Judul Praktikum

: Pewarnaan Majemuk / Gram

Tanggal Praktikum

: 19 Nopember 2014

Tujuan Praktikum

Mampu melakukan pewarnaan bakteri dengan menggunakan

beberapa macam zat warna dengan metode gram
A. Landasan Teori
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri
sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).
Berbagai teknik pengecatan dikenal untuk memudahkan pengamatan
bakteri dan mikroorganisme lainnya. Dikenal tipe teknik pengecatan sederhana
dan pengecatan diferensial. Pengecatan sederhana digunakan untuk mengamati
bentuk morfologi bakteri yang terdiri dari bentuk kokus, basilus, atau spiral, dan
pengamatan terhadap susunan hidup bakteri, seperti susunan rantai, klaster,
pasangan atau tetrad (Subandi, 2010: 180).
Pewarnaan diferensial adalah pengecatan dengan menggunakan dua zat
warna yang kontras. Ada dua macam pengecatan yang termasuk dalam pewarnaan
diferensial yaitu pengecatan gram dan pengecatan bakteri yang tahan asam (acidfast) (Subandi, 2010: 180).
Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling
penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan
gram. Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai
larutan-larutan (ungu kristal, larutan iodium, alkohol (bahan
pemucat) dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain
yang sesuai (Pelczar, 1986: 82).
Pewarnaan gram bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri
baik mengenai bentuknya maupun sifat-sifat morfologinya.

Dengan kata lain memperlihatkan bagian-bagian sel mikroba

(Dwijoseputro, 1998).
Teknik pewarnaan gram pertama kali diuraikan dalam suatu
publikasi pada tahun 1884 oleh seorang ahli bakteriologi
Denmark,

Christian

pewarnaan

ini

Gram.

selagi

Dia

mengembangkan

mencari

suatu

prosedur

metode

untuk

memperlihatkan bakteri pnemokokus pada jaringan paru-pparu

pasien yang mati karena pneumonia. Selain itu dia melihat
bahwa beberapa spesies bakteri dapat dibedakan dengan
prosedur pewarnaan ini (Pelczar, 1986: 83).
Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi
menjadi
positif,

dua kelompok. Salah satu di antaranya, bakteri gram

mempertahankan

zat

pewarna

ungu

kristal

dan

karenanya tampak ungu tua. Kelompok lain, bakteri ggram

negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol, dan
sewaktu

diberi

pewarna

tandingan

dengan

warna

merah

safranin, tampak berwarna merah (Pelczar, 1986: 82-83).

Mekanisme pewarnaan gram didasarkan pada struktur dan
komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram negatif mengandung
lipid, lemak, atau substansi seperti lemak dalam presentase lebih
tinggi darippada yang dikandung bakteri gram positif. Dinding sel
baktteri gram negatif juga lebih tipis daripada dinding sel bakteri
gram positif. Bukti-bukti percobaan menyyarankan bahwa selama
prosedur pewarnaan, perlakuan dengan etanol (alkohol) terhadap
bakteri

gram

negatif

menyebabkan

terekstrasinya

lipid

sehinngga mempperbesar daya rembes atau permeabilitas

dinding sel gram negatif. Jadi kompleks ungu kristal-yodium (UKY), yang telah memasuki dinding sel selama langkah awal dalam
proses pewarnaan, dapat diekstraksi. Karena ituu organisme
gram negatif kehilangan warna tersebut. Karena kandungan

lipidnya yang lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif

menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan etanol. Ukuran
pori-pori mengecil, permeabilitasnya berkurang, dan kompleks
UK-Y dapat terekstraksi (Pelczar, 1986: 117).
Faktor-faktor yang memengaruhi pewarnaan bakteri yaitu
sebagai berikut.
1.
2.
3.
4.
5.

Fiksasi,
Peluntur zat warna,
Substrata,
Intensifikasi warna, dan
Zat warna penutup atau zat warna lawan (Sutedjo, 1991).

B. Alat dan Bahan

1. Alat
N

Nama Alat

Jumlah

o
1
2
3
4
5

Jarum ose
Bunsen spirtus
Object Glass
Pipet Tetes
Mikroskop
cahaya

1
1
6
2
1

listrik
Tisue

Secukupnya

buah
buah
buah
buah
buah

2. Bahan
N

Nama Bahan

o
1
2
3
4
5
6

Biakan induk
Pewarna gentian violet
Pewarna Fuchsin
Alkohol
Iodin
Aquades

Jumlah
6 buah
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya

C. Langkah Kerja
Membuat preparat bakteri Sarcina lutea pada objek glass dengan
menggoreskan bakteri dari biakan murni
Melakukan fiksasi pada preparat tersebut dengan memanaskan glassobjek di
dekat pembakar spirtus
Menambahkan gentian violet (satu tetes) pada preparat tersebut dan
mendiamkannya selama 30 detik
Membilas preparat tersebut menggunakan air (aquades) yang mengalir
Menambahkan iodin (satu tetes) pada objek glass dan mendiamkannya selama
30 detik
Membilas objek glass tersebut menggunakan air (aquades) yang mengalir
Menambahkan alkohol (satu tetes) pada objek glass dan mendiamkannya
selama 30 detik
Menambahkan pewarna fuchsin (satu tetes) pada objek glass dan
mendiamkannya selama 30 detik
Membilas objek glass tersebut menggunakan air (aquades) yang mengalir

Menghilangkan kelebihan air pada gelas objek menggunakan tisue

Mengamati di bawah mikroskop cahaya listrik

Melakukan langkah-langkah tersebut untuk bakteri yang lain (Staphylococcus,
Proteus, Rhizobium, Bacillus, dan Pseudomonas)

D. Hasil Pengamatan
E.

F. Nama Bakteri +

K
J.

G. Deskripsi

H. Klasifikasi

I. Jenis

Gambar
K. Bacillus subtilis

Bakteri
M.

N. Kingdom

W. Gram

Eubacteria

positif

O. Divisi : Firmicutes
P. Kelas : Bacilli
Q. Ordo : Bacillales

L.

R. Famili : Bacillaceae
S. Genus

: Bacillus

T. Spesies

Bacillus

subtilis
U.
Y. Sarcina lutea

AA.

V.
AB.

Kingdom :

Eubacteria

AK.

Gr

am

AC.

Divisi

: Firmicutes

AD.

Kelas

: Clostridia

negatif
AL.

(ti

E.

F. Nama Bakteri +

G. Deskripsi

H. Klasifikasi

Gambar

I. Jenis
Bakteri

AE.

Ordo

dak

Clostridiales

sesuai)

AF.Famili : Clostridiaceae
Z.

AG.

Genus

: Sarcina

AH.

Spesies :

Sarcina

lutea
AI.
AM.
6

AN.

Proteus vulgaris
AO.

AP.

AJ.
AQ.

Kingdom :

AY. Gram

Eubacteria
AR.

Divisi

positif
:

AZ.

Proteobacteria
AS.

Kelas

(ti

dak
Gamma

Protobacteria
AT.Ordo :
Enterobacteriales

sesuai)

E.

F. Nama Bakteri +

G. Deskripsi

H. Klasifikasi

Gambar

I. Jenis
Bakteri

AU.

Famili

Enterobacteriaceae
AV.Genus

: Proteus

AW. Spesies :

Proteus

vulgaris
BA.

BB.

Pseudomonas

aeruginose
BC.

BD.

AX.
BE.

Kingdom :

BN.

Eubacteria

am

BF.Divisi : Proteobacteria
BG.

Kelas

Gamma

Protobacteria
BH.

Ordo

Pseudomonadales
BI. Famili :
Pseudomonadaceae
BJ. Genus

Gr

negatif

E.
K

F. Nama Bakteri +

G. Deskripsi

H. Klasifikasi

I. Jenis

Gambar

Bakteri
Pseudomonas
BK.

Spesies :

Pseudomonas
aeruginose
BL.
BO.
7

BP.Rhizobium sp.
BQ.

BR.

BM.
BS. Kingdom :

CB.

Eubacteria

am

BT.Divisi : Proteobacteria
BU.

Kelas

Alpha

Protobacteria
BV.

Ordo

Rhizobiales
BW. Famili

Rhizobiaceae
BX.

Genus

Gr

: Rhizobium

positif
CC.

(ti

dak
sesuai)

E.

F. Nama Bakteri +

G. Deskripsi

H. Klasifikasi

Gambar

I. Jenis
Bakteri

BY.Spesies

: Rhizobium

sp.
BZ.
CE.

Staphylococcus

aurens

CG.

CA.
CH.

Kingdom :

Eubacteria
CJ. Kelas : Bacilli
CK.

Ordo

: Bacillales

CL.

Famili

Staphylococcaceae
CM. Genus

Staphylococcus
CN.

Spesies :

Staphylococcus aurens
CO.

Gr

am

CI. Divisi : Firmicutes

CF.

CQ.

positif

E.

F. Nama Bakteri +

CR.

G. Deskripsi

H. Klasifikasi

Gambar

CS.

Sarcina lutea

I. Jenis
Bakteri

CU.

CT.

CP.
CV.

Kingdom :

DE.

Eubacteria

am

CW. Divisi

: Firmicutes

CX.

: Clostridia

Kelas

Gr

positif

CY. Ordo : Clostridiales

CZ.

Famili

Clostridiaceae
DA.

Genus

: Sarcina

DB.

Spesies :

Sarcina

lutea
DC.
DG.

Bacillus subtilis
DH.

DI.

DD.
DJ. Kingdom

Eubacteria

DS.

Gr

am

DK.

Divisi

: Firmicutes

DL.

Kelas

: Bacilli

negatif
DT.

(ti

E.
K

F. Nama Bakteri +

G. Deskripsi

H. Klasifikasi

Gambar

Bakteri
DM. Ordo

: Bacillales

dak

DN. Famili

sesuai)

Bacillaceae
DO. Genus
DP.
DQ.
DR.
DV.

: Bacillus

Spesies :

subtilis

DU.

I. Jenis

Bacillus

DW. Pembahasan
DX.

Pewarnaan gram atau perwanaan majemuk

adalah pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari

satu zat warna. Pewarnaan ini bertujuan untuk mengetahui
dan menunjukkan bagian-bagian sel mikroba.
DY.

Dengan

pewarnaan

gram

akan

diketahui

susunan dinding sel dari bakteri yang diamati. Terdapat

dua jenis bakteri gram, yaitu gram positif dan gram negatif.
Prinsip kerja dari pengujian ini adalah bakteri gram positif
mampu

mempertahankan

warna

pertama,

sedangkan

bakteri gram negatif tidak bisa, sehingga menyerap warna

tandingan.

Hal

tersebut

terjadi

karena

struktur

dan

komposisi dinding sel bakteri tersebut berbeda.

DZ.

Pada gram positif setelah dilakukan pencucian

dengan alkohol, dinding selnya akan mengalami dehidrasi,

pori-pori mengecil, daya rembes dinding sel dan membran
menurun, sehingga warna pertama tidak dapat keluar sel.
Sedangkan pada gram negatif, lipid terekstraksi dari
dinding sel, pori-pori mengembang, warna pertama keluar
dari sel (sel menjadi tidak berwarna) dan menyerap warna
tandingan.
EA.

Pewarnaan

gram

yang

kami

lakukan

menggunakan zat warna gentian violet (ungu) sebagai

pewarna pertama, larutan yodium, dan pewarna tandingan
berupa fuchsin (merah). Jenis bakteri yang dilakukan
pewarnaan gram adalah bakteri Bacillus subtilis, Sarcina
lutea,

Staphylococcus

aurens,

Proteus

vulgaris,

Pseudomonas aeruginose, dan Rhizobium sp.

EB.

Dari hasil pengujian terbentuk warna yang

dapat diidentifikasi jenis gram dari bakteri tersebut. Hanya

saja ada beberapa hasil pewarnaan yang tidak sesuai

dengan literatur. Seperti pada Rhizobium sp. warna yang
terbentuk adalah ungu, padahal Rhizobium sp merupakan
bakteri gram negatif yang seharusnya berwarna merah.
Begitu pula pada Proteus vulgaris tetap berwarna ungu
yang menunjukan gram posirif, padahal bakteri Proteus
vulgaris merupakan bakteri gram negatif.
EC.

Ketidaksesuaian

warna

pada

pengujian

pewarnaan gram dapat diakibatkan oleh kurang lamanya

pewarnaan, sehingga warna yang diberikan pada bakteri
belum terserap sempurna. Pencucian yang kurang baik
dengan aquades maupun dengan alkohol. Selain itu, rentan
perbedaan warna ungu dan merah tidak terlalu jauh,
sehingga agak sulit untuk membedakannya.
ED.
EE. Pertanyaan dan Jawaban
1. Apa yang dimaksud pewarnaan majemuk?
EF. Pewarnaan majemuk adalah pemberian warna pada bakteri
dengan

larutan-larutan

yang

berurutan

(ungu

kristal,

larutan yodium, alkohol, dan safranin atau beberapa warna

tandingan lain yang sesuai).
2. Mengapa perlu dilakukan pencucian dengan alkohol?
EG.
Karena pencucian dengan alkohol akan memengaruhi
senyawa yang terkandung dalam dinding sel bakteri yang
dapat menyebabkan pori-pori dinding sel menciut atau
mengembang sehingga dapat memengaruhi penyerapan
zat pewarna tandingan (terserap atau tidak terpengaruh).
3. Mengapa hasil warna sel bakteri yang diperoleh antara
gram positif dan gram negatif berbeda? Jelaskan!
EH.
Karena struktur dan komposisi dinding sel bakteri
tersebut

berbeda.

Kandungan

lipid,

lemak

(substansi

seperti lemak) pada bakteri gram negatif lebih tinggi

daripada bakteri gram positif. Selain itu, dinding sel bakteri

gram negatif lebih tipis daripada bakteri gram positif.
Sehingga ketika dilakukan pencucian dengan alkohol,
menunjukan reaksi yang berbeda.
EI. Gram positif:
EJ. Dinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori mengecil, daya
rembes dinding sel dan membran menurun, UK-Y (larutan
yang membuat sel berwarna ungu) tidak dapat keluar sel,
tetap berwarna ungu.
EK.
Gram negatif:
EL.
Lipid terekstraksi

dari

dinding

sel,

pori-pori

mengembang, komplek Uk-Y keluar dari sel (sel menjadi

tidak berwarna)
EM.
Dan ketika diberi zat pewarna tandingan (misal
safranin), maka:
- Sel bakteri gram positif tidak terpengaruhi, tetap ungu.
- Sel bakteri gram negatif menyerap zat pewarna
tersebut, menjadi berwarna merah.
EN.
EO.

Kesimpulan
EP.

Bakteri gram positif mampu mempertahankan

warna pertama sehingga tetap berwarna ungu, sedangkan

bakteri gram negatif tidak bisa, sehingga menyerap warna
tandingan (merah).
EQ.
ER.

Daftar Pustaka

ES.

Dwidjoseputro. 1998. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang:

Penerbit Djambatan.

ET.

Pelczar. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI-Press.

EU.

Subandi.

2010.

Mikrobiologi.

Bandung:

PT

Remaja

Rosdakarya.
EV.

Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rineka Cipta.