Tugas Individu

Bioteknologi Pertanian

MOLECULER APPROACHES TO THE STUDY OF PLANT

DEVELOPMENT
“pendekatan molekuler untuk Studi pengembangan tanaman”

NAMA : HIKMAH MAQFIRAH

NIM : G011 17 1528

KELAS : BIOTEKNOLOGI PERTANIAN F

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2019
 PENDEKATAN MOLEKULER UNTUK
STUDI PENGEMBANGAN TANAMAN

Pengembangan dikaitkan dengan peningkatan kompleksitas biologis dari waktu ke

waktu. Jelaslah, kompetensi untuk program perkembangan spesifik ditetapkan dalam
urutan DNA, genom sel telur yang dibuahi (zigot).

ARABIDOPSIS
Salah satu peristiwa penting dalam biologi perkembangan tanaman adalah adopsi
crucifer kecil Arabidopsis thaliana sebagai platform eksperimental. Arabidopsis,
herba (musim dingin) tahunan dengan waktu generasi sekitar 3 bulan, mudah tumbuh
di laboratorium di tanah atau media pertumbuhan yang ditentukan. Ini kompatibel
sendiri dan menghasilkan banyak biji. Genom kecilnya (~ 125 juta pasangan basa)
mudah mengalami mutagenisasi. Mungkin keunggulan utama Arabidopsis terletak
pada fakta bahwa Arabidopsis telah diadopsi oleh ratusan kelompok penelitian di
seluruh dunia. Dorongan gabungan telah menghasilkan sekuensing DNA pada
dasarnya seluruh genom, dan telah menyebabkan banyak sumber daya terkait,
termasuk perpustakaan genomik, koleksi cDNA penuh, program mutagenesis
insersional, dan berbagi kolaboratif dari reagen dan trik perdagangan.

RUANG LINGKUP BAB INI

Bab ini dimaksudkan untuk memberikan pengantar singkat ke bagian genetika
molekuler sebagaimana diterapkan pada penyelidikan pengembangan tanaman.
Penekanannya adalah menguraikan kemampuan, keterbatasan, dan aplikasi dari
pendekatan molekuler ini dalam organisme model eksperimental A. thaliana
(Brassicaceae). Sebagai latar belakang, pemahaman dasar proses seperti kloning
molekuler, struktur dan fungsi gen, sekuensing DNA, reaksi rantai polimerase (PCR),
pemetaan genetika, dan genetika Mendel dapat diperoleh dari buku teks genetika
pengantar. Contoh informatif diberikan bila memungkinkan. Sayangnya, terbukti
tidak mungkin untuk mengakui semua kontribusi dari masing-masing simpatisan.
Saat praktis, nama-nama penyelidik utama telah dikaitkan dengan contoh-contoh
spesifik.
KARAKTERISASI GEN MENGGUNAKAN MUTAN
Gambaran Umum
Banyak aspek perkembangan tanaman dapat dipahami sebagai rantai peristiwa antara
sinyal (mis., Hormon auksin), yang dirasakan melalui perantara sinyal (mis., Gen
responsif auksin) dan respons yang dihasilkan (mis., Regulasi pertumbuhan pada
tunas aksila). Pada gilirannya, respons seringkali berfungsi sebagai sinyal untuk
respons selanjutnya. Sinyal, perantara sinyal, dan respons adalah produk gen atau
bergantung pada produk gen untuk sintesis atau persepsi mereka. Oleh karena itu,
banyak informasi yang mendalam dapat diperoleh dari mengamati dengan cermat
efek fenotipik yang dihasilkan ketika fungsi genesis yang mendasarinya diubah oleh
mutasi.
Analisis mutasional mendasari banyak percobaan dalam biologi
perkembangan. Mutasi dapat menghapus fungsi gen (alel nol), mengganggu fungsi
gen (alel kehilangan fungsi parsial), atau secara artifisial meningkatkan fungsi gen
(alel fungsi tambahan). Secara singkat, untuk penapisan mutan, sekumpulan tanaman
yang genomnya telah terpapar dengan mutagen disaring untuk melihat adanya cacat
dalam aspek perkembangan tertentu, misalnya pigmentasi , atau respons terhadap
hormon etilen. Tumbuhan yang secara fenotip abnormal (mutan putatif) diidentifikasi
dan galur dengan cacat genetik tunggal diisolasi melalui persilangan kembali.

Mutagen
Mutagen datang dalam tiga jenis: kimia, fisik, dan biologis. Mereka berbeda dalam
spektrum mutasi yang disebabkan, yang memiliki implikasi untuk keparahan fenotipe
yang dapat diharapkan serta untuk prospek kloning molekuler akhirnya gen yang
mendasarinya.
1. Mutagen kimia
Etil kimia metil sulfat metana (EMS) banyak digunakan karena toksisitasnya yang
moderat dan efektivitasnya yang tinggi dalam menginduksi banyak mutasi per
genom. Selain itu, mutasi biasanya merupakan substitusi berbasis tunggal. Dengan
demikian, EMS adalah mutagen pilihan ketika diinginkan, alel kehilangan fungsi
parsial ringan diinginkan, meskipun alel nol ("KO") dan alel fungsi tambahan juga
akan diproduksi. Sebagian besar mutagen lain lebih cenderung menyebabkan KO
total. Gambar ini memberikan pandangan mata tentang prosedur genetik dan analisis
yang dilakukan untuk mengidentifikasi mutasi dalam program perkembangan
tertentu. Untuk memudahkan ilustrasi, fenotip mutan yang diperlihatkan di sini
adalah pigmentasi berlebih. Untuk detailnya, lihat teks.
2. Mutagens fisik
Di antara mutagen fisik (radiasi), neutron cepat dan sinar-X menyebabkan
penghapusan, yang sering kali gagal. Alel penghapusan dapat sangat berguna selama
kloning berbasis peta dari gen yang bermutasi (lihat di bawah), ketika tugas yang ada
terdiri dari penempatan gen dalam wilayah kromosom yang lebih besar yang
mengandung, mungkin, beberapa lusin gen. Penghapusan akan menyebabkan
pembatasan polimorfisme panjang fragmen (RFLP), sedangkan substitusi biasanya
tidak. Probing untuk gen bermutasi dengan cara Southern blotting akan
mengungkapkan perbedaan dalam pola pita antara jenis liar dan tanaman mutan. Ini
adalah cara yang ampuh untuk membedakan gen yang menarik dari gen di sekitarnya.

3. Mutagen biologis
Mutagen biologis adalah fragmen DNA yang memasukkan diri ke dalam genom
tanaman. Mereka mengambil bentuk transposon atau Agrobacterium T-DNA.
Penyisipan mereka cenderung menyebabkan KO gen yang terpengaruh (Gambar
10.3A), meskipun penyisipan ke dalam daerah pengatur gen dapat menyebabkan alel
yang lemah atau bahkan alel fungsi yang berfungsi. Meskipun memakan waktu untuk
menghasilkan, mutan insersi memiliki satu keuntungan kuat: urutan DNA dari
elemen penyisipan dikenal. Elemen penyisipan dengan demikian menyediakan "tag,"
yang dapat digunakan untuk mendapatkan urutan DNA gen yang tidak diketahui.
Salah satu turunan dari strategi penandaan T-DNA adalah "penandaan
aktivasi." Di sini, T-DNA berisi urutan penambah transkripsional yang kuat, yang
dapat menyebabkan alel fungsi-fungsi dominan dari gen yang mengapit T-DNA,
karena untuk ekspresi berlebih dalam jenis sel yang salah.

MEMBANGUN JALUR GENETIK DARI MUTAN DAN INTERAKSI

GENETIK MEREKA
Layar mutan yang berhasil biasanya akan menghasilkan serangkaian mutan dalam
sejumlah gen yang memengaruhi proses minat. Setelah satu set mutan telah diisolasi,
seseorang dapat mencoba untuk mengatur gen yang mendasari ke dalam hierarki
genetik ("jalur genetik"), sebagaimana dicontohkan oleh jalur pensinyalan etilen yang
diilustrasikan pada Gambar 10.2B (Alonso dan Ecker, 2001). Ada beberapa alat
genetik untuk tujuan ini.

Pleiotropik versus Efek Khusus

Urutan pertama hari itu adalah pengamatan cermat terhadap berbagai fenotipe mutan.
Mutasi tertentu akan menyebabkan cacat yang sangat spesifik, sedangkan yang lain
mungkin memiliki konsekuensi yang lebih luas, disebut sebagai efek pleiotropik.
Misalnya, mutasi yang menyebabkan cacat pada respons terhadap etilena dapat
menampilkan cacat hanya pada satu respons etilen atau semua respons etilen. Mutasi
yang menyebabkan cacat pada pertumbuhan akar dapat mempengaruhi seluruh akar
atau dapat mempengaruhi hanya satu lapisan sel. Seringkali, mutasi yang lebih
pleiotropik menandai gen yang berfungsi tinggi dalam hierarki. Ini sering disebut
sebagai "hulu di jalur genetik," sedangkan mutasi dengan cacat yang lebih spesifik
dikatakan menandai gen "hilir".

Aktivator versus Penekan

Karakteristik penting adalah apakah gen yang didefinisikan oleh mutasi memengaruhi
proses yang diteliti dengan cara yang positif, sebagai aktivator, atau secara negatif,
sebagai penekan. Misalnya, mutasi hipokotil (hy) yang panjang dari Arabidopsis
menandai regulator positif dalam respons bibit terhadap cahaya, mengingat bahwa
hipokotil panjang yang tidak normal merupakan bukti berkurangnya sensitivitas
terhadap cahaya pada mutan hy. Sebaliknya, mutan photomorphogenesis (cop)
konstitutif menandai regulator negatif dari respons cahaya. Mutan polisi tampak
seperti tanaman yang ditumbuhkan ketika berkecambah dalam kegelapan, karena
kegagalan untuk menekan jalur respons cahaya default dalam kegelapan.

Seri Allelic
Untuk gen-gen tertentu, fenotip mutan dari alel-alel individu tidak semuanya mirip,
tetapi sebaliknya membentuk deret alelik. Serangkaian alelik bisa sangat informatif
dalam mendefinisikan fungsi gen tertentu pada berbagai tahap perkembangan.
Gen COP1 Arabidopsis adalah contoh yang baik. Alelnya yang parah mematikan
pada tahap awal pengembangan pembibitan, sedangkan alel yang lebih ringan
memiliki cacat lebih khusus dalam regulasi cahaya pembibitan dan pengembangan
vegetatif, menunjukkan bahwa gen COP1 berfungsi dalam peran yang berbeda pada
berbagai tahap perkembangan

Analisis Mutan Ganda

Salah satu alat yang lebih kuat untuk mendefinisikan hierarki beberapa gen dalam
pembangunan adalah analisis mutan ganda. Mari kita asumsikan bahwa kita memiliki
dua mutan yang kehilangan fungsi dengan fenotipe yang berlawanan. Satu mutan
gagal melakukan respons spesifik bahkan ketika ada stimulus yang sesuai (mis., Alel
tipe liar adalah gen yang bekerja secara positif); mutan kedua melakukan respons
spesifik secara konstitutif (mis., menandai gen penekan). Contoh yang cocok adalah
masing-masing mutan dan mutan cop.

Analisis Sektor Klonal

Alat elegan lain untuk mendefinisikan aksi gen regulator perkembangan adalah
analisis sektor klonal. Kelompok Kilby di University of Cambridge mampu
menghasilkan tanaman di mana daun terdiri dari sektor klon yang ditandai (diberi
label) jaringan mutan (rambut rudimenter) dan jaringan tipe liar (rambut biasa).
Dengan mengamati dengan seksama pertumbuhan rambut di dekat perbatasan antara
sektor mutan dan tipe liar, para peneliti dapat melihat bahwa gen GLABRA2
berfungsi secara otonom karena sel rambut terbatas hanya pada sektor tipe liar. Jika
gen tidak otonom-sel, maka setidaknya tepi sektor mutan akan membawa trikoma
biasa. Analisis sektor klonal terkadang dapat membedakan fungsi gen yang
mutasinya benar-benar identik.

ISOLASI GEN: METODE GEN CLONING

Memilih yang terbaik di antara banyak strategi untuk mengkloning gen akan
tergantung pada dua hal: Apa tujuan jangka panjang kita, dan alat serta reagen apa
yang kita miliki?
1. Apakah kita mencari gen satu-satunya yang rusak pada mutan spesifik yang
mengalami disfungsional? Dalam hal ini, strategi kloning berbasis peta ("posisi")
mungkin diperlukan.
2. Apakah kita mencari gen yang bertanggung jawab atas reaksi enzimatik tertentu?
Pertanyaan ini mungkin cocok untuk melengkapi fungsional mutasi yang sesuai
dalam ragi.
3. Apakah kita secara umum tertarik pada gen yang diekspresikan sebagai respons
terhadap stimulus tertentu, misalnya pengobatan sitokinin? Hibridisasi subtraktif
dapat mengarah pada tujuan dalam kasus ini.
4. Akhirnya, kita mungkin tertarik pada anggota keluarga gen tambahan dari gen
yang diketahui; misalnya, homolog dalam tomat dari gen berbunga Arabidopsis.
Dalam hal ini, layar pustaka cDNA dengan hibridisasi pada string rendah mungkin
merupakan cara yang harus dilakukan.

Prinsipnya, contoh-contoh tersebut mewakili dari empat kasus umum, pemilihan

gen berdasarkan:
1. Fenotip mutan
2. Aktivitas biokimia dari produk gen
3. Pola ekspresi
4. Urutan DNA
GEN CLONING BERDASARKAN URUTAN DNA DILAKUKAN OLEH
HYBRIDIZATION
Kloning molekuler berdasarkan urutan DNA adalah metode langsung untuk
mengisolasi gen tertentu. Prinsipnya sederhana: genom bunga diubah menjadi pusat
klon menggunakan vektor kloning yang sesuai, biasanya bacteriophage lambda, dan
perpustakaan disaring oleh hibridisasi dengan fragmen DNA yang tersedia
("penyelidikan") untuk mengidentifikasi gen baru yang menyerupai probe dalam
urutan DNA-nya. Contoh aplikasi termasuk mengidentifikasi gen padi untuk sintesis
pati yang sesuai dengan gen yang sebelumnya dikloning dari jagung, atau
menggunakan satu gen reseptor etilen Arabidopsis untuk menemukan anggota
tambahan dari keluarga gen reseptor etilen. Bergantung pada keadaan, pustaka
tersebut bisa berupa pustaka genomik, mewakili DNA kromosom, atau pustaka
cDNA, mewakili sekuens yang ditranskripsi (mRNA). Seseorang dapat
menyesuaikan string hibridisasi untuk memilih gen yang hampir identik dengan probe
dalam urutannya atau gen dengan hanya kesamaan urutan sedang.
Dengan menggunakan kode genetik, kami kemudian membalikkan urutan
asam amino pendek menjadi satu set urutan DNA yang sesuai. Setelah secara kimia
mensintesis DNA, kami melanjutkan untuk mengisolasi gen yang diminati dengan
hibridisasi. Sebagai teknologi pengurutan protein oleh spektrometri massa telah
meningkat secara dramatis dalam sensitivitas dan aksesibilitas dalam beberapa tahun
terakhir, kloning dengan terjemahan terbalik telah menjadi sangat populer.

GEN CLONING BERDASARKAN AKTIVITAS BIOKIMIA PRODUK GEN

Strategi kloning pada bagian ini, secara umum, semua bergantung pada beberapa
bentuk uji biokimiawi untuk produk gen yang dimaksud. Pada prinsipnya, pustaka
cDNA dibangun dalam vektor ekspresi gen. Klon dipilih dari perpustakaan
berdasarkan aktivitas biokimia dari produk gen yang diekspresikan. Uji aktivitas
lebih disukai dilakukan secara in vivo, dan dalam mikroorganisme seperti ragi atau E.
coli. Misalnya, G-box adalah motif sekuens DNA dengan peran pengatur dalam
banyak promotor tanaman yang diatur oleh cahaya serta asam absisat.
Sistem dua hibrida ragi hanyalah kasus khusus dari strategi yang lebih
umum, kloning dengan penyelamatan mutan dalam ragi. Mari kita asumsikan muatan
kita terdiri dari mengidentifikasi gen tumbuhan untuk langkah enzimatik spesifik
dalam biosintesis asam amino. Jika mutasi kehilangan fungsi berfungsi tersedia pada
gen ragi yang sesuai, maka dimungkinkan untuk mengisolasi versi tanaman dari gen
ini sebagai berikut: Pustaka cDNA tanaman dibangun dalam vektor ekspresi ragi dan
disaring untuk cDNA yang menyelamatkan cacat mutan ragi. Namun, sedikit jika ada
gen perkembangan tanaman yang cocok untuk pendekatan ini karena gen seperti itu
tidak mungkin secara fungsional dilestarikan dalam ragi.

CLONING BERDASARKAN KARAKTERISTIK EKSPRESI GEN

Untuk mengidentifikasi gen berdasarkan karakteristik ekspresinya, seperti waktu
perkembangan, pola spasial, atau inducibilitas ekspresi, ada, secara teknis, empat
kategori pendekatan:
1. Kloning diferensial (subtraktif) atau hibridisasi diferensial
2. Amplifikasi PCR diferensial
3. Microarray
4. Menjebak promotor

GEN CLONING BERDASARKAN PHENOTYPE MUTAN SELURUH

TUMBUHAN
Cara paling langsung untuk mengungkap gen regulator perkembangan baru
adalah dengan mengidentifikasi tanaman mutan dengan cacat informatif fenotipik
dalam gen tunggal diikuti oleh kloning molekuler gen yang sesuai. Dua pendekatan
yang agak berbeda untuk masalah ini adalah penandaan gen (insertagen mutagenesis)
dan kloning berbasis peta.
 METODE UNTUK MENGANALISIS FUNGSI GEN

STRUKTUR DOMAIN PROTEIN

Membandingkan sekuen protein yang dikodekan dari gen terhadap sekuens lain yang
disimpan dalam database Genbank sering mengarah pada hipotesis yang masuk akal.
Misalnya, produk gen mungkin tampak sebagai enzim biosintesis, protein kinase,
saluran transmembran, protein pengikat DNA dengan atau tanpa domain aktivasi
transkripsi, atau protein dengan permukaan interaksi untuk protein lain. Apakah
protein terdiri dari domain tunggal atau ganda, dan apakah protein lain dengan
kombinasi domain serupa telah diidentifikasi? Adakah yang diketahui ortolog dari
protein pada spesies lain, dan apakah fungsinya sudah dipahami? Jawaban atas
pertanyaan-pertanyaan ini dapat sangat mempercepat analisis selanjutnya. Meskipun
demikian, kita harus ingat, pertama, bahwa setiap saran yang berasal dari kesamaan
urutan hanyalah sebuah hipotesis yang mencari validasi eksperimental; dan kedua,
bahwa pencarian urutan protein dapat menyebabkan tidak ada petunjuk yang berguna
sama sekali. menjadi enzim biosintetik, protein kinase, saluran transmembran, protein
pengikat DNA dengan atau tanpa domain aktivasi transkripsi, atau protein dengan
permukaan interaksi untuk protein lain. Meskipun demikian, kita harus ingat,
pertama, bahwa setiap saran yang berasal dari kesamaan urutan hanyalah sebuah
hipotesis yang mencari validasi eksperimental; dan kedua, bahwa pencarian urutan
protein dapat menyebabkan tidak ada petunjuk yang berguna sama sekali.

AKTIVITAS BIOKIMIA, TERMASUK PROTEIN-DNA DAN PROTEIN-

PROTEIN
INTERAKSI
Sebuah protein dengan peran dalam pengembangan tanaman dapat memiliki aktivitas
biokimia yang mungkin; mungkin berfungsi sebagai protein dinding sel struktural,
protein kinase, atau protein pengikat RNA spesifik-urutan, untuk memberikan hanya
beberapa contoh. Meskipun pencarian untuk aktivitas biokimia dari protein adalah
kunci untuk memahami cara kerjanya, tidak ada jalur sistematis yang akan menjamin
solusi. Sebaliknya, mendefinisikan kegiatan ini menyerupai jalan acak, atau mencari
jarum di tumpukan jerami, dan melibatkan beberapa percobaan dan kesalahan.
Meskipun demikian, dua jenis uji standar diterapkan secara rutin, uji untuk interaksi
protein-DNA dan uji untuk interaksi protein-protein.
Strain ini kemudian dapat diperiksa secara fenotip untuk kelainan
perkembangan dan dapat dikenakan tantangan molekuler dan biokimia yang
dijelaskan sebelumnya. Pendekatan meliputi:
1. Ekspresi berlebih dan ekspresi ektopik
2. Alel gain-of-fungsi sintetik atau loss-of-function
3. Kehilangan fungsi karena interferensi RNA (pembungkaman RNA)
4. Perakitan seri alel oleh TILLING
5. Gene Terkunci

GENETIK YANG MUNDUR: KESIMPULAN

Singkatnya, alat genetik terbalik telah membawa tujuan dalam jangkauan
karakterisasi fungsi masing-masing sekitar 25.000 gen dalam genom Arabidopsis,
genom tanaman pertama yang diurutkan. Banyak dari gen ini akan memiliki peran
yang terkait dengan perkembangan Arabidopsis. Tujuan ini sedang dikejar di bawah
naungan National Science Foundation dalam proyek Arabidopsis 2010-nya.