PEMERIKSAAN KUALITAS PANGAN,

ISOLASI (BIAKAN) ANAEROB

DARI SAMPEL MAKANAN
(Makalah diselesaikan untuk Melengkapi Laporan Praktikum Mata Kuliah
Mikrobiologi Pangan, Semester III)

oleh:
Kelompok V
Kadek Dwi Antari

(P07131013011)

Darmayanti

(P07131013012)

Intan Dery

(P07131013013)

Rendra Prastia

(P07131013014)

Ni Luh Asri Asih

(P07131013015)

Luh Gede Julian Hardiyanti Pertiwi

(P07131013016)

Ni Wayan Riska Pratiwi

(P07131013017)

Komang Dwi Pradnyani Laksmi

(P07131013018)

Gede Aristana

(P07131013019)

Debby Santika Gunawan

(P07131013020)

KEMENTRIAN KESEHATAN RI
POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR
JURUSAN GIZI
DENPASAR
2014

A. Judul Praktikum
Pemeriksaan Kualitas Pangan, Isolasi (Biakan) Aerob dan Anaerob dari
Sampel Makanan.
B. Hari, Tanggal Praktikum
Senin, 13 Oktober 2014
C. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa dapat mengetahui ada atau tidaknya bakteri E.Coli dalam
makanan atau bahan pangan.
2. Mahasiswa mengetahui cara isolasi atau pembiakan aerob dan anaerob.
D. Dasar Teori
Isolasi mikroorganisme mengandung arti proses pengambilan mikroorganisme
dari lingkungannya untuk kemudian ditumbuhkan dalam suatu medium di
laboratorium. Isolasi mikroba juga merupakan upaya pembiakkan suatu jenis
mikroba tertentu yang diperoleh dari suatu sampel di dalam suatu media yang
spesifik, sehingga selanjutnya dapat dilakukan identifikasi dan konfirmasi. Setiap
mikroba memiliki kebutuhan akan zat pertumbuhan yang spesifik sehingga hal ini
dapat dijadikan acuan dalam pemilihan media untuk isolasi, identifikasi dan
konfirmasi.
Media spesifik yaitu media yang digunakan unutk mendiagnosis atau
menganalisis

metabolisme

suatu

mikroba.

Contohnya

adalah

Kosers

Citratemedium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam

sitrat sebagai sumber karbon. Pada umumnya media yang digunakan untuk
membiakkan mikroba mengandung air, sumber energi (protein dan karbohidrat),
zat hara (sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen dan hidrogen), serta
faktor penunjang pertumbuhan (seperti asam amino, vitamin).
Suatu media yang memenuhi kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan
melakukan aktivitasnya secara normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis
mikroba tertentu. Setiap media spesifik memiliki kandungan senyawa tertentu
yang dapat mendukung pertumbuhan mikroba tertentu tetapi menghambat
pertumbuhan jenis mikroba lainnya. Sebagai contoh Media MCA ( Mac Conkey
Agar) mengandung zat warna yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram
Positif, sedangkan bakteri Gram Negatif tetap tumbuh.

Proses isolasi ini menjadi penting dalam mempelajari identifikasi mikrobia, uji
morfologi, fisiologi, dan serologi. Sedangkan pengujian sifat-sifat tersebut di alam
terbuka sangat mustahil untuk dilakukan. Prinsip kerja isolasi bakteri cukup
sederhana yakni dengan menginokulasikan sejumlah kecil bakteri pada suatu
medium tertentu yang dapat menyusung kehidupan bakteria. Sejumlah kecil
bakteri ini didapat dari bermacam-macam tempat tergantung dari tujuan inokulasi.
Dalam kajian mikrobiologi yang berhubungan dengan sumber bakteri adalah
mikrobia tanah, air, makanan dan udara. Pemahaman mengenai bakteri yang
diinokulasikan merupakan hal yang wajib. Inokulasi bakteri termasuk pula di
dalamnya adalah prinsip untuk membuat lingkungan medium menjadi semirip
mungkin dengan medium aslinya. Pemahaman ini meliputi:

Sifat dan jenis mikrobia yang akan diisolasi

Tempat hidup/atau asal mikrobia tersebut
Medium yang sesuai untuk pertumbuhan
Cara inkubasi mikrobia
Cara menanam mikrobia

Perlakuan yang tidak sesuai terhadap isolat mikrobia dapat mengakibatkan

perkembangan kultur mikrobia hasil isolasi terhambat. Sebagai contoh apabila
yang diisolasi adalah bakteri acidofil namun dikembangkan dalam medium yang
netral maka pertumbuhan bakteri tidak akan maksimal atau malah akan
mati.Teknik dalam menginokulasi bakteri memiliki beberapa variasi metode
misalnya metode goresan (streak plate), metode taburan (pour plate), dan metode
apusan

(surface

plate).

Pemilihan

teknik

ini

didasarkan

pada

tujuan

penelitian/percobaan.
Apabila ingin mendapatkan kultur murni suatu mikrobia yang digunakan
adalah metode streak plate, karena hasil akhir metode ini adalah berupa kumpulan
sel-sel yang semakin jarang pada ujung streak sehingga dapat diambil bakteri pada
jumlah seluler (satu sel). Selain itu bakteri yang didapat seharusnya merupakan
bakteri yang memang ingin dibiakkan di kultur tersebut dengan kata lain bukan
bakteri kontaminan, sebab yang diambil/dicuplik adalah koloni bakteri yang
berada di atass treak yang dibuat dan bukan di luars treak. Kelebihan metode ini
adalah dapat segera diketahui adanya kontaminasi. Sedangkan kekurangannya

metode ini sulit dilakukan dan hanya dapat digunakan untuk menumbuhkan
bakteri aerob saja.
Metode

kedua

adalah

pour

plate.

Metode

ini

dilakukan

dengan

menginokulasikan sejumlah bakteri ke dasar cawan baru kemudian medium agar

cair dimasukkan dan dibiarkan memadat. Metode ini cocok digunakan apabila kita
ingin menguji apakah suatu koloni bakteri merupakan bakteri yang aerobik,
anaerob fakultatif, ataukah anaerob obligat. Pengujian ini dapat terjadi karena
hasil akhir metode pour plate adalah berupa pertumbuhan bakteri pada dasar
medium, tengah medium, dan pada permukaan medium. Bakteri yang terdapat
pada dasar medium mungkin adalah bakteri anaerob obligat, sedangkan bakteri
yang tumbuh pada bagian tengah medium adalah bakteri anaerob fakultatif, dan
bakteri yang tumbuh pada permukaan adalah bakteri aerob walaupun perlu
pengkajian lebih lanjut mengenai hal ini. Kekurangan metode ini adalah sulit
menentukan kontaminan dan kerapatan mikrobia karena jarak antar koloni terlalu
rapat.
Metode yang ketiga adalah surface plate. Metode ini cocok digunakan apabila
ingin mengetahui bentuk koloni alami dari suatu bakteri. Kelebihan teknik ini
adalah

mudah

dilakukan

dan

mudah

menghitung

kerapatan

mikrobia.

Kekurangannya sulit mengetahui kontaminasi, untuk mengetahuinya perlu

perlakuan kontrol.
Bakteri anaerob adalah jenis bakteri yang hanya mampu hidup pada kondisi
tidak ada oksigen. Bakteri akan mati bila terkena oksigen karena oksigen menjadi
toksik bagi bakteri ini. Habitat dari bakteri anaerob berada di dalam saluran
pencernaan (Escherichia coli) atau di bawah permukaan tanah (Paracoccus).
Respirasi anaerob yang umum dipelajari terjadi pada Escherichia coli yang
mampu melakukan respirasi ketika ada nitrat atau fumarat sebagai akseptor
elektron. Hal itu terjadi karena oksigen menghambat (represi) sintesis nitrat
reduktase atau fumarat reduktase. Jika E. coli menyintesis nitrat reduktase, nitrat
reduktase akan menghambat sintesis fumarat reduktase. Jadi ada hierarki sitokrom
pada respirasi E.coli yaitu dari sitokrom bo ke sitokrom bd (respirasi aerob) ke
nitrat reduktase dan fumarat reduktase (respirasi anaerob).

Bakteri aerob adalah bakteri yang membutuhkan oksigen untuk hidupnya. Bila
tidak ada oksigen, maka bakteri akan mati. Bakteri aerob menggunakan glukosa
atau zat organik lainnya (misalnya etanol) untuk dioksidasi menjadi CO 2 (karbon
dioksida), H2O (air), dan sejumlah energi. Yang termasuk bakteri aerob antara lain
Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrobacter, Methanomonas (pengoksidasi metan),
Hydrogenomonas, Thiobacillus thiooxidans, Acetobacter, dan Nocardia asteroides
(penyebab penyakit paru-paru).
E. Cara Kerja
1. Uji Perkiraan (Presumtive Test)
Media yang digunakan adalah media Lactosa broth, didalamnya diisi
dengan tabung durham. Diinkubasi selama 2x24 jam. Tabung durham
berfungsi sebagai penunjuk jika dalam sampel terdapat bakteri maka akan
menimbulkan gas. Jika pada praktikum ditemukan adanya gas maka
diduga adanya coliform.
2. Uji Penegasan (Confirmation Test)
Tabung LB yang positif dilanjutkan dengan penanaman ke media Brilian
Green Lactose Bile Broth (BGLB). Inkubasi pada suhu 350 C, 2 x 24 jam
3. Uji Pelengkap (Complete Test)
Dilanjutkan dengan penanaman ke media Eosin Methylen Blue Agar
(EMBA). Diinkubasi pada suhu 370

selama 18-24 jam. Kemudian

mengamati ada atau tidaknya kilap logam

F. Hasil Pengamatan
Gambar

Keterangan

Amplop anaerob sebagai

biakan anaerob

Sampel

makanan

yang

tidak mengandung E.Coli

(non fecal coli)

Sampel

makanan

yang

mengandung E.Coli (fecal

coli) yang ditandai dengan
adanya warna kilap logam
hijau pada biakan EMBA

Anaerobic

jars.

menempatkan

Untuk
banyak

sampel.

Tabung

Lactosa

broth

yang didalamnya terdapat

tabung Durham sebagai
tempat untuk meletakkan
sampel makanan.
Sampel makanan

yang

mengandung E.Coli akan

terdapat gelembung dalam
tabung durham.
Sampel

makanan

pada

tabung durham yang tidak

mengandung E.Coli

Sampel

makanan

pada

tabung

durham

yang

memiliki

gelembung

menandakan

adanya

E.Coli

Kotak

anaerob.

menenmpatkan

Untuk
satu

sampai dua sampel.

G. Pembahasan
Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran
pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri
patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fekal adalah bakteri
indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi
indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif
dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi Coliform jauh lebih
murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain. Contoh
bakteri coliform adalah, Esherichia coli dan Entereobacter aerogenes. Jadi,
coliform adalah indikator kualitas bahan pangan. Makin sedikit kandungan
coliform artinya, kualitas bahan pangan semakin baik.

Penyakit infeksi masih merupakan penyakit yang paling banyak diderita oleh
penduduk di negara berkembang, termasuk Indonesia. Penyakit infeksi
disebabkan oleh mikroba patogen dan bersifat dinamis. Di negara-negara
berkembang penyakit infeksi masih merupakan penyebab utama tingginya angka
kesakitan (morbiditas) dan angka kematian (mortalitas). Salah satu penyebab
terjadinya penyakit infeksi adalah bakteri oportunistik.

Bakteri oportunistik

merupakan bakteri yang hanya menyebabkan penyakit pada orang yang

mengalami penekanan imun yang lemah. Escherichia coli adalah salah satu contoh
bakteri oportunistik. Escherichia coli merupakan bakteri enteric yang terdapat
dalam usus dan biasanya ditemukan dalam jumlah kecil sebagai flora normal
dalam saluran pernafasan dan alat kelamin. Bakteri ini dikenal sebagai bakteri
oportunis yang dapat menyebabkan infeksi primer pada usus sekitar 5% - 10%,
infeksi nosokomial di rumah sakit dan juga infeksi saluran kencing pada wanita
90%. E. coli tergolong bakteri Gram Negatif, berbentuk batang yang tidak
membentuk spora, tidak tahan asam dan ukurannya 23 x 0,6 m. Bakteri ini
dapat ditemukan pada berbagai infeksi pada hewan dan merupakan agen primer
atau sekunder dari infeksi tersebut. Faktor virulensi E. Coli dipengaruhi oleh
ketahanannya terhadap pagositosis, kemampuan perlekatan terhadap epitel sel
pernafasan dan ketahanannya terhadap daya bunuh oleh serum. E. coli yang
patogen ini mempunyai struktur dinding sel yang disebut pili, yang tidak
ditemukan pada serotype yang tidak pathogen.
Terdapatnya bakteri coliform dalam bahan pangan dapat menjadi indikasi
kemungkinan besar adanya organisme patogen. Bakteri coliform dibedakan
menjadi 2 tipe, yaitu fecal coliform dan non-fecal coliform. E. Coli adalah bagian
dari fecal coliform. Keberadaan E. Coli dalam makanan dapat menjadi indikator
adanya pencemaran makanan oleh tinja. E. Coli digunakan sebagai indikator
pemeriksaan kualitas bakteriologis secara universal dalam analisis dengan alasan :
1) E. Coli secara normal hanya ditemukan di saluran pencernaan manusia
(sebagai flora normal) atau hewan mamalia, atau bahan yang telah
terkontaminasi dengan tinja manusia atau hewan jarang sekali ditemukan
dalam makanan dengan kualitas kebersihan yang tinggi.

2) E. Coli mudah diperiksa di laboratorium dan sensitivitasnya tinggi jika

pemeriksaan dilakukan dengan benar.
3) Bila dalam bahan pangan tersebut ditemukan E. Coli, maka bahan pangan
tersebut dianggap berbahaya bagi penggunaan domestik.
4) Ada kemungkinan bakteri enterik patogen yang lain dapat ditemukan
bersama-sama dengan E. Coli dalam bahan pangan tersebut.
Penting untuk kita mengetahui adanya bakteri coliform atau tidak, yaitu
bila terjadi perubahan warna jadi kuning/orange dan terdapat gas pada tabung
durham maka pada sampel tersebut terdapat bakteri golongan coliform. Bila
belum mengalami perubahan warna maka bahan pangan dieramkan lagi 48 jam,
jika dalam 48 jam tidak ada perubahan warna maka bahan pangan tersebut tidak
mengandung bakteri coliform. Untuk mengetahui jumlah sel bakteri golongan
coliform yang terdapat dalam sampel bahan pangan, dilakukan metoda Jumlah
Perkiraan Terdekat atau Most Probable Number, untuk menentukan apakah bahan
pangan yang digunakan masih sesuai peruntukannya sebagai bahan pangan atau
tidak. Terdapat tiga tahap pengujian yang dilakukan yaitu :
1) Uji Praduga
Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan
pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung
berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS
(Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki komposisi Beef extract (3
gr),peptone (5 gr),lactos e (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya.
Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth
Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari
LBDS yaitu 5 gr.
Tanda positif pada tabel hasil pengamatan menunjukkan adanya bakteri
coliform dalam sample bahan pangan yang diuji. Indikator yang digunakan
dalam melakukan pengamatan ini adalah dengan melihat perubahan warna

yaitu menjadi kuning, ada gelembung dalam tabung durham dan gas pada
tabung reaksi, hal ini terjadi karena mikroba (bakteri Coliform) yang
tumbuh mampu memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas.
Gelembung gas menunjukan adanya metabolisme pada bakteri tersebut.
Tanda negatif (-) pada tabel menunjukkan tidak terdapatnya gelembung
dalam tabung durham dan gas pada tabung reaksi, hal ini menunjukkan
tidak terdapat aktivitas mikroba (bakteri Coliform) dalam tabung kultur.
Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan
gas) tiap serinya setelah diinkubasi. Untuk inkubasi 24 jam.

2) Uji Penguat
Pada uji ini digunakan medium EMB yang komposisinya terdiri dari
Pepton 10 gram, 5 gram lactose, 2 gram HPOK, 13.5 gram agar, 0.4 gram eosin Y,
0.065 Methylene blue. EMB(Eosin-Methylen Blue) merupakan media selektif
untuk isolasi dan diferensial bakteri enterik, karena kandungan eosin akan
menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif, sedangkan Methylen Blue
sebagai indikator fermentasi laktosa dan sukrosa yang ditunjukkan oleh adanya
perubahan warna hasil dari isolasi pada media EMB tampak adanya koloni
berbentuk bulat, sirkuler dan halus berwarna hijau metalic sheen. Fermentasi
laktosa dan sukrosa membentuk koloni berwarna gelap. Presipitat gelap ini
mungkin MB-eosionate yang dipresipitasi sebagai akibat pH rendah yang berada
di sekitar koloni yang memfermentasi laktosa atau sukrosa. Tidak terjadi warna
hijau metalik menunjukan tidak ditemukannya E.coli. Untuk lebih meyakinkan
adanya keberadaan E.coli pada sampel tersebut maka perlulah dilakukan uji
selanjutnya yaitu uji penyempurna.

3) Uji Penyempurna

Uji ini dilakukan untuk memperkuat dugaan bahwa pada sampel terdapat
bakteri E.coli. Pada uji ini dilakukan dua pengujian yaitu dengan menggunakan
LB dan tabung durham sedangkan yang kedua dengan menanam bakteri tersebut
pada NA agar miring sehingga setelah inkubasi selama 24 jam dapat diamati di
bawah mikroskop dengan terlebih dahulu melakukan pewarnaan gram. LB
digunakan untuk menguji kembali terbentuknya gas pada tabung durham sebagai
hasil fermentasi lactose oleh E.coli dan berdasarkan hasil percobaan pada tabung
reaksi terbentuk gelembung gas.
Adapun alat-alat yang digunakan dalam pemeriksaan kualitas pangan, isolasi
(biakan) aerob dan anaerob dari sampel makanan adalah :

Anaerobic jar adalah suatu alat yang digunakan untuk menciptakan

suasana anaerob buatan (suasana tanpa oksigen) dimana kondisi ini
dibutuhkan untuk perkembangan bakteri anaerob, cara untuk menciptakan
kondisi Anaerobic jar agar anaerob ada dua cara yaitu mengosongkan
udara dengan vakum atau dengan menggunakan gas generating kit.
Anaerobic jar bekerja dengan reaksi kimia yang menghasilkan gas
hidrogen. Dengan menggunakan paladium sebagai katalis, gas hidrogen
akan bereaksi dengan oksigen bebas di udara yang dihasilkan oleh air yang
bereaksi dengan gas generating kit. Reaksi ini mengambil oksigen dari
lingkungan

yang tertutup. Kemudian jar diinkubasi pada suhu yang

hangat 37OC. Anaerobic jar dalam menciptakan suasana anaerob

menggunakan katalis yang disebut dengan gas generating kit, dimana gas
generating kit adalah suatu bahan yang terdiri dari 3 kristal aktif, ketiga
kristal tersebut adalah Sodium borohydride, Asam sitrat, dan Sodium
bicarbonat, dimana bila ketiga kristal tersebut di reaksikan dengan air

(H2O) akan menghasilkan gas Hidrogen (H) dan Oksigen (O2).

Tabung
Durham
merupakan
alat
yang
digunakan

di

dunia mikrobiologi untuk mendeteksi produksi gas yang dihasilkan dari

mikroorganisme. Alat ini berukuran sangat kecil, ditempatkan pada tabung
reaksi yang telah berisi cairan pertumbuhan mikroorganisme dan zat
indikator yang dapat menandai terjadinya perubahan warna karena adanya

perubahan derajat keasaman dan gas yang dihasilkan. Produksi gas

dicirikan dengan terdapatnya gas di ujung tabung durham setelah
mikroorganisme diinokulasi dan diinkubasi. Penggunaan tabung durham
ini biasa dilakukan pada pengujian biokimia dalam identifikasi bakteri.
Penempatannya terbalik dalam tabung reaksi dan harus terendam

sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara).

Gas Generating Kit berfungsi sebagai penyerap oksigen yang ada. Di
dalam gas generating kit terdapat seperti kapsul, yang disebut indikator.
Apabila indikator tersebut berubah warna menjadi ungu, berarti
menunjukkan kondisinya telah anaerob.

H. Kesimpulan
Jadi dari hasil pembahasan yang kami lakukan, kami dapat
menyimpulkan bahwa :
1. Coliform digunakan sebagai indikator pencemaran makanan yang terdiri
atas Fecal coli (Escherichia coli) dan non fecal coli

(Enterobacter,

Klebsiella,Citrobacter)
2. Dalam makanan dan minuman tidak boleh ditemukan adanya E.Coli
3. Tahapan dalam isolasi atau pembiakan aerob dan anaerob yaitu Presumtive
test (uji perkiraan), Confirmation Test (Uji Penegasan), Complete test (Uji
Pelengkap).

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2013. Laporan Mikrobiologi, Pengenalan Alat. Tersedia pada

http://pharmacy-mikrobiologi.blogspot.com/2013/10/laporanmikrobiologi-pengenalan-alat.html. Diakses pada: 14 Oktober 2014.
Dwi.

2013.

Isolasi

Bakteri.

http://dwierwin.blogspot.com/p/isolasi-bakteri.html.

Tersedia
Diakses

pada:
pada:

14

Oktober 2014.
Murni, Dewi. 2014. Isolasi dan Identifikasi Escherichia. Tersedia pada :
http://veterinarydewi.blogspot.com/2014/01/isolasi-dan-identifikasiescherichia.html. Diakses pada : 14 Oktober 2014.
Nugraha.

2012.

Isolasi

Bakteri

Anaerob.

Tersedia

pada:

http://gaulnugraha.wordpress.com/2012/07/23/isolasi-bakteri-anaerob/.
Diakses pada : 14 Oktober 2014.
Umhir.

2012.

Bakteri

Coliform.

Tersedia

pada:

http://jumhirmaeng.wordpress.com/2012/02/21/bakteri-coliform/. Diakses
pada : 14 Oktober 2014.