LAPORAN

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
PENGECATAN GRAM

Disusun Oleh:

Nama : Fitri Nurul Choiriyah

NIM 2011102415146
Kelas Praktikum :B
Dosen Pengampu : Dr. Hasyrul Hamzah S.Farm., M.Sc.

PROGRAM STUDI S1
FARMASI FAKULTAS
FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH KALIMANTAN TIMUR
2021
 BAB I
PENDAHULUA
N

A. Tujuan Praktikum
Setelah mengikuti praktikum ini mahasiswa mampu memahami cara-
cara pengecatan suatu bakteri atau mikroorganisme.
B. Dasar Teori
Bakteri merupakan mikroorganisme yang banyak terdapat di
dalam tubuh manusia. Bakteri dapat bersifat patogen dan apatogen.
Bakteri yang bersifat patogen dan apatogen dapat menyebabkan penyakit
dalam tubuh manusia dan disebut oportunistik patogen. Bakteri bersifat
patogen jika sudah menimbulkan suatu infeksi atau penyakit di dalam
tubuh inangnya, salah satunya adalah Escherichia coli, dapat ditemukan
pada tubuh manusia, bakteri juga dapat ditemukan di dalam air, makanan,
tanah yang sering kita injak ataupun dalam pakaian kita sendiri
(Rahayuningtyas dkk., 2017).
Bakteri tidak dapat dilihat oleh mata telanjang, ukuran mereka
yang sangat kecil menyebabkan kita tidak dapat melihat mereka, tetapi
bakteri dapat menyebabkan penyakit meskipun tidak dapat dilihat secara
langsung. Bakteri dapat dilihat bentuk, ukuran, dan jenisnya dengan
menggunakan beberapa teknik pewarnaan. Pewarnaan pada bakteri
dibutuhkan untuk membedakan spesies dan untuk kebutuhan diagnosis.
Terdapat beberapa jenis pewarnaan untuk mengidentifikasi suatu
bakteri, yaitu pewarnaan Gram, pewarnaan kapsul dan pewarnaan tahan
asam. Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat
berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi.
Pewarnaan kapsul adalah teknik yang digunakan untuk mengetahui suatu
bakteri memilik kapsul pada tubuhnya. Kapsul adalah lapisan polimer
yang terdapat diluar dinding sel. Pewarnaan tahan asam merupakan salah
satu metode untuk mengidentifikasi bakteri tahan asam. Bakteri tahan
asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal
sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus
dengan pewarnaan tahan asam (Rahayu dan Gumilar, 2017).
Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang
digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Tujuan
pewarnaan Gram adalah untuk mengidentifikasi mikroba. Bakteri yang
diwarnai dengan metode Gram ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Zat warna yang digunakan
pada pengecatan Gram meliputi kristal violet, lugol, alkohol 70% dan
safranin (Malik dan Mustafa, 2017).
Teknik pewarnaan membagi bakteri berdasarkan perbedaan dasar
dalam struktur dinding selnya. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel
seperti jala yang tebal yang terbuat dari peptidoglikan (50-90% berat
selubung sel), sedangkan bakteri gram negatif memiliki lapisan yang lebih
tipis (10% berat selubung sel) (Putri dkk., 2018).
Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk
mengelompokkan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Perbedaan
struktur, komposisi dinding sel bakteri dan permeabilitas diantara kedua
kelompok dinding sel bakteri menyebabkan perbedaan warna pada bakteri
Gram positif dan bakteri Gram negatif. Pewarnaan Gram berdasarkan
kemampuan bakteri untuk menahan pewarna primer (kristal violet) atau
kehilangan warna primer dan menerima warna tandingan (safranin).
Bakteri Gram positif akan menunjukkan warna ungu sedangkan untuk
bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna merah (Anuar dkk., 2014).
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu bacillus (batang), coccus
(bulat), dan spirilum (lengkung). Bakteri yang berbentuk bacillus dibagi
atas diplobacillus dan tripobacillus. Pada bentuk coccus dibagi atas
monococcus, diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah
anggur). Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan tidak melengkung (Usman, 2010).
Teknik pewarnaan pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan
diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau
jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu
pewarna pada lapisan tipis atau olesan yang sudah difiksasi, dinamakan
pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan di antara sel-sel bakteri atau bagianbagian sel bakteri disebut
teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-
bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan
endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Waluyo, 2010).
Pewarnaan Gram memiliki kelebihan dan kekurangan.
Kelebihannya ialah pewarnaan Gram merupakan salah satu metode
paling sederhana dan murah untuk diagnosis cepat infeksi bakteri. Metode
ini jauh lebih cepat dibandingkan dengan kultur bakteri, dan sebagai
pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik sebelum tersedia bukti
definitif bakteri penyebab infeksi secara spesifik. Kekurangan dari metode
ini yaitu hanya dapat mengetahui ukuran dan bentuk bakteri serta melihat
struktur dalam bakteri dengan zat warna saja. Kondisi pewarnaan Gram
dan morfologi bakteri kadang-kadang berubah karena terapi antimikroba.
Spesies batang Gram negatif dapat menjadi filamen dan pleomorfik
sedangkan bakteri Gram positif dapat menjadi bervariasi setelah terapi
antimikroba (Nagata dkk., 2010).
 BAB II
PELAKSANAAN PRAKTIKUM

A. Alat dan Bahan

1. Alat
a. De Glass
b. Mikroskop
c. Objek Glass
d. Ose Bulat
e. Lampu Spiritus
f. Rak Tabung Reaksi
g. Tabung Reaksi
2. Bahan
a. Alkohol 70%
b. Aquadest
c. Cat A (Kristal Violet)
d. Cat B (Larutan Mordan)
e. Cat C (Larutan Alkohol Asam)
f. Cat D (Safranin)
g. Bakteri Sa
h. Kertas Label
i. Metilen Blue
j. Nigrosin
k. Tissue
B. Perhitungan
-
C. Metode Kerja
1. Pengecatan Negatif
a. Dibersihkan gelas objek dengan alkohol sehingga bebas lemak,
lalu difiksasi.
b. Setelah dingin, diambil suspensi biakan murni bakteri uji
dengan ose secara aseptis dan diletakkan diatas gelas objek.
 c. Kemudian diambil nigrosin dengan ose sedikit dan dicampurkan
dengan suspensi yang telah terletak di atas obyek glass.
Dicampur sampai homogen dan terlihat sangat tipis.
d. Preparat dibiarkan kering di udara dan diamati dengan
mikroskop.
2. Pengecatan Sederhana
a. Dibersihkan objek glass dengan alkohol 70% sampai bebas
lemak, kemudian dikeringkan di atas lampu spiritus.
b. Diambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri dan diratakan di
atas objek glass. Dibiarkan preparat kering di udara.
c. Setelah kering preparat difiksasi dengan cara dipanaskan di
atas lampu spiritus.
d. Setelah dingin, noda pada glass objek ditetesi dengan metilen
blue 1atau 2 tetes dan dibiarkan 1 atau 2 menit.
e. Dicuci dengan air mengalir sampai sisa-sisa cat tercuci
seluruhnya.
f. Dikeringkan di udara dan diamati di bawah mikroskop.
3. Pengecatan Gram
a. Disiapkan preparat olesan bakteri.
b. Dikeringkan di udara, setelah kering difiksasi diatas lampu
spiritus.
c. Ditetesi cat gram A sebanyak 2-3 tetes, dibiarkan 1 menit.
d. Dicuci dengan air mengalir, dikeringkan di udara atau kertas
hisap.
e. Diteteskan larutan gram B, dibiarkan selama 1 menit.
f. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
g. Diteteskan larutan gram C selama 30 detik dan dicuci.
h. Diteteskan larutan gram D selama 30 detik.
i. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dan diamati dengan
mikroskop.
j. Digambar hasil-hasil pengecatan tesebut.
 BAB III
PEMBAHASA
N

Pada praktikum kali ini dilakukan pengecatan/pewarnaan gram

untuk mengidentifikasi mikroba. Pewarnaan gram adalah pewarnaan
diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam
laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam
langkah awal identifikasi. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram
dibagi menjadi dua yaitu Gram positif dan Gram negatif. Zat warna yang
digunakan pada pengecatan Gram meliputi kristal violet, lugol, alkohol
70% dan safranin.
Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca objek.
Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak agar mudah
diratakan tipis-tipis. Fiksasi dilakukan dengan cara melewatkannya di atas
nyala api. Proses fiksasi dilakukan agar bakteri benar-benar melekat pada
kaca objek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan
pencucian. Pada proses fiksasi, bidang yang mengandung bakteri dijaga
agar tidak terkena nyala api.
Setelah di cat, bakteri Gram positif akan menunjukkan warna ungu
sedangkan untuk bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna merah.
Perbedaan warna pada bakteri Gram positif dan Gram negatif
menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur dinding sel antara kedua
jenis bakteri tersebut. Bakteri Gram positif memiliki struktur dinding sel
dengan kandungan peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri Gram
negatif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi.
Pada pewarnaan gram penambahan larutan mordant
menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Pada sel Gram
negatif, alkohol meningkatkan porositas dinding sel dengan melarutkan
lipid lapisan luar. Jadi, kompleks kristal violet-iodin (mordant) dapat lebih
mudah dihilangkan dari lapisan peptidoglikan yang tidak tertaut silang
dengan kuat. Oleh sebab itu, efek pencucian alkohol memfasilitasi
pelepasan kompleks kristal violet-iodin (mordant) yang tidak terikat, yang
membuat sel-sel menjadi kehilangan warna atau tidak berwarna. Karena
hanya sel-sel Gram negatif yang mengalami kehilangan warna sehingga
sel-selnya menyerap pewarna tandingan (safranin) (Post and Songer,
2005).
Dinding sel Gram positif memiliki kandungan lipid yang rendah,
sehingga dinding sel lebih mudah terdehidrasi akibat perlakuan alkohol
yang menyebabkan pori-pori sel menjadi lebih kecil dan permeabilitasnya
berkurang sehinggga zat warna kristal violet yang merupakan zat warna
utama tidak dapat keluar dari sel (Putri dkk., 2018).
Faktor-faktor yang mempengaruhi warna dan bakteri yaitu fiksasi,
peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat
warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna,
kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus.
Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.
Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini
merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 2015).
 BAB IV
PENUTU
P

A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum dapat disimpulkan bahwa pewarnaan Gram
merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk
mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Pewarnaan Gram digunakan
untuk mengelompokkan bakteri Gram positif dan Gram negatif.
Berdasarkan percobaan, bakteri Gram positif pada pewarnaan Gram
berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violet-iodium tetap
dipertahankan meskipun diberi larutan alkohol, sedangkan bakteri Gram
negatif berwarna merah sebab kompleks tersebut larut pada saat
pemberian larutan alkohol sehingga mengambil warna merah safranin.
Perbedaan warna pada bakteri Gram positif dan Gram negatif
menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur dinding sel antara kedua
jenis bakteri tersebut.
B. Saran
Dalam melakukan praktikum ini diharapkan praktikan berhati-hati
dalam menggunakan alat dan bahan yang ada di laboratorium, serta
memperhatikan ketelitian saat melakukan percobaan agar berjalan
dengan lancar dan mendapatkan hasil yang maksimal.
 DAFTAR PUSTAKA

Anuar, W., Dahliaty, A., dan Jose, C. 2014. Isolasi Bakteri Selulolitik dari
Perairan Dumai. Jurnal of Mipa, 1(2), 3-6.
Dwidjoseputro, D. 2015. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Malik, C. P., dan Mustafa, M. I. 2017. Identifikasi Mikroba Metode
Pewarnaan Gram. Jurnal Praktikum Mikrobiologi Umum, 1(1), 1–6.
Nagata, K., Mino, H., and Yoshida, S. 2010. Usefulness and Limit of Gram
Staining Smear Examination. Rinsho Byori, 58(5), 490-7.
Post, K. W., and Songer, G. J. 2005. Microbiology Bacterial and Fungal
Agent of Animal Disease. Elsevier Saunders: Philadelphia.
Putri, Y. W., Putra, A. E., dan Utama, B. I. 2018. Identifikasi dan
Karakteristik Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Vagina Wanita
Usia Subur. Jurnal Kesehatan Andalas, 7(3), 20-25.
Rahayuningtyas, A. D., Dewi, W., dan Indrati. 2017. Pemanfaatan Ekstrak
Etil Asetat Buah Merah sebagai Zat Pengganti Pewarna Primer
pada Teknik Pengecatan Tunggal Bakteri Gram Negatif Batang.
Jurnal Kedokteran Gigi Unpad, 29(2), 138-144.
Rahayu, S. A., dan Gumilar, M. H. 2017. Uji Cemaran Air Minum
Masyarakat Sekitar Margahayu Raya Bandung dengan Identifikasi
Bakteri Escherichia coli. IJPST, 4(2) , 50-56.
Usman, W. 2010. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran (Edisi Revisi).
Jakarta: Binarupa Aksara.
Waluyo, L. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. Malang:
Universitas Muhammadiyah Malang Press.