Acara 2 - Diaz Ayu - Koreksi

No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Berlaku sejak 21 Maret 2009
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI Revisi 0
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 1
LAPORAN PRAKTIKUM
ACARA II
KARAKTERISASI MIKROBA 100
Nama : Diaz Ayu Anjani

NIM : 19/441269/BI/10261
Golongan(Kel) : Selasa (6)
Asisten : Bella Ulin
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA
2021
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
ACARA II
KARAKTERISASI MIKROBA
I. Latar Belakang
Bakteri merupakan salah satu mikroorganisme yang memiliki ukuran yang sangat kecil dan
tidak bisa dilihat secara langsung oleh mata. Pada mikroorganisme bakteri tidak ditemukan
membran inti dan klorofil, kemudian bakteri merupakan organisme yang bersifat uniseluler. Pada
tiap-tiap bakteri memiliki ukuran sel yang bervariasi, seperti pada bakteri berbentuk bulat
berdiameter 0,2-2 mikro meter dan bakteri bentuk batang dengan panjang 2-10 mikro meter dan
lebar sepanjang 0,2-1,5 mikro meter. Bakteri terdiri dari berbagai jenis yang memiliki karakteristik
tertentu. Karakteristik tersebut terjadi dikarenakan adanya adaptasi, di mana adaptasi dapat
mempengaruhi sifat, morfologi, dan struktur dari mikroorganisme terutama bakteri. Oleh karena
itu penting untuk dilakukan pengamatan morfologi dan struktur anatomi dari mikroorganisme
(Sumampouw 2019).
Morfologi dari bakteri dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu morfologi koloni atau morfologi
yang dapat dilihat secara makroskopis, dan morfologi seluler yang dilihat secara mikroskopik
menggunakan mikroskop. Koloni merupakan kumpulan bakteri pada suatu tempat yang sama.
Dalam identifikasi serta membedakan koloni dapat dilakukan dengan mengamati perbedaan
karakteristik yang berbeda-beda pada bakteri. Perbedaan karakteristik tersebut dapat berupa
berbedaan bentuk, di mana secara umum bentuk bakteri terbagi menjadi tiga, yaitu bulat (kokus),
batang (basil), dan spiral, kemudian terdapat ukuran, seperti besar sedang dan kecil. Lalu terdapat
aroma, tekstur, elevasi pada medium datar, warna yang dihasilkan oleh bakteri dan bentuk tepi
koloni (Kandi 2015).
Terdapat berbagai cara untuk mempelajari dan mempermudah saat pengamatan morfologi
koloni, di antaranya adalah menggunakan pewarnaan atau pengecatan bakteri dan uji sifat biokimia.
Metode pewarnaan atau pengecatan bakteri merupakan metode untuk mempelajari morfologi sel
bakteri dengan memberikan warna pada dinding sel maupun latar belakang sel (Black and Black
2015). Sebelum melakukan proses pengecatan pada sel bakteri, terdapat suatu proses yang harus
dilalui, yaitu adalah proses fiksasi. Proses fiksasi merupakan suatu tahap yang ditujukan untuk
mengawetkan atau mempertahankan bentuk dan sifat dari bakteri yang diamati seperti ketika
bakteri tersebut masih hidup. Terdapat dua cara yang dapat dilakukan untuk melakukan fiksasi, di
antaranya adalah dengan panas dan zat kimia. Fiksasi dengan pemanasan dilakukan dengan
memanaskan bakteri pada gelas benda selama beberapa detik untuk mematikan enzim yang dapat
mendegradasi struktur sel. Sedangkan fiksasi dengan zat kimia digunakan pada bakteri yang tidak
tahan panas, fiksasi ini dapat dilakukan dengan etanol dan formaldehid (Wiley et al. 2017).
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Zat pewarna yang digunakan untuk pengecatan, biasanya memiliki dua sifat utama, yaitu
bersifat kromofor dan ionic. Sedangkan berdasar sifat utamanya, zat pewarna dapat dibedakan
menjadi pewarna asam dan basa. Pada penelitian mikrobiologi, lazimnya menggunakan tiga jenis
pengecatan, yaitu pengecatan negatif, pengecatan sederhana, dan pengecatan bertingkat.
Pewarnaan negatif digunakan ketika bakteri tidak dapat berikatan dengan pewarna-pewarna umum
sehingga digunakan pewarna seperti Nigrosin untuk mewarnai latar belakang sel. Hal ini
mengakibatkan pada akhir akan ditunjukkan hasil berupa sel bakteri akan tampak berwarna putih
atau transparan dan terlihat jelas. Pengecatan sederhana merupakan pengecatan yang hanya
menggunakan satu jenis pewarna, seperti pewarna methylene biru, safranin atau krsital violet.
Pewarna-pewarna ini umumnya disebut sebagai pewarna dasar atau pewarna positif. Hal ini
dikarenakan pewarna ini akan mengikat sel bakteri yang bersifat negatif. Sebaliknya jika pewarna
negatif atau pewarna asam akan memberi warna pada dinding sel yang bersifat positif, sehingga sel
bakteri tidak akan terwarnai (Black and Black 2015).
Berbeda dengan pewarnaan sederhana, pada pewarnaan bertingkat akan menggunakan dua
atau lebih pewarna, untuk pewarna yang umum digunakan ialah pewarnaan Gram, karena pada
penggunaan pewarnaan ini dapat membedakan gram positif dan negatif. Kemudian pada pewarnaan
ini secara umum digunakan dalam proses membedakan dua jenis organisme atau dua komponen
yang berbeda pada sebuah organisme. Pewarnaan gram terdiri dari empat tahap yaitu pertama
adalah tahap pewarnaan dengan menggunakan kristal violet, lalu adalah tahap penggunaan iodin
sebagai mordan atau zat kimia untuk memperkuat warna kristal violet, selanjutnya adalah tahap
pencucian zat warna dengan etanol dan terakhir adalah tahap pewarnaan bakteri dengan safranin
yang berfungsi untuk mewarna bakteri yang tidak berikatan dengan kristal violet (Black and Black
2015). Hasil akhir dari pewarnaan ini adalah menghasilkan warna merah pada bakteri gram negatif
dan warna biru keunguan pada bakteri gram positif. Hasil warna ini disebabkan oleh lapisan
peptidoglikan pada kedua jenis bakteri tersebut, di mana bakteri gram positif terdiri dari 40 lapis
peptidoglikan sehingga peptidoglikan tersebut akan berikatan dengan kristal violet. Sedangkan
karena bakteri gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis sehingga tidak dapat
berikatan dengan kristal violet tetapi berikatan dengan safranin (Riedel et al. 2019).Kemudian
pengamatan morfologi koloni dapat dilakukan melalui penumbuhan biakan murni bakteri pada
medium yang bervariasi. Selain mengamati secara morfologi, suatu mikroba dapat dibedakan
dengan mengamati sifat-sifat biokimia yang dimilikinya. Uji sifat biokimia bertujuan untuk
mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri melalui sifat-sifat fisiologis yang
dimilikinya. Uji ini akan memperlihatkan sifat suatu bakteri terhadap beberapa reaksi biokimia,
seperti hidrolisis lemak dan penguraian protein.
Berdasarkan pernyataan di atas penelitian ini memiliki peran penting dalam identifikasi dan
determinasi biakan murni bakteri. Oleh karena itu praktikum ini akan dilakukan karakterisasi
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
mikrobia yaitu pengamatan terhadap morfologi koloni, morfologi sel dan pengujian sifat biokimia.
II. Tujuan
Tujuan dari praktikum kali ini adalah sebagai berikut.
a. Mempelajari karakteristik bakteri menggunakan berbagai metode pengecatan.
b. Mempelajari bentuk morfologi koloni bakteri pada berbagai jenis medium.
c. Mengidentifikasi bakteri secara fisiologis berdasarkan reaksi biokimia.
III. Metode
A. Alat dan Bahan
Pada praktikum yang dilakukan, alat yang digunakan di antaranya adalah medium agar
plate, agar tegak, dan agar miring yang berfungsi sebagai medium kultur bakteri, kemudian
jarum inokulasi yang berfungsi untuk menginokulasi bakteri, selanjutnya tabung reaksi sebagai
tempat inokulan dan mengamati reaksi yang terjadi, kemudian rak tabung sebagai tempat tabung
reaksi, lalu pipet untuk mengambil larutan, kemudian seal plastik untuk men-seal petridish,
selanjutnya kertas sampul untuk membungkus petridish, lalu mikroskop untuk mengamati
bakteri, kemudian gelas benda dan gelas penutup untuk membantu pengamatan bakteri dibawah
mikroskop, selanjutnya ose untuk menginokulasi kultur murni ke gelas benda, lalu lampu
spiritus untuk menjaga lingkungan tetap steril dan aseptis, dan terakhir adalah gelas beker untuk
menampung sisa cat.
Kemudian pada praktikum ini, digunakan bahan-bahan di antaranya adalah akuades,

glukosa cair, laktosa cair, sukrosa cair, indikator fenol merah, triptofan cair, sulfide indole
motility (SIM), Natrium Agar, larutan H2O2, larutan asam sulfanilat, larutan alfa napthylamine,
medium susu dengan BCPM (Brom Cresol Purple Milk), media kasein agar padat, larutan iod
Biakan murni dari Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa, larutan cat
nigrosine, larutan alcohol 70%, minyak imersi, cat methylene blue, gram A (Kristal Violet),
gram B (Larutan Iod), gram C (Alkohol), dan gram D (Safranin).
B. Cara Kerja
Pada praktikum yang dilakukan, terbagi menjadi sepuluh cara kerja, di antaranya adakah
sebagai berikut, Pertama adalah langkah kerja untuk pengecatan negatif, langkah pertama adalah
pertama gelas benda dan meja kerja dibersihkan dengan alkohol, kemudian gelas benda
dipanggang di atas lampu spiritus dan selanjutnya didinginkan. Lalu sebanyak satu ose biakan
bakteri diambil secara aseptis dan diletakkan pada permukaan gelas benda. Selanjutnya larutan
nigrosin diteteskan diatas bakteri dan diratakan dengan menggunakan ose atau gelas benda
hingga tipis. Selanjutnya preparat dikering anginkan dan ditambahkan minyak imersi, kemudian
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
dilakukan pengamatan sel bakteri dengan menggunakan mikroskop dari perbesaran rendah ke
tinggi.
Kedua adalah langkah kerja untuk pengecatan bakteri dengan pengecatan sederhana.
Langkah pertama pada cara kerja ini adalah alat gelas benda dan meja kerja dibersihkan dengan
alkohol 70%, kemudian gelas benda dipanggang di atas lampu spirtus, yang kemudian
didinginkan. Selanjutnya sebanyak satu ose biakan bakteri diambil secara aseptis dan diletakkan
di permukaan gelas benda dan diratakan dengan menggunakan ose sebesar kurang lebih satu
cm. Kemudian sebanyak 1-2 tetes larutan methylene blue diteteskan di atas bakteri dan
didiamkan selama 2-5 menit. Selanjutnya gelas benda dicuci dengan air mengalir sampai cat
tercuci dan dikering anginkan, Kemudian minyak imersi diteteskan pada gelas benda dan
terakhir adalah dilakukan pengamatan sel bakteri dengan menggunakan mikroskop dari
perbesaran rendah ke tinggi.
Ketiga adalah langkah kerja untuk pengecatan bakteri dengan pengecatan gram. Langkah
pertama pada cara kerja ini adalah alat gelas benda dan meja kerja dibersihkan dengan alkohol,
kemudian gelas benda dipanggang di atas lampu spiritus, lalu didinginkan. Selanjutnya
sebanyak satu ose biakan bakteri diambil secara aseptis dan diletakkan dipermukaan gelas benda
dan diratakan dengan menggunakan ose. Kemudian suspensi bakteri diteteskan cat Gram A
sebanyak 2-3 tetes, lalu didiamkan selama 1 menit dan dicuci dengan air mengalir serta dikering
anginkan. Selanjutnya suspensi bakteri diteteskan dengan cat Gram B sebanyak 2-3 tetes,
didiamkan 1 menit dan dicuci dengan air mengalir serta dikering anginkan. Selanjutnya
dilakukan pencucian dengan cat gram C selama 30 detik, lalu dicuci dengan air mengalir dan
dikering anginkan. Terakhir, suspensi bakteri diteteskan cat Gram D sebanyak 2-3 tetes,
didiamkan selama 2 menit lalu dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Sel bakteri
diberi minyak imersi. Terakhir sel bakteri diamati dengan menggunakan mikroskop dari
perbesaran rendah ke tinggi.
Keempat adalah langkah kerja untuk pengamatan morfologi koloni bakteri. Langkah
pertama adalah biakan murni dari bakteri Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas
aeruginosa diinokulasikan pada berbagai media berbeda, yaitu pada medium agar plate dengan
ose dan metode goresan zig-zag, pada medium agar tegak dengan jarum inokulasi dengan
menusukkan jarun inokulasi hingga ¾ dasar tabung dan pada medium agar miring dengan
menggunakan jarum ose dan metode zig-zag. Seluruh kultur tersebut diinkubasi dalam suhu
ruang selama 24-48 jam, kemudian dilakukan identifikasi bentuk pertumbuhan koloni. Lalu
untuk identifikasi pertumbuhan koloni pada agar miring dan agar tegak dilakukan dengan
memperhatikan jumlah dan bentuk pertumbuhan, lebat dan tipisnya bakteri, serta warna bakteri.
Sedangkan untuk pengamatan pada medium agar plate dilakukan dengan mengamati bentuk,
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
warna, bentuk tepi, dan pertumbuhan koloni.
Kelima adalah langkah kerja untuk fermentasi karbohidrat. Langkah pertama adalah
dilakukan pemanasan jarum ose dengan alat bunsen lalu didinginkan sejenak. Kemudian bakteri
diinokulasi dengan ose secara aseptis dalam medium fermentasi karbohidrat yang sudah diberi
indikator phenol red dan tabung durham. Selanjutnya seluruh tabung reaksi tersebut diinkubasi
pada temperatur kamar selama 24- 48 jam pada suhu 27 derajat celcius. Kemudian isolat
diinokulasikan pada medium lain seperti nutrien broth dengan laktosa cair dan nutrien dengan
manitol cair. Setelah 48 jam, pertumbuhan bakteri dan perubahan yang terjadi diamati dan
dicatat pada tabel. Pengamatan dilakukan terhadap keberadaan gelembung udara pada tabung
durham dan perubahan warna pada larutan.
Keenam merupakan langkah kerja untuk pembentukan indol. Langkah pertamanya adalah
dilakukan sterilisasi alat dan meja kerja, selanjutnya jarum ose dipanaskan pada bunsen untuk
sterilisasi, lalu didinginkan sejenak. Setelah itu, masing-masing tabung dengan media yang
sama diinokulasi dengan biakan murni Bacillus subtilis, E.coli dan Pseudomonas aeruginosa
dalam media tryptophan cair menggunakan ose dan satu tabung yang lain dijadikan kontrol.
Selanjutnya seluruh tabung diinkubasi pada temperatur kamar selama 48 jam dan setelah
diinkubasi, ditambahkan eter ke dalam medium dan digojog hingga terbentuk dua lapisan.
Terakhir adalah ditambahnya reagen erlich melalui dinding atau tepi tabung. Pada pengamatan
ini dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya cincin merah pada tabung.
Ketujuh adalah langkah kerja untuk uji katalase. Langkah pertama yang harus dilakukan
adalah dengan dilakukannya sterilisasi pada area kerja serta alat yang akan digunakan.
Selanjutnya kultur isolat bakteri berumur 24-48 jam dalam medium nutrien agar diambil dari
tabung reaksi menggunakan ose yang telah disterilisasi pada lampu spirtus dan diinokulasikan
ke gelas benda. Lalu dilakukan pemberian larutan H202 secara tetesan ke atas preparat sebanyak
2-3 tetes, didiamkan selama 4 menit. Setelah 4 menit, perubahan berupa terbentuknya
gelembung gas pada permukaan preparat.
Kedelapan adalah langkah kerja pada uji reduksi nitrat. Langkah pertama yang harus
dilakukan adalah dengan dilakukannya sterilisasi meja kerja kemudian jarum ose dipanaskan
diatas lampu spirtus dan didinginkan. Kemudian biakan murni Bacillus subtilis, Escherichia
coli, dan Pseudomonas aeuroginosa diinokulasi pada tabung dan satu tabung tanpa biakan
murni digunakan sebagai kontrol. Selanjutnya biakan tersebut diinkubasi pada temperatur kamar
37 derajat celcius selama 48 jam. Kemudian masing-masing biakan cair ditambahkan 1 ml asam
sulfanilat (larutan A) dan 1 ml larutan alpha naftilamin (larutan B), larutan digojog hingga
homogen dan perubahan warna yang terjadi diamati. Terakhir adalah hasil dicatat pada tabel
hasil reduksi nitrat.
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Kesembilan merupakan langkah kerja untuk fermentasi dan peptonisasi susu. Langkah
pertama yang harus dilakukan adalah dengan dilakukannya sterilisasi meja kerja. Selanjutnya
jarum ose dipanaskan di atas lampu spiritus, lalu didinginkan. Kemudian biakan murni bakteri
Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeuroginosa diinokulasikan pada medium
BCPM. Setelah itu, biakan tersebut diinkubasi pada temperatur kamar 37˚C selama 48 jam.
Perubahan yang terjadi pada medium pertumbuhan seperti perubahan warna dan adanya
penggumpalan serta terbentuk zona yang berlapis diamati dan hasil dicatat pada tabel.
Terakhir merupakan langkah kerja untuk hidrolisis kasein. Langkah pertama yang harus
dilakukan adalah dengan dilakukannya sterilisasi meja kerja dengan alkohol, kemudian jarum
ose dipanaskan diatas lampu spirtus. Lalu, masing-masing medium kasein diinokulasikan
dengan biakan murni Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeuroginosa dengan
metode streak menggunakan jarum ose. Selanjutnya cawan petri ditutup diseal dan dibungkus
dengan kertas sampul. Terakhir cawan diinkubasi pada suhu 35 derajat celcius selama 48 jam
dan diamati perubahan berupa terbentuknya zona jernih disekeliling biakan bakteri.
IV. Hasil dan Pembahasan
A. Hasil
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, didapatkan hasil sebagai berikut :
Tabel 1. Pengamatan Morfologi Sel
NO Jenis pewarnaan Hasil Karakteristik/ parameter
pengamatan
Bentuk bakteri : Basil
warna bakteri hidup :
Transparan
BS
1 Negatif
Transparan
EC
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG

Transparan
PA

warna bakteri hidup:
transparan
warna bakteri mati: biru
BS

warna bakteri hidup:
transparan
warna bakteri mati: biru
EC
2 Sederhana
Bentuk bakteri :Basil

warna bakteri
hidup:Transparan
warna bakteri mati: Biru
PA
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Warna bakteri:Ungu
sifat bakteri: Gram
positif
BS
Warna bakteri:Merah
sifat bakteri: Gram
negatif
EC
3 Gram
Warna bakteri: Merah

sifat bakteri: Gram
negatif
PA
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Tabel 2. Pengamatan Morfologi Koloni

NO Jenis media Hasil Karakteristik
1. apakah pertumbuhan
lebat didasar/
dipermukaan/
disepanjang goresan
2. apakah koloni bakteri
tipis/ sedang/tebal
3. bentuk pertumbuhan
BS pada bekas goresan
(filiform, echinulate,
beaded, rhizoid,
spreading,
arborescent, plumose)
4. warna (kuning, hijau,
coklat, merah, putih)
lebat didasar/
dipermukaan/
disepanjang goresan
pada bekas goresan
EC beaded, rhizoid,
1 Agar miring spreading,
tipis/ sedang/tebal
lebat didasar/
dipermukaan/
disepanjang goresan
pada bekas goresan
beaded, rhizoid,
PA spreading,
tipis/ sedang/tebal
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
pada bekas tusukan
beaded, rhizoid,
spreading,
BS coklat, merah, putih)
pada bekas tusukan
beaded, rhizoid,
spreading,
2 Agar tegak EC coklat, merah, putih)
pada bekas tusukan
beaded, rhizoid,
spreading,
PA coklat, merah, putih)
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
1. bentuk koloni
(filiform, circular,
fillamentous, dll)
2. warna koloni (putih)
3. bentuk tepi koloni
BS (entire, undulate,
filiform, dll)
4. pertumbuhan koloni
tipis, sedang, lebat
1. bentuk koloni
irregular,
fillamentous, dll)
2. warna koloni (putih)
3 Agar plate 3. bentuk tepi koloni
EC (entire, undulate,
filiform, dll)
1. bentuk koloni
irregular, fillamentous,
dll)
P 2. warna koloni (putih)
A 3. bentuk tepi koloni
(entire, undulate,
filiform, dll)
Tabel 3. Pengujian Sifat Biokimia

NO Jenis media Hasil Keterangan
Warna setelah reaksi
Hasil reaksi: positif/negative
Gelembung: ada/tidak
Homofermentatif/heteroferme
ntatif
Fermentasi
3 Karbohidrat BS
- Glukosa
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG

ntatif
EC

ntatif
PA

ntatif
- Laktosa BS
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Warna setelah reaksi :kuning

ntatif
EC

ntatif
PA

ntatif
Manitol BS
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG

ntatif
EC

ntatif
PA
Perubahan setelah reaksi :

Terbentuk/tidak terbentuk
cincin merah
2. Pembentukan Indol BS
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG

cincin merah
EC

cincin merah
PA

oksigen/gelembung udara
3. Uji katalase BS
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG

EC

PA
Warna setelah reaksi:

BS
4. Reduksi nitrat Warna setelah reaksi :

EC
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG

PA

zona berlapis
BS

zona berlapis
fermentasi dan
5. EC
peptonisasi susu

zona berlapis
PA
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG

Terbentuk zona jernih
zona jernih
BA

zona jernih
6. Hidrolisis kasein EC

zona jernih
PA
B. Pembahasan
Pada praktikum ini telah dilakukan pengamatan terhadap morfologi sel. Pengamatan ini
bertujuan untuk mempelajari karakteristik yang dimiliki oleh masing-masing sel dari spesies
yang berbeda dan membedakan bakteri berdasarkan bentuk dasarnya seperti berdasarkan bentuk
sel, warna sel, dan ukuran sel. Morfologi sel dari bakteri dapat diamati dengan pengecatan
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
maupun tanpa pengecatan. Terdapat berbagai cara untuk mempelajari dan mempermudah saat
pengamatan morfologi koloni, di antaranya adalah menggunakan pewarnaan atau pengecatan
bakteri dan uji sifat biokimia. Metode pewarnaan atau pengecatan bakteri merupakan metode
untuk mempelajari morfologi sel bakteri dengan memberikan warna pada dinding sel maupun
latar belakang sel (Black and Black 2015). Sebelum melakukan proses pengecatan pada sel
bakteri, terdapat suatu proses yang harus dilalui, yaitu adalah proses fiksasi. Proses fiksasi
merupakan suatu tahap yang ditujukan untuk mengawetkan atau mempertahankan bentuk dan
sifat dari bakteri yang diamati seperti ketika bakteri tersebut masih hidup. Terdapat dua cara
yang dapat dilakukan untuk melakukan fiksasi, di antaranya adalah dengan panas dan zat kimia.
Fiksasi dengan pemanasan dilakukan dengan memanaskan bakteri pada gelas benda selama
beberapa detik untuk mematikan enzim yang dapat mendegradasi struktur sel. Sedangkan fiksasi
dengan zat kimia digunakan pada bakteri yang tidak tahan panas, fiksasi ini dapat dilakukan
dengan etanol dan formaldehid (Wiley et al. 2017). Secara umum prinsip pengecatan bakteri
adalah memberikan warna pada bakteri dan mengamati kontras bakteri dengan latar belakang.
Pada percobaan pengamatan morfologi sel dengan pengecatan bakteri dilakukan tiga jenis
pengecatan, yaitu pengecatan negatif, pengecatan sederhana, dan pengecatan gram.
Pewarnaan negatif digunakan ketika bakteri tidak dapat berikatan dengan pewarna-
pewarna umum sehingga digunakan pewarna seperti Nigrosin untuk mewarnai latar belakang
sel. Hal ini mengakibatkan pada akhir akan ditunjukkan hasil berupa sel bakteri akan tampak
berwarna putih atau transparan dan terlihat jelas (Black and Black 2015). Pada percobaan
pengecatan negatif, langkah pertama yang dilakukan adalah gelas benda di bersihkan dengan
alkohol lalu dipanggang di atas spirtus kemudian didinginkan agar menjaga tetap steril.
Kemudian 1 ose biakan bakteri diambil secara aseptis untuk menghindari adanya kontaminasi
dan mendapatkan hasil sesuai dengan yang diharapkan, kemudian diletakkan pada permukaan
gelas benda. Pengambilan biakan bakteri secara aseptis dilakukan dengan memanaskan jarum
ose hingga berwarna merah pada lampu spirtus dan ditunggu hingga dingin. Pendinginan ini
bertujuan agar biakan bakteri yang akan diambil tidak mati. Ose diratakan di gelas benda,
kemudian dilakukan pemanasan menggunakan lampu spirtus, pemanasan dilakukan dengan
memanaskan bakteri pada gelas benda selama beberapa detik untuk mematikan enzim yang
dapat mendegradasi struktur sel. Kemudian larutan nigrosin diteteskan di atas bakteri tersebut
dan dikering anginkan. Sel bakteri kemudian di amati dengan menggunakan mikroskop dari
perbesaran rendah ke tinggi. Pada pengamatan sel bakteri di bawah mikroskop, ditambahkan
minyak imersi untuk memperjelas objek karena memiliki indeks refraksi tinggi, meningkatkan
daya resolusi mikroskop, menurunkan indeks bias, dan melindungi lensa objektif mikroskop.
Hasil yang diperoleh pada percobaan ini adalah Pseudomonas aeruginosa memiliki
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
bentuk sel batang (basil) dan tampak berwarna putih, Escherichia coli memiliki bentuk sel
batang (basil) dan tampak berwarna putih, serta Bacillus subtilis memiliki bentuk sel batang
(basil) dan tampak berwarna putih. Warna transparan atau putih ini dapat terjadi dikarenakan
muatan negatif pada senyawa nigrosin. Di mana pada saat senyawa nigrosin bertemu dengan
membran sel bakteri yang memiliki muatan negatif, maka cat tidak dapat berikatan dengan
membran sel bakteri karena muatannya saling tolak-menolak. Akibatnya, sel bakteri hidup tidak
terwarnai.
Pengecatan sederhana merupakan pengecatan yang hanya menggunakan satu jenis

pewarna, seperti pewarna methylene biru, safranin atau krsital violet. Pewarna-pewarna ini
umumnya disebut sebagai pewarna dasar atau pewarna positif. Hal ini dikarenakan pewarna ini
akan mengikat sel bakteri yang bersifat negatif. Oleh karena itu, sel bakteri akan berwarna biru
(Black and Black 2015). Pengecatan sederhana ini memiliki tujuan untuk mengetahui bentuk
dan viabilitas sel bakteri. Pada pengecatan sederhana, langkah pertama yang dilakukan adalah
gelas benda dibersihkan menggunakan alkohol lalu dipanggang di atas lampu spirtus kemudian
didinginkan agar steril. Kemudian 1 ose biakan bakteri diambil secara aseptis untuk
menghindari adanya kontaminasi dan mendapatkan hasil sesuai dengan yang diharapkan,
kemudian diletakkan pada permukaan gelas benda. Pengambilan biakan bakteri secara aseptis
dilakukan dengan memanaskan jarum ose hingga berwarna merah pada lampu spirtus dan
ditunggu hingga dingin. Pendinginan ini bertujuan agar biakan bakteri yang akan diambil tidak
mati. Ose diratakan di gelas benda, kemudian dilakukan pemanasan menggunakan lampu
spirtus, pemanasan dilakukan dengan memanaskan bakteri pada gelas benda selama beberapa
detik untuk mematikan enzim yang dapat mendegradasi struktur sel. Kemudian larutan
methylene blue sebanyak 1-2 tetes diberikan pada gelas dan ditunggu selama 2-5 menit agar
pewarna dan bakteri dapat bereaksi. Lalu gelas benda lalu dicuci dengan air mengalir sampai
cat tercuci untuk melunturkan pewarna yang berlebih sehingga tidak menyebabkan over
straining. Kemudian setelah dicuci, gelas benda dikering anginkan dengan tujuan untuk
mengurangi kadar air agar preparat dapat teramati dengan baik di mikroskop cahaya. Lalu sel
bakteri diamati menggunakan mikroskop dari perbesaran rendah ke tinggi. Pada pengamatan sel
bakteri di bawah mikroskop, di tambahkan minyak imersi untuk memperjelas objek karena
memiliki indeks refraksi tinggi, meningkatkan daya resolusi mikroskop, menurunkan indeks
bias, dan melindungi lensa objektif mikroskop. Hasil yang di dapatkan apada percobaan ini
adalah bakteri Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa memiliki
bentuk sel batang dan pada pewarnaan sederhana, sel bakteri yang masih hidup akan tampak
transparan dan sel bakteri yang telah mati akan terpulas warna biru.
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Berbeda dengan pewarnaan sederhana, pada pewarnaan bertingkat atau pewarnaan gram
akan menggunakan dua atau lebih pewarna, untuk pewarna yang umum digunakan ialah
pewarnaan Gram, karena pada penggunaan pewarnaan ini dapat membedakan gram positif dan
negatif. Pengecatan gram bertujuan mengamati sifat bakteri, yaitu gram positif atau gram
negatif. Pewarnaan gram terdiri dari empat tahap yaitu pertama adalah tahap pewarnaan dengan
menggunakan kristal violet yang merupakan cat utama yang memberikan perwarnaan pada
sampel, lalu adalah tahap penggunaan iodin sebagai mordan atau zat kimia untuk memperkuat
warna kristal violet atau dengan kata lain memiliki fungsi untuk mengintensifkan pengecatan
agar dihasilkan warna yang lebih pekat, selanjutnya adalah tahap pencucian zat warna dengan
etanol sebagai peluntur dan terakhir adalah tahap pewarnaan bakteri dengan safranin yang
berfungsi untuk mewarna bakteri yang tidak berikatan dengan kristal violet atau sebagai cat
penutup (Black and Black 2015). Hasil akhir dari pewarnaan ini adalah menghasilkan warna
merah pada bakteri gram negatif dan warna biru keunguan pada bakteri gram positif. Hasil
warna ini disebabkan oleh lapisan peptidoglikan pada kedua jenis bakteri tersebut, di mana
bakteri gram positif terdiri dari 40 lapis peptidoglikan sehingga peptidoglikan tersebut akan
berikatan dengan kristal violet. Sedangkan karena bakteri gram negatif memiliki lapisan
peptidoglikan yang tipis sehingga tidak dapat berikatan dengan kristal violet tetapi berikatan
dengan safranin (Riedel et al. 2019). Sel bakteri kemudian di amati dengan menggunakan
mikroskop dari perbesaran rendah ke tinggi. Pada pengamatan sel bakteri di bawah mikroskop,
ditambahkan minyak imersi untuk memperjelas objek karena memiliki indeks refraksi tinggi,
meningkatkan daya resolusi mikroskop, menurunkan indeks bias, dan melindungi lensa objektif
mikroskop. Berdasarkan pewarnaan gram, diketahui bahwa Bacillus subtilis tampak berwarna
biru sehingga bersifat gram positif, sedangkan Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa
tampak berwarna merah sehingga bersifat gram negatif. Hal ini dapat terjadi karena bakteri gram
positif memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tebal dibanding bakteri gram negatif sehingga
ketika diberi kristal violet, maka kristal violet akan berikatan dengan peptidoglikan dan
membuat bakteri tampak berwarna biru (Madigan et al 2019).
Selanjutnya adalah pengamatan morfologi koloni. Pada pengamatan ini memiliki tujuan
untuk mempelajari dan mengenal bentuk pertumbuhan, koloni, dan karakteristik berbagai koloni
pada berbagai jenis media. Pada praktikum ini digunakan 3 jenis media, yaitu media agar plate
(cawan petri), agar slant (medium miring), dan agar slab (medium tegak). Berdasarkan hasil
yang diperoleh, diketahui bahwa pada medium agar plate dengan Bacillus sulfilis diperoleh ciri
bentuk koloni circular, warna koloni putih, margin (bentuk tepi) koloni entire, dan pertumbuhan
koloni tampak tipis. Pada bakteri Escherichia coli diperoleh hasil bentuk koloni irregular, warna
koloni putih, margin (bentuk tepi) undulate dan pertumbuhan koloni tampak lebat. Kemudian
pada bakteri Pseudomonas aeruginosa diperoleh hasil berupa bentuk koloni circular, warna
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
koloni putih, margin (bentuk tepi) entire, dan pertumbuhan koloni tampak sedang.
Dari hasil dapat diketahui jika bakteri Bacillus subtilis, didapatkan pertumbuhan yang
lebat di sepanjang goresan, koloni bakteri tipis, bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan
spreading, dan warna putih untuk medium agar miring serta didapatkan bentuk pertumbuhan
filiform dan warna putih pada medium agar tegak. Kemudian pada bakteri Escherichia coli,
didapatkan pertumbuhan yang lebat di sepanjang goresan, koloni bakteri tebal, bentuk
pertumbuhan pada bekas tusukan echinulate, dan warna putih untuk medium agar miring serta
di dapatkan bentuk pertumbuhan filiform dan warna putih pada medium agar tegak. Kemudian
terakhir pada bakteri Pseudomonas aeuroginosa, didapatkan pertumbuhan yang lebat di
sepanjang goresan, koloni bakteri sedang, bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan echinulate,
dan warna putih untuk medium agar miring serta didapatkan bentuk pertumbuhan filiform dan
warna putih pada medium agar tegak.
Kemudian selanjutnya adalah percobaan uji biokimia. Pada percobaan ini bertujuan untuk
mengidentifikasi bakteri secara fisiologis berdasarkan berbagai reaksi biokimia, yaitu
fermentasi karbohidrat, pembentukan indol, uji katalase, reduksi nitrat, fermentasi dan
peptonisasi susu, serta hidrolisis kasein. Pertama adalah uji fermentasi karbohidrat. Pada uji ini
memiliki tujuan untuk mengetahui apakah bakteri mampu untuk memfermetasikan glukosa,
laktosa dan mannitol; kemudian untuk mempelajari disimilasi terhadap bermacam-macam gula
oleh bakteri; lalu untuk mengetahui sifat dan hasial senyawa yang terbentuk selama fermentasi
dan memastikan sifat masing-masing bakteri serta untuk memperkenalkan beberapa metode
deteksi pembentukan asam dan gas oleh bakteri.
Pada uji fermentasi karbohidrat, langkah pertama yang dilakukan adalah gelas benda
dibersihkan menggunakan alkohol lalu dipanggang di atas lampu spirtus kemudian didinginkan
agar steril. Kemudian 1 ose biakan bakteri diambil secara aseptis untuk menghindari adanya
kontaminasi dan mendapatkan hasil sesuai dengan yang diharapkan, kemudian diletakkan pada
permukaan gelas benda. Pengambilan biakan bakteri secara aseptis dilakukan dengan
memanaskan jarum ose hingga berwarna merah pada lampu spirtus dan ditunggu hingga dingin.
Pendinginan ini bertujuan agar biakan bakteri yang akan diambil tidak mati. Kemudian
diinokulasikan pada medium fermentasi karbohidrat yang sudah diberi indikator phenol red dan
tabung durham yang memiliki fungsi untuk mendeteksi adanya gas yang dihasilkan oleh bakteri
(Hemraj et al. 2013). Sedangkan fungsi dari phenol red adalah sebagai indikator perubahan
warna dengan trayek pH 6,8-8,2. Phenol red akan berubah warna menjadi kuning di bawah pH
6,8 dan berwarna merah mudah cerah di atas pH 8,2 (National Center for Biotechnology
Information 2021). Isolat yang dihasilkan kemudian diinokulasikan pada medium lain seperti
nutrien broth dengan laktosa cair dan nutrien dengan manitol cair. Fermentasi ini merupakan
proses yang melibatkan perubahan molekul kompleks menjadi molekul sederhana oleh
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
mikroorganisme tertentu. Molekul kompleks tersebut adalah gula yang akan dikonversi menjadi
alkohol dan CO2 dalam keadaan anaerobik (Abiola & Oyetayo, 2016). Hasil positif pada uji
fermentasi ini diindikasikan dengan adanya perubahan warna dari merah menjadi kuning, serta
terdapat gelembung gas pada durham. Jika tidak terjadi perubahan warna, maka fermentasi tidak
berlangsung pada media tersebut. Berdasarkan hasil akhirnya, maka bakteri dapat dikatakan
homofermentatif atau heterofermentatif. Secara sederhana, proses fermentasi dapat
digambarkan sebagai berikut
Gambar 1. Proses fermentasi karbohidrat (Sari et al. 2016)
Berdasarkan hasil yang diperoleh pada percobaan ini, dapat diketahui jika bakteri Bacillus
subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa mampu mengubah glukosa, manitol,
dan laktosa menjadi alkohol. Bakteri Bacillus subtilis dan Pseudomonas aeruginosa dapat
mengubah warna larutan dari merah menjadi kuning dan tampak adanya gelembung yang
dihasilkan sehingga kedua bakteri tersebut bersifat heterofermentatif, sedangkan pada bakteri
Escherichia coli hanya ditemukan perubahan warna tanpa adanya gelembung gas sehingga
bakteri E.coli bersifat homofermentatif. Lalu pada medium larutan laktosa cair, terjadi
perubahan warna larutan dari merah menjadi kuning secara tidak sempurna, dimana perubahan
warna terjadi dengan adanya lapisan berwarna merah pada permukaan lapisan. Di antara ketiga
bakteri, lapisan merah pada bakteri Escherichia coli tampak paling sedikit dibanding bakteri
lainnya sehingga diketahui bahwa bakteri E. coli memiliki daya fermentasi terhadap laktosa
yang lebih tinggi dibandingkan yang lain. Kemudian dari ketiga bakteri yang digunakan tidak
ditemukan gelembung udara sehingga dapat dikatakan bahwa bakteri bersifat homofermentatif
terhadap laktosa. Selanjutnya adalah fermentasi karbohidrat dengan larutan mannitol. Pada
larutan ini dapat diketahui jika bakteri Bacillus subtilis mengalami fermentasi secara sempurna
yang ditandai dengan perubahan warna secara menyeluruh dan adanya gelembung udara
sehingga diketahui bahwa bakteri ini bersifat heterofermentatif terhadap mannitol. Sedangkan
pada bakteri Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa tidak mampu memfermentasikan
secara sempurna, hal ini dibuktikan dengan terdapatnya lapisan berwarna merah di permukaan
lapisan. Tetapi pada bakteri Pseudomonas aeruginosa ditemukan adanya gelembung udara dan
pada Escherichia coli tidak sehingga diketahui bahwa Pseudomonas aeruginosa bersifat
heterofermentatif dan E. coli bersifat homofermentatif. Pola fermentasi hemofermentatif
ditandai dengan dihasilkannya asam laktat, sedangkan heterofermentatif ditandai dengan
dihasilkannya asam laktat, etanol, dan CO2 (Madigan et al. 2019).
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Gambar 2. Reaksi fermentasi glukosa pada bakteri homofermentatif dan

heterofermentatif (Madigan et al. 2019) P 472
Kedua adalah percobaan pembentukan indol. Pada percobaan ini memiliki tujuan untuk
menguji apakah bakteri dapat bereaksi dengan triptofan untuk membentuk cincin indol. Medium
yang digunakan dalam percobaan ini adalah triptofan cair. Pada percobaan pembentukan indol
langkah pertama yang harus dilakukan adalah jarum ose dipanaskan pada bunsen dan di
dinginkan sejenak agar steril. Selanjutnya, masing-masing tabung media yang sama dengan
biakan murni Bacillus subtilis, E. coli, dan Pseudomonas aeruginosa diinokulasi dalam media
tryptophan cair menggunakan ose secara aseptis, kemudian terdapat satu tabung lain yang
dijadikan sebagai uji kontrol. Lalu tabung tersebut diletakkan secara teratur pada rak tabung dan
diinkubasi pada temperatur kamar selama 48 jam. Selama masa inkubasi tersebut enzim
triptofanase pada bakteri akan memecah indol asam piruvat sehingga amonia akan bekerja.
Setelah proses inkubasi selesai ditambahkan eter yang berfungsi untuk menguraikan asam
amino triptofan sehingga membentuk indol, piruvat, dan amonia ke dalam medium dan di gojog
hingga terbentuk dua lapisan. Selanjutnya ditambahkan Reagen erlich yang berfungsi sebagai
indikator atau agen pengkondensasian indol. melalui dinding atau tepi tabung untuk mencegah
reaksi spontan. Perubahan yang terjadi di amati: jika reaksi positif maka akan terbentuk cincin
merah, sementara jika reaksi negatif maka warna larutan tetap. Uji pembentukan indol memiliki
konsep pengubahan senyawa triptofan menjadi indol oleh enzim triptofanase melalui proses
deaminasi dan hidrolisis.
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Gambar 3. Reaksi pembentukan indol (Hemraj et al. 2013)
Berdasarkan uji pembentukan indol, diperoleh hasil negatif pada ketiga bakteri Bacillus
subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa atau dengan kata lain pada ketiga
bakteri ini tidak menunjukkan adanya cincin merah. Hal ini tidak sesuai dengan teori karena
Escherichia coli seharusnya menunjukkan cincin merah pada uji pembentukan indol. Tidak
terbentuknya cincin merah dapat dipengaruhi oleh faktor seperti konsentrasi triptofan serta
jumlah reagen erlich yang digunakan. Seharusnya hasil negatif menunjukkan bahwa tidak
adanya enzim triptofanase pada bakteri, sehingga enerti untuk memecah triptofan tidak ada dan
membuat bakteri tidak dapat menjadikan triptofan sebagai sumber energi (Pattuju et al. 2014).
Ketiga adalah uji katalase. Pada uji katalase ini memiliki tujuan untuk mengetahui adanya
aktivitas enzim katalase sehingga dapat diketahui apakah bakteri uji tergolong aerob atau
anaerob dan digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memproduksi enzim
katalase yang digunakan untuk detoksifikasi hidrogen peroksida (H2O2). Medium yang
digunakan adalah medium natrium agar. Langkah pertama yang dilakukan pada uji ini adalah
dilakukan teknik aseptis pada area kerja agar steril. Kemudian isolat yang sudah berumur 24
jam dikultur dan diinokulasikan kepada gelas benda menggunakan jarum ose. Selanjutnya H2O2
ditambahkan sebanyak 2-3 tetes dan ditunggu selama 4 menit agar memberikan waktu untuk
terjadinya reaksi. Bakteri menggunakan enzim katalase untuk mempertahankan diri dari H2O2
yang bersifat toksik terhadap sel bakteri. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya oksigen
berupa gelembung udara. Hal ini dapat terjadi karena perpecahan hidrogen peroksida oleh enzim
katalase menjadi air dan oksigen dan reaksi positif ditandai dengan terbentuknya gelembung
(Reiner, 2010). Proses uji katalase dapat digambarkan sebagai berikut :
Gambar 4. Reaksi enzim katalase (Reiner, 2010)
Berdasarkan hasil yang didapatkan dapat diketahui bahwa pada bakteri Bacillus subtilis,
Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa diperoleh hasil positif yang ditunjukkan dengan
terbentuknya gelembung berwarna putih pada permukaan gelas benda. Hal ini sesuai dengan
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
literatur yang ada, yaitu pada percobaan yang dilakukan oleh Iwase et al. (2013) yang
menggunakan bakteri E. coli untuk menguji aktivitas enzim katalase bakteri ketika diberi
hidrogen peroksida dan menghasilkan hasil yang positif, di mana bakteri E. coli memiliki dua
jenis enzim katalase yang disebut HPI dan HPII di mana keduanya akan disekresikan pada
kondisi tertentu (Iwase et al. 2013). Hasil ini menunjukkan bahwa ketiga bakteri tersebut
merupakan bakteri aerob.
Keempat merupakan uji reduksi nitrat. Pada uji nitrat dilakukan untuk mengetahui apakah
bakteri dapat mereduksi nitrat menjadi nitrit. Media yang digunakan dalam uji ini adalah media
nitrat cair dengan larutan asam sulfanilat dan larutan alfa naphthylamine. Selain itu uji reduksi
nitrat juga dapat digunakan untuk mengetahui kemampuan suatu bakteri untuk menggunakan
NO3- sebagai akseptor elektron. Dalam percobaan uji nitrat digunakan asam sulfanilat dan α-
naphthylamine yang berperan dalam proses pembentukan kompleks berwarna merah. Pada uji
ini, NO3- akan direduksi menjadi NO2- oleh enzim nitrat reduktase (Buxton, 2016).
Pada uji reduksi nitrat pertama-tama dilakukan teknik aseptis agar steril. Biakan murni
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeuroginosa diinokulasi menggunakan jarum
ose dan satu tabung tidak diinokulasi sebagai uji kontrol. Biakan tersebut diinkubasi pada
temperatur kamar 37°C selama 48 jam. Kemudian pemngamatan dilakukan untuk mengamati
pembentukan nitrit dengan pengujian reduksi nitrat sebagai berikut: masing-masing biakan cair
ditambahkan 1 ml asam sulfanilat (larutan A) dan 1 ml larutan alpha naftilamin (larutan B)
kemudian digojog sampai rata. Larutan asam sulfanilat berfungsi sebagai pelarut, sedangkan
larutan alpha naftilamin berfungsi sebagai pewarna. Perubahan warna yang terjadi diamati. Jika
terbentuk warna merah menunjukan adanya nitrit. Reaksi pada uji reduksi nitrat dapat
digambarkan sebagai berikut.
Gambar 2. Proses reduksi nitrat (Buxton, 2016)

No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Berdasarkan hasil percobaan, diperoleh hasil positif pada Bacillus subtilis dan hasil
negatif pada Escherichia coli dan Pseudomonas aeuroginosa. Hasil praktikum ini tidak sesuai
dengan literatur yang digunakan, karena Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri yang
mampu mereduksi nitrat menjadi nitrit sehingga seharusnya terjadi perubahan warna larutan
menjadi merah (Scoffield & Wu 2016). Hal ini juga dapat dipengaruhi oleh aktivitas reduksi
nitrat dari beberapa bakteri yang berjalan lebih lambat dibanding bakteri lainnya. Selain itu,
kemungkinan terjadi reduksi nitrat menjadi gas N2 sehingga menyebabkan kompleks berwarna
merah tidak terbentuk. Oleh karena itu pada beberapa medium yang menghasilkan gelembung
udara tetapi tidak terjadi perubahan warna ditambahkan senyawas zinc untuk mengetahui
keberadaan nitrit. Sementara itu, hasil untuk Bacillus subtilis sudah sesuai dengan literatur, yaitu
mampu mereduksi nitrat menjadi nitrit. Bakteri yang telah tereduksi dari nitrat menghasilkan
nitrit. Nitrit kemudian bergabung dengan asam sulfanilat dan membentuk garam diazonil.
Garam diazonil lalu bereaksi kembali dengan alfa naphtilamin sehingga menghasilkan warna
merah (Buxton 2016).
Kelima adalah uji fermentasi dan peptonisasi susu. Pada uji ini memiliki tujuan untuk
untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim laktase yang mampu
memecah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa serta untuk mengetahui apakah bakteri dapat
mengubah protein menjadi pepton terlarut. Medium yang digunakan dalam uji ini adalah
medium susu dengan BCPM (Brom Cresol Purple Milk). Pada uji ini medium BCPM
diinokulasi menggunakan bakteri Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas
aeuroginosa, Kemudian diinkubasi pada termperatur kamar selama 48 jam. Setelah itu kultur
bakteri diamati perubahan yang terjadi pada medium pertumbuhan. Perubahan yang diamati
adalah penggumpalan, pembentukkan zona berlapis, perubahan warna.
Berdasarkan hasil percobaan yang di dapatkan, dapat diketahui pada bakteri Bacillus
subtilis, Escherichia coli, maupun Pseudomonas aeruginosa menunjukkan hasil yang positif,
hasil positif tersebut ditandai dengan terbentuknya zona berlapis yang terjadi karena
penggumpalan dan perubahan warna dari biru menjadi kuning karena situasi larutan asam.
Medium BCPM bersifat netral lalu menjadi basa (biru) ketika peptonisasi terjadi, dan fermentasi
akan merubah warna BCPM menjadi kuning. Penggumpalan kasein terjadi dikarenakan adanya
kadar asam organik yang terdapat pada disakarida yang terfermentasikan pada laktosa
Penggumpalan susu akan meningkatkan periode aksi enzim pepsin, yang akan mengubah kasein
jadi pepton. Peptonisasi merupakan proses perombakan kasein menjadi pepton-pepton terlarut
dengan hidrolisis protein. Pada proses ini, kasein akan dihidrolisis menjadi renin dan
membentuk parakasein dan whey. Parakasein dan whey kemudian diubah oleh pepsin menjadi
pepton. Hasil pada percobaan ini telah sesuai dengan literatur yang digunakan, di mana menurut
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
penelitian Fernandez et al. (2015) yang menyatakan bahwa bakteri Pseudomonas aeruginosa
dan E. coli banyak ditemukan pada produk susu dan menyebabkan fermentasi yang merusak
kualitas produk. Bakteri Bacillus sp. juga digunakan dalam fermentasi susu menjadi produk
tertentu.
Terakhir adalah uji hidrolisis kasein. Pada uji ini dilakukan untuk megetahui kemampuan
bakteri dalam menghidrolisis kasein pada susu. Kasein sendiri merupakan suatu protein utama
yang memiliki kemampuan untuk bereaksi dengan asam basa dan ditemukan dalam bentuk
koloid pada susu. Kasein merupakan makromolekul yang terdiri dari asam amino yang
dihubungkan bersama oleh ikatan peptida. Langkah pertama pada percobaan ini adalah dengan
dilakukan inokulasi pada masing-masing medium kasein menggunakan biakan murni Bacillus
subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeuroginosa dengan metode streak secara aseptis.
Kemudian cawan ditutup lalu di-seal untuk menghindari adanya kontaminan dan dibungkus
dengan kertas sampul untuk menghindari paparan cahaya secara langsung kepada kultur.
Kemudian biakan tersebut diinkubasi pada suhu 35°C selama 48 jam dan diamati perubahan
yang terjadi. Berdasarkan hasil percobaan yang diperoleh, dapat diketahui jika pada seluruh
biakan menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan terbentuknya zona jernih. Zona bersih
ini dapat terjadi dikarenakan proses hidrolisis dari kasein, di mana pada beberapa
mikroorganisme memiliki kemampuan untuk menurunkan protein kasein dengan menghasilkan
exo-enzim proteolitik yang disebut protease. Proses ini memecah ikatan peptida dengan
memasukkan air ke dalam molekul yang membebaskan kumpulan asam amino terlarut untuk
digunakan dalam sintesis protein seluler struktural dan fungsional. Sementara itu, medium di
sekeliling zona jernih tetap buram karena media membiaskan sinar cahaya pada pembentukan
suspensi koloid dari kasein (Hemraj et al. 2013).
V. Kesimpulan
Kesimpulan dari praktikum kali ini adalah sebagai berikut.
a. Bakteri Bacillus subtilis memiliki bentuk basil dan tergolong sebagai bakteri gram positif yang
ditandai dengan warna biru pada pengecatan gram, Escherichia coli dan Pseudomonas
aeruginosa memiliki bentuk sel basil dan tergolong bakteri gram negatif yang ditandai dengan
warna merah pada pengecatan gram.
b. Pada medium agar miring, Bacillus subtilis memiliki bentuk pertumbuhan spreading,
sedangkan Pseudomonas aeruginosa dan Escherichia coli memiliki bentuk pertumbuhan
echinulate. Pada medium agar tegak diperoleh bentuk pertumbuhan filiform untuk ketiga
bakteri. Pada medium agar miring, Bacillus subtilis dan Pseudomonas aeruginosa memiliki
bentuk koloni circular dan bentuk tepi koloni entire, sedangkan Escherichia coli memiliki
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
bentuk koloni irregular dan bentuk tepi koloni undulate.

c. Pada uji reaksi biokimia, baik pada bakteri Bacillus subtilis, Escherichia coli, maupun
Pseudomonas aeruginosa memiliki hasil dan reaksi yang berbeda. Hal ini menunjukkan
kemampuan fisiologis bakteri yang berbeda-beda.
VI. Daftar Pustaka
Abiola, C., Oyetayo, V. O. 2016. Isolation and Biochemical Characterization of Microorganisms

Associated with the Fermentation of Kersting's Groundnut (Macrotyloma geocarpum).
Research Journal of Microbiology, 11(2-3): 48.
Black, J. G., Black, L. J. 2015. Microbiology Principles and Explorations. Ninth edition. New
Jersey, John Wiley & Sons Inc., p. 69-70.
Buxton, R. 2011. Nitrate and Nitrite Reduction Test Protocols. American Society For
Microbiology, p. 3.
Fernandez, M., Hudson, J. A., Korpela, R., Reyes-Gavilan, C. G. 2015. Impact on Human Health
of Microorganisms Present in Fermented Dairy Products: An Overview. BioMed Research
International, (1)1: 6.
Hemraj, V., S. Diksha, and G. Avneet. 2013. A review of commonly used biochemical test for
bacteria. Innovare Journal of Life Science, 1(1): 1-7.
Iwase, T., Tajima, A., Sugimoto, S, Okuda, K., Hironaka, I., Kamata, Y., Takada, K., Mizunoe, Y.
2013. A Simple Assay for Measuring Catalase Activity: A Visual Approach. Scientific
Reports, (1) 3: 1.
Kandi, V. 2015. Bacterial Colony: First Report of Donut Colony Morphology among Diphtheroids
Isolated in Blood. Cureus. 7(1): 1.
MacWilliams, M. P. 2009. Indole Test Protocol. American Society For Microbiology, p. 1-2.
Madigan, M. T., Bender, K. S., Buckley, D. H., Sattley, W. M., and Stahl, D. A. 2019. Brock
Biology of Microorganisms, 15th ed. Harlow: Pearson Education, pp. 54-624.
National Center for Biotechnology Information. 2021. PubChem Compound Summary for CID
4766, Phenol red.
Pattuju, S. M., Fatimawali, and A. Manampiring. 2014. Identifikasi bakteri resisten merkuri pada
urine, feses dan kalkulus gigi pada individu di Kecamatan Malalayang, Manado, Sulawesi
Utara. Jurnal e-Biomedik, 2(2): 532-540.
Rajashekhar, M., Shahanaz, Kalia, V. K. 2017. Biochemical and molecular characterization of

Bacillus spp. isolated from insects. Journal of Entomology and Zoology Studies. 5(5): 584.
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Riedel, S., Morse, S. A., Mietzner, T., Miller, S. 2019. Jawetz, Melnick, & Adelberg’s Medical
Microbiology. Twenty-eighth edition. New York, McGraw-Hill, p. 23-24.
Sari, D. Y. R., Saputro, T. B., Muhibbudin, A. 2016. Uji Potensi Fermentasi Etanol Yeast Tanah
yang Diisolasi dari Metode Budidaya SDN di Daerah Batu, Jawa Timur. Jurnal Sains dan
Seni ITS, 5(2): 39, 41.
Scoffield, J. A., Wu, H. 2016. Nitrite reductase is critical for Pseudomonas aeruginosa survival
during co-infection with the oral commensal Streptococcus parasanguinis. Microbiology,
162: 378.
Sumampouw, D. J. 2019. Mikrobiologi Kesehatan. Yogyakarta. Deepublish. P:15.
Willey, J. M., Sherwood, L. M., Woolferton, C. J. 2017. Prescott’s Microbiology. Tenth edition.
New York, McGraw-Hill Education, p. 32.
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
Lampiran
ACC
16/03/2021
Nama : Diaz Ayu Anjani
NIM : 19/441269/BI/10261
Golongan(hari) : A (Selasa)
Asisten : Bella Ulin
ACARA 2
KARAKTERISASI MIKROBIA
A. MORFOLOGI JAMUR BENANG
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
B. MORFOLOGI KHAMIR DAN SPORA KHAMIR
1. Pengamatan morfologi khamir

No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
2. Pengamatan spora khamir

No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
C. MORFOLOGI DAN PENGECATAN BAKTERI

1. Pengamatan bentuk-bentuk sel bakteri dengan pengecatan negatif
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
2. Pengamatan sel bakteri dengan pengecatan sederhana

No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
3. Pengamatan sifat-sifat sel bakteri dengan pengecatan gram
1 ose suspensi bakteri

gelas benda dibersihkan
diletakkan di permukaan
dengan alkohol dan
gelas benda
dipanggang diatas lampu
dibubuhkan larutan cat (gram diratakan dengan ose dan

A) utama pada permukaan dikeringkan lalu difiksasi
preparat didiamkan 1 menit diatas lampu spiritus
dicuci dengan peluntur (gram

cuci dan dikeringkan lalu C0 sampai tampak pucat lalu
dibubuhkan larutan Mordan dicuci air mengalir dan
(gram B) didiamkan 1 menit dikeringkan
diamati dengan mikroskop diteteskan cat penutup (gram

10x100 dan diberi minyak D) dibiarkan 2 menit, dicuci
imersi dan dikeringkan
diperhatikan dan digambar

serta diberi keterangan
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
4. Pengamatan sel bakteri dengan pengecatan tahan asam atau pengecatan Ziehl Neelsen
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
5. Pengecatan spora bakteri Scheffer dan Fulton

No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
6. Pengecatan spora Bartholomew dan Mittwer
gelas benda dibersihkan dibuat lapisan tipis suspensi

dengan alkohol dan Bacillus subtilis, difiksasi
dipanggang diatas lampu diatas lampu spiritus 20 kali
spiritus
diteteskan larutan cat safranin dibubuhkan cat malachite

selama 5 detik, lalu dicuci green dibiarkan 10 menit, lalu
dengan air dan dikeringkan dicuci dan dikeringkan
ditambah minyak imersi lalu

diamati dengan mikroskop digambar dan diberi
perbesaran 100x10 keterangan
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
D. Morfologi koloni bakteri
petri yang telah diberi

biakan murni Bacillus subtilis
medium agar dibuka selama 5
atau E. colli diinokulasikan ke
menit lalu ditutup kembali
medium agar tegak, medium
dan dibungkus kertas sampul
agar miring, dan medium cair
diamati dan digambar semua kultur diinkubasi pada

pertumbuhan koloni pada temperatur kamar selama 24-
ketiga medium 48 jam
pada medium tegak dan pengamatan medium cair

miring yang diamati: bentuk yaitu: pertumbuhan, bentuk
pentumbuhan, kenampakan pertumbuhan di permukaan,
samping, kenampakan kilat, kekeruhan, bau, endapan
topografi, warna, bau
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG

No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
3. Pembentukan indol
diamati terbentuknya
diinokulasikan 2 tabung
inkubasikan pada indol dengan
media dengan biakan murni
temperatur kamar selama menambahkan eter ke
Bacillus subtilis atau E. colli
48 jam semua tabung dan
dan 1 tabung sebagai kontrol
Di gojog
diamati adanya cincin merah didiamkan sampai terbentuk

diantara kedua lapisan, cincin dua lapisan lalu
merah menunjukkan ditambahkan reagen Ehrlich
terbentuknya indol melalui tepi tabung
4. Reduksi nitrat
diamati terbentuknya nitrit
diinokulasikan 2 tabung media dengan menambahkan1 ml

inkubasikan pada
dengan biakan murni Bacillus asam sulfanilat (larutan A)
temperatur kamar
subtilis atau E. colli dan 1 dan 1 ml larutan alpha
selama 48 jam
tabung sebagai kontrol naftilamin (larutan B) lalu
digojog
diamati perubahan warna
yang terjadi, apabila terbentuk

hasil dicatat dalam tabel
warna merah menunjukkan
adanya nitrit
No FO-UGM-BI-07-13
BORANG
5. Peptonisasi dan fermentasi susu
diinokulasikan 2 tabung media

diinkubasikan pada
BCPM dengan biakan murni Bacillus
temperatur kamar
subtilis atau E. colli dan 1 tabung
selama 48 jam
sebagai kontrol
diamati perubahan warna dan

hasil dicatat dalam tabel penggumpalan serta terbentuknya
zona berlapis -lapis pada medium

Acara 2 - Diaz Ayu - Koreksi

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Deskripsi Asli:

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Acara 2 - Diaz Ayu - Koreksi

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

No FO-UGM-BI-07-13

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 1

Nama : Diaz Ayu Anjani

UNIVERSITAS GADJAH MADA

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 2

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 3

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 4

Kemudian pada praktikum ini, digunakan bahan-bahan di antaranya adalah akuades,

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 5

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 6

warna, bentuk tepi, dan pertumbuhan koloni.

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 7

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 8

Bentuk bakteri : Basil

Bentuk bakteri : Basil

Bentuk bakteri : Basil

Bentuk bakteri :Basil

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 9

Warna bakteri: Merah

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 10

Tabel 2. Pengamatan Morfologi Koloni

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 11

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 12

Tabel 3. Pengujian Sifat Biokimia

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 13

Warna setelah reaksi

Warna setelah reaksi

Warna setelah reaksi

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 14

Warna setelah reaksi :kuning

Warna setelah reaksi

Warna setelah reaksi

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 15

Warna setelah reaksi

Warna setelah reaksi

Perubahan setelah reaksi :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 16

Perubahan setelah reaksi :

Perubahan setelah reaksi :

Perubahan setelah reaksi :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 17

Perubahan setelah reaksi :

Perubahan setelah reaksi :

Warna setelah reaksi:

4. Reduksi nitrat Warna setelah reaksi :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 18

Warna setelah reaksi:

Warna setelah reaksi:

Warna setelah reaksi:

Warna setelah reaksi:

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 19

Perubahan setelah reaksi :

Perubahan setelah reaksi :

Perubahan setelah reaksi :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 20

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 21

Pengecatan sederhana merupakan pengecatan yang hanya menggunakan satu jenis

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 22

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 23

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 24

Gambar 1. Proses fermentasi karbohidrat (Sari et al. 2016)

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 25