BLOK 4.1
CARDIORESPIRATORY DISORDERS
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SWADAYA GUNUNG JATI (UGJ)
TA 2021/2022
Tim Penyusun :
Emallia Fitriani., dr
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SWADAYA GUNUNG JATI
CIREBON
2022
VISI
MISI
Tujuan :
Pada akhir praktikum, mahasiswa diharapkan :
1. Memahami teori dasar pewarnaan dan bahan – bahan yang digunakan.
2. Mengetahui berbagai jenis pewarnaan bakteri.
3. Mampu membuat sediaan bakteri untuk pewarnaan.
4. Mampu melakukan pewarnaan : pewarnaan Gram dan pewarnaan tahan asam.
5. Mampu mengamati preparate hasil pewarnaan dan menjelaskan morfologi
bakteri dari preparate hasil pewarnaan.
PENDAHULUAN
Melihat mikroba dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena ukurannya
sangat kecil, transparan serta tidak berwarna. Untuk dapat melihatnya perlu
dilakukan pewarnaan. Secara kimiawi, bahan pewarna terdiri dari cincin benzene
ditambah chromophore dan grup auxochrome.
Benzene : suatu pelarut organik yang tidak berwarna.
Chromophore : suatu grup bahan kimiawi yang dapat memberi warna kepada
benzene, yang keduanya disebut sebagai chromogen, tetapi bukan
bahan pewarna.
Auxochrome : bahan kimiawi yang mampu melakukan ionisasi dari chromogen
(untuk membentuk garam) dan berikatan dengan serabut atau
jaringan. Bentuk baru dari ketiga bahan ini barulah merupakan
bahan pewarna.
Misalnya : benzene (tidak berwarna) + nitrit (chromophore) menjadi
trinitrobenzene (chromogen) yang berwarna kuning dan +
auxochrome maka menjadi trinitrohydroxybenzene (picric acid);
suatu bahan pewarna yang berwarna kuning.
Kemampuan pewarna berikatan dengan komponen makromolekul sel,
seperti protein atau asam nukleat, tergantung dari muatan listrik dari chromogen
dan bagian sel yang akan diwarnai.
Pewarna asam bersifat anion, berarti bahwa chromogennya mempunyai
muatan (-). Protein bakteri mempunyai muatan (+) akan terwarnai dengan pewarna
asam. Sedangkan permukaan bakteri biasanya bermuatan (-) sehingga tidak akan
terwarnai dan bakteri tidak berwarna dengan latar belakang yang berwarna.
Pewarna ini digunakan untuk pewarnaan negatif, misalnya eosin, nigrosin, atau
tinta cina. Dapat digunakan untuk mewarnai bakteri yang sukar diberi pewarna
seperti spirochaeta. Pewarna basa seperti kation, berarti bahwa chromogennya
bermuatan (+) sehingga akan berikatan erat dengan bagian sel yang bermuatan (-),
misalnya asam nukleat. Contoh pewarna ini adalah methylen biru.
Beberapa macam pewarnaan ialah sebagai berikut :
1. Pewarnaan sederhana : menggunakan bahan pewarna tunggal. Pewarnaan ini
digunakan untuk menunjukkan morfologi dan susunan
bakteri.
2. Pewarnaan differensial, digunakan untuk :
a. Membedakan kelompok bakteri, misalnya pewarna Gram dan pewarna tahan
asam.
b. Memperlihatkan struktur bakteri, misalnya pewarna untuk flagella, spora,
kapsul dan inti bakteri.
Pewarnaan differensial yang sering digunakan dalam laboratorium
mikrobiologi klinik ialah pewarna Gram, yang penting dalam klasifikasi bakteri dan
merupakan tahapan awal untuk identifikasi. Pewarnaan Gram menggunakan 4
macam reagen yang digunakan secara berurutan. Bahan pertama disebut sebagai
pewarna primer (primary stain), untuk memberi warna semua bagian sel. Bahan
kedua disebut bahan penguat (mordant) untuk mengikat pewarna primer. Bahan
ketiga disebut bahan pelarut (decolorizing agent), tergantung dari susunan kimiawi
sel; akan melarutkan sebagian atau seluruh pewarna primer. Bahan keempat disebut
counterstain yang memberikan warna kontras terhadap pewarna primer. Bila
pewarna primer tidak luntur, maka bagian sel tersebut tidak akan terwarnai lagi,
sedangkan bagian yang luntur yang akan terwarnai dengan pewarna ketiga sehingga
akan didapatkan kontras dari bagian – bagian sel bakteri.
Bahan pertama
Bahan kedua
Bahan ketiga
Bahan keempat
‘
Gambar 1. Pewaranaan Gram
KLASIFIKASI PEWARNAAN
1. Pewarnaan sederhana (simple staining) :
a. Pewarnaan negatif (negative staining)
- Burri Gin
- Nigrosin (Tinta Cina/Tinta India)
- Congo red
b. Pewarnaan positif (positive staining)
- Methylen blue
- Air Fuchsin
- Carbol Fuchsin
- Crystal violet
2. Pewarnaan kompleks :
a. Pewarnaan differensial
- Gram
- Ziehl Nielsen
b. Pewarnaan khusus
- Spora (Klein)
- Flagella (Gray)
- Granula (Neisser)
- Kapsul (Gin Burri)
- Inti (Feulgen)
- Fungi (KOH, Tinta Parker)
- Giemsa
- DNA (EtBr)
PEWARNAAN SEDERHANA
Bahan pewarna :
1. Pewarna Loffler Methylen blue yang terdiri dari :
Larutan A : methylen blue 0,3 g dan ethyl alkohol 30 ml.
Larutan B : KOH 0,01 g dan aquadest 100 ml.
Kedua larutan di atas kemudian dicampur. Dapat juga menggunakan pewarna
yang lain yaitu :
2. Carbol fuchsin atau
3. Crystal violet
Cara Kerja :
1. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan, genangi dengan pewarna selama waktu
tertentu. Bila menggunakan :
- Methylen blue selama 1 – 2 menit.
- Carbol fuchsin selama 15 – 30 detik.
- Crystal violet selama 2 – 60 detik.
2. Cuci dengan air sampai bersih, ditiriskan (letakkan dalam posisi miring) supaya
cepat kering atau dikeringkan menggunakan kertas saring.
3. Setelah kering periksa dengan mikroskop menggunakan minyak emersi
(pembesaran lensa obyektif 100x).
PEWARNAAN NEGATIF
Pada pewarnaan ini tidak diperlukan pemanasan dan fiksasi pada gelas
obyek sehingga tidak mempengaruhi morfologi. Karenanya morfologi dan ukuran
sebenarnya dapat dilihat dengan cara ini.
Bahan pewarna : Tinta Cina.
Cara Kerja
1. Teteskan bahan pewarna pada salah satu ujung gelas obyek.
2. Secara aseptis menggunakan ose steril, ambil bakteri dalam biakan suspensi atau
biakan coloni dan letakkan di tempat pewarna tersebut dan campur sampai rata,
buat sediaan apus dengan cara di point 3.
3. Dengan ujung gelas obyek yang lain letakkan di depan tetesan pewarna dengan
sudut 30°, buatlah preparat seperti membuat preparat darah apus sampai
terbentuk preparat yang rata dan tipis. Biarkan di udara sampai kering. Jangan
difiksasi.
4. Setelah kering periksa dengan mikroskop menggunakan minyak emersi
(pembesaran lensa obyektif 100x).
PEWARNAAN GRAM
Pewarna pertama yang dipakai adalah crystal violet yang memberi warna
biru – keunguan (purple – blue). Dengan penambahan larutan iodine yang berfungsi
sebagai mordant, akan terbentuk ikatan crystal violet – iodine yang berwarna hitam
– keunguan (purple – black) yang melekat pada komponen magnesium – nucleic
acid dari dinding bakteri yang sulit lepas. Mordant berarti dapat membuat bentuk
tak terlarut (insoluble) karena berikatan dengan pewarna pertama. Alkohol aseton
5% sebagai bahan pelarut berfungsi sebagai pelarut lemak dan protein dehydrating
agent. Aktifitasnya tergantung dari keberadaan lipid. Pada bakteri Gram (+)
dindingnya mengandung sedikit lipid (1-4%) sehingga terlarutkan juga sedikit dan
terbentuk lubang kecil yang dapat ditutup oleh protein yang mengalami dehidrasi,
sehingga warna pertama tetap. Sedangkan pada bakteri Gram (-), dindingnya
mengandung banyak lipid (11-22%) sehingga yang dilarutkan juga banyak dan
terbentuk lubang yang besar yang tidak dapat ditutup oleh protein yang dehidrasi.
Selain lipid kebedaan peptidoglikan yang ada pada diding sel bakteri merupakan
penjelasan dasar yang lain pada pewarnaan Gram. Dinding sel bakteri Gram (-)
mengandung pedtidoglikan yang tipis (10-15 nm) yang mengakibatkan ikatan
silang yang kurang ekstensif dibandingkan dengan bakteri Gram (+) yang lebih
tebal (15-80 nm). Hal-hal tersebut mengakibatkan pelepasan warna pertama
sehingga bakterinya menjadi tidak berwarna. Tahapan paling kritikal adalah
tahapan dekolorisasi ini karena kalau berlebihan akan menyebabkan
overdecolorization. Counterstain yang digunakan dapat safranin atau air fuchsin,
yang akan memberikan warna merah.
Cara kerja
1. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan/ meja porslein, Sediaan diteteskan
Crystal violet menggunakan pipet hingga menutupi sediaan/menggenang
selama 1-2 menit.
2. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
3. Sediaan diteteskan sedian dengan larutan Gram’s iodine menggunakan pipet
hingga menutupi sediaan/menggenang selama 30 detik.
4. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
5. Sediaan diteteskan alkohol aseton 5% (dekolorisasi) hingga Crystal violet tidak
terlarut lagi. Hati – hati jangan sampai overdecolorize (over dekolorisasi)
6. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
7. Sediaan diteteskan dengan larutan safranin menggunakan pipet hingga
menutupi sediaan/menggenang selama 1-2 menit.
8. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
9. Sediaan dikeringkan dengan meletakkan miring objek glass diatas kertas saring
dan setelah kering diamati dengan mikroskop pada pembesaran lensa obyektif
100x menggunakan minyak emersi.
PEWARNAAN TAHAN ASAM (ZIEHL NEELSEN)
Mikobakterium mempunyai dinding menyerupai lilin (waxy = lipoidal) yang
tebal sehingga sukar sekali ditembus oleh pewarna, kecuali cara tahan asam. Tetapi
sekali pewarna dapat masuk akan sulit sekali dilarutkan dengan alkohol asam,
disebut sebagai bakteri tahan alkohol asam (acid fast). Sedangkan bakteri lain, akan
mudah dilarutkan dengan alkohol asam sehingga disebut sebagai tidak tahan asam
alkohol (non acid fast).
Pewarna tahan asam terdiri dari 3 macam bahan. Carbol fuchsin adalah
pewarna fenol yang larut dalam bahan lipoidal yang dapat menembus dinding
bakteri tuberkulosis, yang lebih dipermudah lagi penetrasinya dengan pemanasan.
Sedangkan cara tanpa pemanasan dengan penambahan bahan pembasah (wetting
agent) seperti turgitol, yang berfungsi menurunkan tegangan permukaan antara
dinding bakteri dan pewarna. Asam alkohol terdiri dari HCl 3% dan ethanol 95%,
sedangkan sebagai pewarna kedua digunakan methylen biru/malachite green
Bahan pewarna
Carbol fuchsin : Basic fuchsin 4 g.
Larutan fenol 5% (dalam air) 1000 ml.
Alkohol absolut 100 ml.
Larutan alkohol asam 3% (HCl dalam alkohol absolut).
Methylen Blue 1%.
Cara kerja
1. Genangi sediaan dengan carbol fuchsin, panaskan di atas nyala api sampai
beruap (tidak mendidih) selama 5 menit. Usahakan jangan sampai pewarna
kering, kalau perlu pewarna ditambah serta jangan sampai mendidih.
2. Tunggu sampai sediaan dingin, kemudian dicuci dengan air.
3. Sediaan diteteskan alkohol asam 3% (dekolorisasi) hingga tidak terlarut lagi.
4. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
5. Sediaan diteteskan dengan larutan methylen blue menggunakan pipet hingga
menutupi sediaan/menggenang selama 2 menit.
6. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
7. Keringkan dengan kertas saring dan setelah kering diperiksa dengan
mikroskop menggunakan minyak imersi (pembesaran lensa obyektif 100x).
DAFTAR PUSTAKA
VITAL SIGN
Parameter Satuan
30/3
TD mmHg 150/90
HR x/mnt 85
RR x/mnt 24
T ºC 3.4
Saturasi O2 99