasai teknik pemindahan biakan bakteri dari
satu wadah ke wadah lain secara aseptik, sehingga hanya biakan murni yang diharapkan yang
tumbuh. Hal ini sangat penting dalam tahap awal pekerjaan isolasi mikroba terutama yang
berasal dari stok kultur (bukan dari substrat). Kegagalan dalam hal pemindahan biakan dapat
menyebabkan kontaminasi dari pertumbuhan mikroba yang tidak diharapkan (Dwidjoseputro,
1990).
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras
dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut
pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella Pneumonia
(Karmana,2008).

Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negatif,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Contoh dari bakteri
gram positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram
negatif misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan
gram, misalnya Mycobacterium sp, karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga
digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaantersebut sel bakteri
akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau (James, 2002).
 Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan
positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif
banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma, sewaktu proses pewarnaan
muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro, 2005).

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan
pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan
negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai
bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna
terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan
(Dwidjoseputro, 2005).

Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut

pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang
bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan
negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan
mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan
melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro, 2005).

Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna dasar
(Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif terlihat berwarna ungu
karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat, sedangkan sel Gram negatif
mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah membesar dan Kristal violet mudah
larut saat pencucian alkohol (Fardiaz, 1989).

Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk membedakan
bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur dengan tetesan air steril pada
gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas obyek sehingga membentuk lapisan tipis dan
difiksasi. Dengan kristal violet olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan air
mengalir, dan dikering anginkan. Diberi yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir
dan dikeringanginkan. Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes
sampai zat warna ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikering anginkan.
Kemudian digenangi lagi dengan safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan dibiarkan kering di
udara. Warna merah pada olesan bakteri menujukkan bakteri gram negatif dan jika warna ungu
menunjukkan bakteri gram positif (Pelczar, 2007).

Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu pewarnaan Gram
(Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan anggota- anggota dominan bakteria ke
dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif memiliki
dinding sel yang lebih sederhana,dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel
bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih
kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gramnegatif mengandung lipopolisakarida,
yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan
penyakit,spesies gramnegatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-
positif. Lipopolisakarida yang terdapat pada dinding sel bakteri gram negatif sering bersifat
toksik (racun), dan membran bagian luar membantu melindungi bakteri gram-negatfi patogen
melawawn sistem pertahanan inangnya. Lebih jauh, bakteri gram negatif umumnya lebih resisten
terhadap antibiotik dibandingkan dengan gram-positif karena membran bagian luar itu
mengahalangi masuknya obat-obatan ( Campbell, 2003 ).

Bakteri Gram Positif adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan lapisan
peptidoglikan yang tebal. Bakteri ini akan berwarna ungu jika diwarnai dengan pewarnaan Gram.
Contohnya Neisseria gonnorrhoaeae, Treponema pallidum, Vibrio Cholerae dan Bacillus subtilis.
Sedangkan Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan lapisan
peptidoglikan yang tipis. Bakteri ini akan berwarna merah muda atau merah, kila diwarnai
dengan pewarnaan gram. Contohnya Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli (Aryulina, 2004).
 Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan
bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994).

Kristal violet Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam , dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan
terlihat berwarna ungu.komposisi dari kristal violet adalah Kristal violet 2 gram,Alkohol 95% 20
ml,Aquadest 80 ml,Amonium oksalat 0,8 gram. Hal ini sesuai dengan pernyataan Entjaang
(2003), bahwa kristal violet merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada
mikroba.

Iodin merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna
primer yang diserap mikro-organisme target. Pemberian iodin pada pewarnaan gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Cara pembuatan larutan ini
yaitu, Pertama iodium dihaluskan dengan kalium iodide, kemudian dicampurkan dengan aquades
hingga rata. Lalu dimasukkan kedalam botol. Hal ini sesuai pernyataan Purwoko (2010), yang
menyatakan bahwa larutan iod merupakan pewarna mordan, yaitu pewarna yang berfungsi
memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian iodin pada
pewarnaan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh mikroba.

Pewarnaan gram dengan penambahan safranin menyebabkan sel bakteri berwarna

merah. Fungsi safranin yaitu sebagai pembeda (kontras) terhadap warna kristal violet-iodium.
Komposisi dari safranin adalah Safranin 0,25 gram, Alkohol 95% 10 ml, Aquades 90 ml. Hal
ini sesuai dengan pernyataan Entjaang (2003), bahwa safranin merupakan pewarna tandingan
atau pewarna sekunder untuk memberi warna merah jambu pada sel bakteri gram negatif dan
memberikan warna pada mikroorganisme non target.

Alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel
bakteri (mikroorganisme). Alkohol memberikan dampak pada saat pewarnaan gram, jika saat
bakteri dibilas dengan alkohol , alkohol akan melarutkan lapisan lipid pada dinding sel. Bakteri
gram negatif yang dinding selnya tersusun dari lapisan lipid yang tebal maka akan larut dalam
alkohol. Hal ini sesuai dengan pernyataan Purwoko (2010), yang menyatakan bahwa alkohol
merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna
pada sel bakteri (mikroorganisme).

Larutan aquades berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada
sel mikroba. Aquades merupakan air hasil destilasi atau penyulingan. Aquades dapat dikatakan
sebagai air murni atau H2O Hal ini sesuai dengan pernyataan Purwoko (2010), yang menyatakan
bahwa alkohol merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan
kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme).
Pada metode pewarnaan gram juga dikenal fiksasi, fiksasi yaitu proses yang dilakukan untuk
membunuh mikro-organisme secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan
bentuk dan strukturnya. Fiksasi dilakukan dengan cara memanaskan preparat pada api bunsen
namun tidak sampai pada pijarannya. Hal ini sesuai dengan Gunarso (1986) yang menyatakan
bahwa tujuan fiksasi adalah menghentikan proses metabolisme secara cepat, mencegah
kerusakan jaringan, mengawetkan komponen-komponen sitologis dan histologis, mengawetkan
keadaan sebenarnya, mengeraskan materi-materi yang lembek sehingga akan terjadi
koagulasi protoplasma maupun elemen-elemen di dalam protoplasma, jaringan dapat diwarnai
sehingga bagian-bagian dari jaringandapat mudah dikenali. Secara ringkas fiksasi terdiri dari dua
proses yang jelas, yaitu mematikan dan menetapkan

Cat Gram

Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D. Masing-
masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing
cat Gram, adalah sebagai berikut :

1. Cat Gram A
Cat ini terdiri atas :

Kristal violet : 2 gram

Etil alkohol 95 : 20 ml

Ammonium oksalat : 0,8 gram

Akuades : 80 ml

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat
primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua
mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.

2. Cat Gram B
Cat ini terdiri atas :

Yodium : 1 gram

Kalium Yodida : 2 gram

Akuades : 300 ml

Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia
yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian
cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).

3. Cat Gram C
Cat ini terdiri atas :

Aseton : 50 ml

Etil alkohol 95 % : 50 ml

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat
pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :

 Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol.
Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat
demikian disebut bakteri Gram positif.
 Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat
dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan
sebagai bakteri Gram negatif.
4. Cat Gram D
Cat Gram D terdiri atas :
Safranin : 0,25 gram

Etil alkohol 95 % : 10 ml

Akuades : 90 ml

Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk
memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang
berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :

 Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A
sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D.
 Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh
cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.
 DAFTAR PUSTAKA

 Suyitno. 1990. Bahan-Bahan Pengemas. PAU. UGM, Yogyakarta

 Alam, M.S, Sarjono P.R, Aminin, A.L.N. 2013. Isolasi Bakteri Selulolitik Termofilik
Kompos Pertanian Desa Bayat, Klaten, Jawa Tengah. Chem Info. No.1(1) :
190-195.
 Elfita, Muharni, Munawar, Salni, dan Ade Oktasari. 2010. Senyawa Antimalaria dari
Jamur Endofitik Tumbuhan Sambiloto (Andographis paniculata Nees). Jurnal Natur
Indonesia. No.13(2) : 123-129.
 Krisno, 2011. Peranan Mikroba. http://krisnoplames.blogspot.com/peranan-mikroba.html.
Diakses pada tanggal 23 Novenber 2013.

 Jimmo., 2008, http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht,.

diakses pada tanggal 14 April 2009, Makassar.
 Dwidjosaputro.2005.Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.
 Nirwati, Hera, _______, Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum
Mikrobiologi, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah
Mada, Yogyakarta
 Strohl, William A, Rouse,H, Fisher, BD, 2001, Lippincott’s Illustrated Reviews:
Microbiology, Lippincott William & Wilkins, USA

 Dwidjoseputro.1990 .Dasar Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan

 Pelczar, M.J, E. Chan.1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit UI Press.
 Sutedjo, M. 1996. Mikrobiologi Tanah. Jakarta :Rineka Cipta.