LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR

ACARA II
ISOLASI BAKTERI

Penanggung Jawab:
Adha Nuriana (A1F015009)
Adiluhung Ahsan (A1F015051)

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS PERTANIAN
PURWOKERTO
2016
I. PENDAHULUAN
 A. Latar Belakang
Mikroba berada dimana-mana dan tidak dapat dilihat secara kasat mata.
Pengamatan sifat-sifat seperti bentuk, susunan, permukaan, pengkilatan dan
sebagainya dapat dilakukan dengan pandangan biasa tanpa menggunakkan
mikroskop, pengamatan ini disebut pengamatan makroskopi. Populasi mikroba di
alam tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai
macam sel. Populasi bakteri ini di dalam laboratorium dapat diisolasi menjadi
kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologinya, sifat
dan kemampuan biokimiawinya. Supaya sifat-sifat tersebut tampak jelas, bakteri
perlu dibiakkan pada medium padat yaitu dengan cara isolasi bakteri.
Isolasi adalah kegiatan untuk memisahkan bakteri yang diinginkan dengan
bakteri pengkontaminan. Tahapan awal untuk isolasi adalah inokulasi. Inokulasi
adalah tahapan penanaman bakteri yang akan dikembangkan kedalam media.
Penanaman ini dapat menggunakan jarum ose maupun mikropipet. Alat yang
digunakan harus steril, sehingga benar-benar isolat murni yang didapat.
Mikroorganisme yang dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari
bahan nutrient. Nutrient tersebut terdiri dari NA (Nutrient Agar), PDA (Potato
Dextrose Agar), dan MEA (Malt Ekstrak Agar). Media yang digunakan tergantung
dari jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Perbenihan untuk
pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat
makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut.
Suatu hal yang menguntungkan adalah bahwa setiap mikroba yang berbeda
sifat genetiknya akan membentuk koloni dengan karakter yang berbeda, baik
ukuran, bentuk maupun warna koloni. Yang perlu diperhatkan adalah bahwa
koloni yang ada akan diambil harus terpisah dari koloni lainnya. Ini berarti bahwa
hasil goresan yang baik adalah yang dapat menghasilkan koloni-koloni terpisah
dengan jarak lebih 2 mm, sehingga mudah diambil.
 B. Tujuan
Mempelajari dan mempraktekkan beberapa tahapan dalam isolasi bakteri.
 II. TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme merupakan salah satu makluk hidup yang dapat hidup

pada ekosistem maupun dalam tubuh makluk hidup lainnya. Mikroorganisme
terdapat beberapa yang menguntungkan bagi makluk hidup lainnya tetapi ada juga
yang dapat merugikan bagi makluk hidup lainnya. Menurut habitatnya
mikrooganisme ada yang hidup di udara, tanah, tubuh makluk hidup, dan ada juga
yang hidup di air. Sedangkan menurut kebutuhan oksigennya mikroorganisme ada
yang aerob (membutuhkan oksigen) maupun ada juga yang anaerob (tidak
membutuhkan oksigen). Mikroba tanah yang bersifat anaerob biasanya terletak
pada lumpur yang tergenang air dan tidak ada oksigen yang cukup (Hindersah
2007).
Bakteri mudah ditemukan di air, udara dan tanah. Mereka hidup dalam
suatu koloni, baik bersimbiose, bebas ataupun parasit pada makhluk hidup.
Jumlah bakteri di alam sangat melimpah dengan keragaman yang sangat tinggi.
Untuk mempelajari kehidupan dan keragaman bakteri, diperlukan suatu usaha
untuk mengembakbiakkan mereka dalam skala laboratorium. Pengembangbiakan
ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri dari sumber isolat, seperti tanah,
udara, sisa makanan, dan lain-lain, dalam media yang mengandung nutrisi. Media
pertumbuhan bakteri sangat beragam, mulai dari media selektif, media penyubur,
media diferensial, dll. Masing-masing media memiliki fungsi berbeda dan
digunakan tergantung tujuan dari praktikan. Dalam mempelajari sifat
pertumbuhan dari masing-masing jenis mikroorganisme, maka mikroorganisme
tersebut harus dipisahkan satu dengan yang lainnya, sehingga didapatkan kultur
murni yang disebut isolat. Kultur murni merupakan suatu biakan yang terdiri dari
sel-sel dari satu species atau satu galur mikroorganisme. Kultur murni diperoleh
dengan cara isolasi menggunakan metode tuang maupun gores (Elfita, 2010).
 Isolasi suatu mikrobia ialah memisahkan mikrobia tersebut dari
lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam
medium buatan. Isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan
mikrobia pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya.
Memindahkan bakteri dari medium lama kedalam medium yang baru diperlukan
ketelitian dan pengsterilan alat-alat yang digunakan, supaya dapat dihindari
terjadinya kontaminasi. Pada pemindahan bakteri dicawan petri setelah agar baru,
maka cawan petri tersebut harus dibalik, hal ini berfungsi untuk menghindari
adanya tetesan air yang mungkin melekat pada dinding tutup cawan petri (Alam
dkk. 2013).
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba
adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari
campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan
menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu
koloni sel yang tetap pada tempatnya. Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari
satu jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan murni atau biakan
aksenik. Biakan yang berisi lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri)
dikenal sebagai biakan campuran, jika hanya terdiri dari dua jenis
mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi,
dikenal sebagai biakan dua-jenis (Alam dkk, 2013).
Isolasi bakteri dikarakterisasi dengan menumbuhkan pada medium dan
dilakukan pengamatan meliputi pertumbuhan koloni bakteri pada medium agar
miring yaitu bentuk pertumbuhan pada bekas goresan, pertumbuhan koloni bakteri
pada medium agar tegak yaitu bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan dan
pertumbuhan koloni bakteri pada medium agar lempeng yaitu bentuk, tepian,
elevasi, permukaan warna, diameter koloni dan konfigurasi. Berdasarkan hasil
identifikasi secara mikrobiologis maupun fisiologis melalui uji biokimia
ditemukan tujuh isolat bakteri yang termasuk kedalam bakteri patogen maupun
non patogen (Rahmaningsih, dkk. 2012).
Mikroorganisme tidak memerlukan banyak ruangan untuk
perkembangannya, sebab itu media buatan (agar) dapat dimasukkan ke dalam
sebuah tabung percobaan labu atau cawan Petri. Pada permulaannya tabung atau
cawan Petri harus dalam keadaan steril (bebas dari setiap mikroorganisme hidup)
lalu setelah itu dimasukkan mikrobia yang diinginkan, tabung atau cawan harus
dilindungi terhadap kontaminasi dari luar. Sumber utama pencemaran dari luar
adalah udara, yang banyak mengandung mikroorganisme yang berterbangan.
Bentuk cawan petri, dengan tutup yang saling menyelubungi, dirancang untuk
mencegah pencemaran udara (Alam dkk, 2013).
Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan
campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisah-
pisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media
agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya, juga
memungkinkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni, yaitu sekelompok
massa sel yang dapat dilihat dengan mata telanjang. Bahan yang diinokulasikan
pada medium disebut inokulum, dengan menginokulasi medium agar nutrient
dengan metode cawan gores atau media cawan tuang, sel-sel mikroorganisme
akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikroba individu
memperbanyak diri secara cepat sehingga dalam waktu 18-24 jam terbentuklah
massa sel yang dapat dilihat dan dinamakan koloni. Koloni dapat terlihat oleh
mata telanjang. Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam
mikroorganisme (Joddi, 2006).
Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir dengan
metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan, serta
micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak digunakan adalah
teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip
yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu
species dapat dipisahkan (Plezar, 2006).
Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan
menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan
harapan pada ujung goresan, hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose
dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni
tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar
didapatkan biakan murni. Metode tuang atau pour plate dilakukan dengan 2 cara,
yaitu dengan mencampur suspensi bakteri dengan medium agar pada suhu 50ºC
kemudian menuangkannya pada petridisk atau dengan menyemprotkan suspensi
pada dasar petridisk, kemudian menuang medium agar keatasnya dan diaduk.
Setelah agar mengeras, bakteri akan berada pada tempatnya masing-masing dan
diharapkan bakteri tidak mengelompok sehingga terbentuk koloni tunggal.
Metode sebar atau spread plate dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke
atas medium agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski.
Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh
menjadi koloni tunggal (Wati, 2013).
Biakan Agar Miring dan Agar Tegak Dapat dilakukan dengan cara
menggoreskan secaa zig-zag pada permukaan agar miring menggunakan jarum
ose yang bagian atasnya dilengkungkan. Cara ini juga dilakukan pada agar tegak
untuk meminimalisir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen.
Usah mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan dan untuk
menanam suatu spesies terdapat baberapa cara, yaitu: Penanaman dengan
penggoresan Penanaman lapangan Biakan agar tabung (Rusdimin, 2006).
Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari
bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada
banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan.
Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus
mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor
lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik (Buckle,
2007).

III. METODE
 A. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah Tabung reaksi runcing,
Cawan Petri Steril, Jarum Ose, Lampu Sriritus, dan Rak Tabung Reaksi.
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah Medium NA dan Sampel
sebagai Sumber Mikroba.

B. Prosedur Kerja
1. Metode Goresan

Medium NA steril disiapkan dengan suhu sekitar 45-50oC

Kemudian cawan petri dibungkus dan selanjutnya diinkubasikan

selama 2 hari.
Medium dituangkan kedalam cawan petri steril, diratakan dan
dibiarkan dingin dan memadat

1 ose bakteri diambil ( dari acara 1 dalam medium NA ) digoreskan

pada permukaan agar dalam cawan petri, selama digoreskan cawan
dibuka secukupnya.

Mikroba digores dengan cara goresan kuadran. Cawan petri dibagi

menjadi 4 bagian, digoreskan sebanyak 3 baris pada ¼ bagian
pertama. Kemudian goresan berikutnya pada ¼ bagian kedua
Setiap akan
sebanyak digunakan
3 bari jarumgoresan
menyambung ose dicelupkan dalam dimana
yang pertama, alkohol akhir
dan
dipijarkan,
goresan kemudian
pertama didinginkan
digunakan dengan
sebagai awal cara ditusukkan
goresan pada
kedua, demikian
bagian pigir agar dalam cawan.
seterusnya sampaiDemikian
¼ bagianpula jika goresan dipindah
ke empat.
dari bagian pertama ke bagian berikutnya.

Kemudian cawan petri dibungkus dan selanjutnya diinkubasikan

selama 2 hari.
2. Agar miring ( slant culture )

Disiapkan medium agar miring steril dalam tabung reaksi.

Diambil 1 ose bakteri yang telah murni (diambil koloni yang terpisah
dari lainnya) digoreskan secara zig-zag pada permukaan agar.
Goresan dimulai dari ujung tabung (bagian bawah) sampai akhir
medium (bagian atas) tabung reaksi ditutup kembali dengan kapas
dan palstik.

Di inkubasikan selama 2 hari

Hasil diamati dan di gambar.

3. Agar tegak (stab culture)

Disiapkan medium agar tegak steril dalam tabung reaksi.

 Diambil 1 ose bakteri dan tusukan ke dalam agar sepanjang kira-kira
¾ bagian. Jarum ose yang digunakan yang ujungnya runcing. Tabung
reaksi ditutup kembali dengan kapas dan plastik.

Diinkubasikan selama 2 hari

Hasil diamati dan digambar.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
No. Metode Hasil
1. Metode
Goresan/
Streak Plate

2. Metode Agar
Miring/ Slant
Culture

3. Metode Agar
Tegak/ Stab
Culture

B. Pembahasan
Pada Praktikum isolasi bakteri, medium yang digunakan yakni medium
NA. Medium NA berdasarkan konsistensinya merupakan medium yang berbentuk
padat (solid medium), karena dapat dipadatkan dengan adanya agar, yang dibuat
miring atau tegak. Berdasarkan susunan kimianya, medium ini merupakan
medium organik non-sintetik karena disusun dari bahan-bahan organik dan
susunan kimianya belum ditentukan secara pasti.
Medium NA berfungsi untuk menumbuhkan mikroba atau bakteri pada
permukaan sehingga mudah diisolasi dan diidentifikasi. Medium ini dapat dibuat
dalam 2 jenis, yaitu NA miring dan NA tegak. NA miring digunakan untuk
membiakkan mikroba sedangkan NA tegak digunakan untuk menstimulir
pertumbuhan bakteri dalam kondisi kekurangan oksigen. NA digolongkan pula
medium umum sebab dapat digunakan untuk menumbuhkan beberapa jenis
bakteri. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatannya adalah:
- Pepton, sebagai sumber utama nitrogen dan protein bagi mikroba.
- Beef ekstrak, sebagai sumber makanan, sumber karbon organik, nitrogen,
vitamin, dan garam mineral sebagai tempat pertumbuhan mikroba.
- Agar, berfungsi sebagai pemadat medium.
- Akuades, sebagai bahan pelarut dan untuk menghomogenkan larutan.
Menurut Amelia (2006) NA lebih bersifat umum sehingga mikroba banyak
tumbuh pada media ini.
Teknik isolasi mikroba adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba
diluar dari lingkungan alamiahnya. Mikroorganisme dapat diperoleh dari
lingkungan air, tanah, udara, substrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan
hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, jamur, kapang dll.
Populasi mikroba di lingkungan sangan beranekaragam sehingga dalam
mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh
koloni tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk
suatu tujuan penelitian misalnya untuk mengisolasi DNA mikroba yang dapat
mendeteksi mikroba yang telah resistem terhadap suatu antibiotic atau untuk
mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon.
1. Metode Goresan (streak plate)
Medium agar dicairkan, didinginkan pada suhu 45 C, dituang ke dalam
cawan petri steril (cawan gelas dengan garis tengah tiga inci) dan dibiarkan
sampai menjadi padat. Setelah itu diambil 1 ose bakteri dari biakan murni pada
acara 1 kemudian digoreskan pada permukaan agar selama menggores tutup
cawan dibuka secukupnya. Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri
menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah dilekatkan pada sumber isolat, kemudian
menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat
dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal di satu sisi cawan. Ose disterilkan
lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores
goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. Langkah ini dilanjutkan hingga
keempat sisi cawan tergores.
Pada metode ini didapatkan berbagai macam mikroba yang memiliki
karakteristik berbeda – beda.
2. Agar Miring
Metode slant culture ini (agar miring) menggunakan media NA disiapkan
dalam tabung reaksi dengan keadaan miring. Satu koloni bakteri diambil dari
acara I (bakteri makanan medium NA) dengan menggunakan jarum ose (ujungnya
berbentuk bulat) dan digoreskan dengan arah zig-zag dimulai dari bawah tabung.
Setelah itu diinkubasi selama 2 x 24 jam untuk melihat pertumbuhan bakteri.
Dalam percobaan yang dilakukan ada pertumbuhan bakteri yang terlihat di
permukaan agar. Dimana data yang didapat berdasarkan bentuknya adalah
spreading.

3. Agar tegak (stab culture)

Medium yang dibuat pada metode ini tidak memakai cawan petri steril akan
tetapi menggunakan tabung reaksi. Pada metode ini menggunakan koloni bakteri
dari acara I (bakteri minuman medium NA) , tanah, air sumur, air sungai, dan
udara. Medium NA disiapkan dalam tabung reaksi, kemudian 1 ose koloni bakteri
diambil dan ditusukkan dengan menggunakan jarum ose yang ujungnya runcing
sepanjang kira-kira ¾ bagian. Setelah itu tabung ditutup menggunakan kapas dan
plastik dan diinkubasi selama 2 hari. Setelah 2 hari inkubasi terdapat pertumbuhan
mikroba pada agar ditusukkan sebelumnya. Bakteri yang tumbuh pada koloni
minuman berbentuk plumose dan tidak membutuhkan O2 karena medium agar
tegak untuk bakteri annaerob.
 V. PENUTUP

A. Kesimpulan

Adapun kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan ini adalah sebagai berikut:

1. Manfaat dilakukan isolasi mikroba adalah untuk memisahkan atau

memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur
murni atau biakan murni.

2. Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi bakteri, dengan

menggunakan metode gores, metode tuang, agar miring, dan agar tegak

3. Pada proses isolasi bakteri dengan metode penggoresan diperlukan keahlian

dalam menggores media agar didapatkan biakan murni bakteri yang
diinginkan, karena penggoresan yang semakin melemah pada setiap
kuadranya akan menyaring atau mengisolasi secara tidak langsung pada jenis
bakteri tertentu sehingga metode ini akan memperoleh biakan murni pada
satu titik pada kuadran empat.

B. Saran
Seluruh pengguna laboratorium harus menjaga sanitasi laboratorium
agar alat yang digunakan steril dan praktikum dapat berjalan dengan lancar.
Dalam diktat semestinya diberi tambahan soal dan pembahasan agar praktikum
yang dilaksanakan dapat berjalan sesuai tujuannya.
 DAFTAR PUSTAKA
Alam, M.S, Sarjono P.R, Aminin, A.L.N. 2013. Isolasi Bakteri Selulolitik
Termofilik Kompos Pertanian Desa Bayat, Klaten, Jawa Tengah. Chem
Info. No.1(1) : 190-195.
Amelia,G., R, et. al. 2006. Isolasi dan Pengujian Aktivasi Enzim Amilase dan
Protease Mikroba dari Terasi Asal Kalimantan Timur. Bogor: Pusat
Penelitian Biologi.
Buckle. 2007. Mikrobiologi Terapan. Yogyakarta: Universitas Gajah Mada.
Candra, Joddi Iryadi. 2006. Isolasi dan Karakteristik Bakteri Asam Laktat Dari
Produk Bekasam Ikan Bandeng (Chanos chanos). Skripsi. Bogor: Institut
Pertanian Bogor
Dwiyana Z,. Nurhaedar. 2011. Mikroobiologi Dasar. Makassar: Universitas
Hasanuddin
Elfita, Muharni, Munawar, Salni, dan Ade Oktasari. 2010. Senyawa Antimalaria
dari Jamur Endofitik Tumbuhan Sambiloto (Andographis paniculata
Nees). Jurnal Natur Indonesia. No.13(2) : 123-129.
Hindersah, dkk. 2007. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Aerob dan Fungi dari
Lumpur Kolam Anaerob di Instalasi Pengolahan Air Limbah Bandung.
Jurnal Teknik Lingkungan. Vol 13( 2): 1-4.
Plezar.2006. Dasar-Dasar-Mikrobiologi. Jakarta: UI Press
Rahmaningsih, dkk. 2012. Bakteri Patogen dari Perairan Pantai dan Kawasan
Tambak di Kecamatan Jenu Kabupaten Tuban. Ekologia. 12 (1). 1-5.
Rusdimin. 2006. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.
Wati, Dwi Setiana, Rukmanasari Dwi Prasetyani. 2013. Pembuatan Biogas dari
Limbah Cair Industri Bioetanol Melalui Proses Anaerob (Fermentasi).
Semarang: Universitas Diponegoro.
 LAMPIRAN

Bakteri yang digunakan pada

mdium NA acara I Pengambilan koloni
bakteri

Pemindahan koloni bakteri ke

medium agar miring dan tegak
Agar tegak setelah
dimasukkan koloni bakteri
Agar miring setelah imasukkan Agar tegak setelah diinkubasi 2
koloni bakteri hari

Agar miring setelah diinkubasi 2 hari