Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen

bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat
tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka
penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi sebagian mikroba seperti
bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe
media memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen
test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray, 2005).
Suatu enzim adalah suatu katalis biologis. Hampir tiap rekasi biokimia dikatalis oleh enzim. Enzim
merupakan katalis yang lebih efisien daripada kebanyakan katalis laboratorium atau industri. Enzim juga
memungkinkan suatu selektivitas pereaksi-pereaksi dan suatu pengendalian laju reaksi yang tidak
dimungkinkan oleh kelas katalis lain. Kespesifikan enzim disebabkan oleh bentuknya yang unik dan oleh
gugs-gugus polar (atau non polar) yang teedapat dalam struktur enzim tersebut. Beberapa enzim bekerja
bersama suatu kofaktor non protein, yang dapat berupa senyawa organik maupun anorganik (Lehninger,
1995).

Berikut beberapa uji biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri antara lain:

Uji gula-gula (Glukosa, Laktosa, Sukrosa dan Manitol)

Uji ini dilakukan untuk mengindetifikasi bakteri yang mampu memfermentasikan karbohidrat. Pada uji
gula-gula hanya terjadi perubahan warna pada media glukosa yang berubah menjadi warna kuning,
artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi glukosa. Pada media glukosa juga terbentuk
gelembung pada tabung durham yang diletakan terbalik didalam tabung media, artinya hasil fermentasi
berbentuk gas (Oktarina, 2010). Reaksi fermentasi gula yaitu :

fermentasi

C6H12O6 C2H5OH+ CO2 + asam

Menurut Robert, dkk (1959), Escherichia coli dapat melakukan fermentasi glukosa dan laktosa,
sementara itu sukrosa tidak dapat difermentasikannya. Pada Bacillus subtilis dapat melakukan fermentasi
terhadap glukosa dengan hasil yang tidak terjadi perubahan.

Hidrolisis pati

Menurut Jutono (1980), suatu bakteri mempunyai suatu enzim yang dapat menghidrolisis polisakarida,
misalnya pati menjadi senyawa gula yang lebih sederhana. Suatu bakteri yang mempunyai enzim amilase
dapat menghidrolisis pati (suatu polosakarida) menjadi maltosa (disakarida). Reaksi hidrolisis pati
menjadi maltosa adalah sebagai berikut :

amilase
2 ( C6H2O9)n +n H2O n C12H22O11

bakteri

Menurut Sale (1961), amilase adalah enzim ekstraseluler yang disekresi oleh bakteri untuk mengubah
pati yang tidak dapat terdifusi. Fraksi terdifusi dapat masuk ke dalam sel dan diproses oleh enzim
intraseluler. Fraksi terdifusi di dalam sel oleh enzim maltase dihidrolisis lebih jauh menjadi D-glukosa.
Hasil dari fermentasi pati merupakan hasil dari penggunaan glukosa intraseluler. Keberadaan amilase
dapat diamati dengan menyaring kultur broth dan mencampunya dengan pati. Menghilangnya pati
menunjukkan keberadaan amilase. Ini dapat langsung diketahui dengan menambahkan beberapa teets
larutan iodin. Warna biru menunjukkan keberadaan pati, warna coklat menunjukkan hidrolisis sempurna
dari pati menjadi maltase.

Menurut Robert, dkk (1959) Escherichia coli tidak dapat melakukan hidrolisa pati, sementara Bacillus
subtilis dapat melakukan proses hidrolisis pati. Proses hidrolisa ini biasanya memecah suatu gula yang
kompleks menjadi suatu susunan gula yang sederhana, untuk mendeteksi peristiwa ini dilakukan dengan
cara pemberian iod. Iod biasanya akan bereaksi dengan pati dan akan berwarna biru. Hal ini
menunjukkan bahwa tidak terjadi hidrolisa bila pati pun dapat bereaksi dengan iodium dan
menghasilkan warna biru, hal ini dapat terjadi disebabkan oleh karena pati belum terpecah menjadi
senyawa sederhana sehingga komponen yang bereaksi sengan iodium adalah pati.Eschericia coli
memiliki sifat biokimia yaitu jika diinokulasi pada medium glukosa, laktosa, dan sukrosa dapat melakukan
fermentasi dengan membeentuk asam dan gas. Eschericia coli juga dapat menghidrolisis amilum, pati,
membentuk indol pada medium triptofan, dapat mereduksi nitrat, dan memfermentasi susu dengan
menghasilkan asam. Bacillus subtillis jika diinokulasi dalam medium glukosa yaitu jika diinokulasi dalam
medium glukosa dan sukrosa dapat membentuk gas, pada medium laktosa tidak dapat menghasilkan
asam maupun gas. Bacillus subtillis tidak dapat membentuk indol pada medium triptofan, mereduksi
nitrat, dan pada medium susu dapat melakukan fermentasi dan peptonasi (Breeds, 1957).

Sifat-sifat biokimia dari bakteri meliputi hidrolisa lemak, penguraian protein, perubahan karbohidrat,
serta reduksi bermacam-macam unsur. Gula dapat difermentasi menjadi alkohol, asam atau gas.
Tergantung pada gula dan jenis bakterinya. Escherichia coli dapat memfermentasikan sukrosa, glukosa,
dan laktosa. Pada sukrosa cair, padat dan glukosa cair, padat serta laktosa padat yang pertama terbentuk
adalah asam dan gas (Pelczar dan Chan , 1988).

Tabel 1. Fermentasi Karbohidrat

Bakteri Medium Warna awal Warna akhir Asam Gas Reaksi

E. coli Laktosa padat Hijau tua Kuning Ada Ada

Laktosa cair Merah Kuning Ada Ada

Glukosa padat Hijau tua Kuning Ada Ada

Glukosa cair Merah

Sukrosa padat Hijau tua Hijau tua Ada Ada

B.subtilis Laktosa padat Hijau tua Hijau muda Ada

Laktosa cair Merah

Glukosa padat Hijau tua Hijau muda Ada

Glukosa cair Merah Kuning Ada Ada

Sukrosa padat Hijau tua kuning ada

Tabel 3. Hidrolisis pati

Bakteri

Warna awal

Warna akhir

Reaksi

E. coli

Putih susu
Coklat

B. subtilis

Putih susu

Coklat

Uji fermentasi dilakukan dengan medium glukosa padat dan cair, sukrosa padat dan cair, laktosa padat
dan cair. Fermentasi adalah penggunaan piruvat atau derivatnya sebagai aseptor electron untuk
mengoksidasi NADH menjadi NAD. Sedangkan fermentasi karbohidrat adalah perombakan monosakarida
menjadi alkohol, gas karbondioksida, asam organik dan energi dengan bantuan mikrobia. Adanya asam
organik akan mengubah pH medium sehingga indikator akan memberikan respon dan terjadi perubahan
warna pada medium. Pada indicator fenol merah yang digunakan jika dalam kondisi asam akan menjadi
berwarna kuning. Semua jenis medium cair diberi tabung durham untuk menangkap gas yang terbentuk
akibat hasil metabolisme sel bakteri.

Pada medium laktosa padat Escherichia coli terbentuk gas pada tabung durham dan warna medium dari
hijau tua berubah menjadi berwarna kuning, sedangkan pada Bacillus subtilis tidak terbentuk adanya gas
dan warna akhirnya menjadi hijau muda dan hasil keduanya adalah positif. Hal ini menunjukkan bahwa
kedua bakteri ini mempunyai enzim laktose yang mampu menghidrolisis laktosa cair menjadi
monosakarida yaitu glukosa dan galaktosa. Pada medium laktosa cair, warna akhir Escherichia coli adalah
kuning dan terbentuk gas sehingga menunjukkan hasil positif, sedangkan pada Bacillus subtilis tidak
terjadi perubahan warna sehingga hasilnya negatif. Hal ini menunjukkan bahwa Bacillus subtilis tidak
mempunyai enzim laktose yang mampu menghidrolisis laktosa cair menjadi monosakarida yaitu glukosa
dan galaktosa.
Pada medium glukosa padat, warna akhir Escherichia coli adalah kuning, sedangkan pada Bacillus subtilis
warna akhirnya menjadi hijau muda dan hasil keduanya adalah positif. Pada medium glukosa cair, tidak
terjadi perubahan warna pada Escherichia coli dan hasilnya adalah negatif, sedangkan pada Bacillus
subtilis warna akhirnya menjadi hijau muda dan hasilnya adalah positif. Hal ini mungkin dikarenakan
adanya kontaminasi dari bakteri lain yang mampu melakukan fermentasi pada medium glukosa.

Pada medium sukrosa padat, Escherichia coli tidak terjadi perubahan warna tetapi hasilnya positif karena
terbentuk gas dari tabung durham, sedangkan pada Bacillus subtilis warna akhir medium menjadi kuning
dan hasilnyapun positif. Dari hasil tersebut dapat diketahui juga kedua bakteri tersebut mempunyai
enzim sukrose yang mampu menghidrolisis sukrosa menjadi monosakarida yaitu glukosa dan fruktosa.

Adanya perubahan warna pada medium yang berisi biakan bakteri sampel yang membuktikan bahwa
bakteri tersebut mempunyai enzim untuk mengubah struktur gula menjadi produk fermentasi.
Perubahan warna ini juga menandakan bahwa medium terbentuk asam dan asam ini akan menyebabkan
pH medium turun sehingga indikator phenol red menunjukkan perubahan warna dari warna semula
merah ataupun dari warna hijau tua.

Uji biokimia selanjutnya adalah uji kemampuan bakteri dalam menghidrolisis pati. Kemampuan
menghidrolisa pati diketahui dengan cara memberikan larutan iodium pada medium yang sudah
diinkubasi. Perubahan warna diamati, pati yang terhidrolisis bakteri akan membentuk warna jernih
ketika diberi iodium. Pati yang tidak terhidrolisis akan tetap berwarna biru, menandakan bahwa amilum
masih dikandung oleh medium dan tidak dihidrolisis bakteri. Larutan iod dalam uji ini menjadi indikator
adanya hidrolisa pati. Hasil yang didapatkan setelah penetesan iod pada E. coli dan B. subtilis adalah
terjadi perubahan warna dari putih susu menjadi berwarna coklat yang menunjukkan reaksi yang terjadi
adalah positif.

https://anitamuina.wordpress.com/tag/sukrosa/
Mikroorganisme seperti juga makhluk hidup yang lainnya, memerlukan energi untuk kelangsungan
hidupnya. Energi ini diperoleh dari lingkungan sekitarnya dalam bentuk senyawa kimia tertentu yang
diurai melalui reaksi biokimia semu yang disebut reaksi metabolisme (Ristiati, 2000). Reaksi metabolisme
merupakan semua reaksi kimia yang terjadi dalam organisme hidup untuk memperoleh dan
menggunakan energi sehingga organisme dapat melaksanakan berbagai fungsi hidupnya. Aktivitas
metabolisme dilaksanakan oleh enzim-enzim, yaitu suatu biokatalisator yang dapat mengkatalis reaksi
kimia di dalam sel. Metabolisme juga berarti seretentan reaksi kimia yang terjadi di dalam sel hidup.
(Waluyo, 2004).

Beberapa mikroorganisme diketahui mempunyai enzim yang berguna untuk memecah senyawa-senyawa
komplek polisakarida. Enzim-enzim ini merupakan enzim ekstra seluler yang memecah senyawa dengan
hidrolisa. Karbohidrase adalah enzim yang menghidrolisa polisakarida menjadi maltose dan glukosa, hasil
hidrolisa dapat dideteksi dengan menggunakan lugol. Fermentasi karbohidrat yang terjadi secara aerob
dan anaerob merupakan aktivitas lanjutan reaksi enzimatis, terhadap glukosa menjadi asam organik,
alkohol atau gas CO2

Kemampuan memfermentasikan berbagai karbohidrat dan produk fermentasi yang dihasilkan

merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi mikroorganisme. Hasil akhir dari fermentasi
karbohidrat ini ditentukan oleh sifat mikroba, media biakan yang digunakan, serta factor lingkungan
antara lain pH dan suhu. Media fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasi dan
difermentasikan oleh mikroorganisme. Glukosa merupakan senyawa yang paling sering digunakan oleh
mikroorganisme dalam proses fermentasi itu. Selain itu terdapat pula media sukrosa dan
laktosa.Beberapa mikroorganisme seperti E. coli, dapat menggunakan laktosa sebagai sumber karbon.

Bakteri Escherichia coli memiliki bentuk batang dan tergolong dalam bakteri Gram negatif. Escherichia
coli tumbuh pada suhu optimum 370C dan pada kisaran suhu 100C 400C. Nilai pH optimum
pertumbuhannya 7,0 7,5. Bakteri ini memiliki ukuran panjang 2,0 6,0 mikron, sering terdapat dalam
bentuk tunggal atau berpasangan, bersifat motil atau non motil dengan flagella peritrikat, bersifat
anarobik fakultatif, dan tergolong dalam famili Enterobactericeae .

Escherichia coli merupakan pengkatalisa karbohidrat dengan formasi asam dan gas. Escherichia coli
termasuk mikroorganisme tidak menguntungkan pada keadaan normal. Escherichia coli disebut juga
koliform fekal karena ditemukan dalam saluran usus hewan dan manusia. Selain itu E. coli juga sering
dijadikan indikator kontaminasi kotoran.

Bacillus subtilis termasuk jenis Bacillus. Bacillus sp merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang,
dapat tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob. Bacillus secara alami terdapat dimana-mana, dan
termasuk spesies yang hidup bebas atau bersifat patogen. Beberapa spesies Bacillus menghasilkan enzim
ekstraseluler seperti protease, lipase, amilase, dan selulase yang bisa membantu pencernaan dalam
tubuh hewan (Wongsa dan Werukhamkul, 2007). Jenis Bacillus (B. cereus, B. clausii dan B. pumilus)
termasuk dalam lima produk probiotik komersil terdiri dari spora bakteri yang telah dikarakterisasi dan
berpotensi untuk kolonisasi, immunostimulasi, dan aktivitas antimikrobanya (Duc et al., 2004).
Bacillus subtilis mempunyai kemampuan untuk membentuk endospora yang protektif yang memberi
kemampuan bakteri tersebut mentolerir keadaan yang ekstrim. B. subtilis tidak dianggap sebagai
manusia pathogen walaupun dapat mencemari makanan tetapi jarang menyebabkan keracunan
makanan. B. subtilis menghasilkan enzim proteolytic yang subtilisin. Spora B. subtilis dapat hidup yang
ekstrim pemanasan yang sering digunakan untuk memasak makanan, dan bertanggung jawab untuk
menyebabkan kekentalan yang lengket. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu
mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel.

Pada prinsipnya pengamatan aktivitas biokimia atau metabolisme mikroorganisme yang diketahui dari
kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks dan
molekul-molekul sederhana. Selain itu, metabolisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang
dapat digunakan untuk identifikasi (Harmita, 2008).

Di dalam proses metabolisme ada zat-zat yang masuk dan ada pula zat-zat yang dibongkar dan kemudian
dikeluarkan sisanya. Zat yang disusun atau dihasilkan dalam pnguraian tersebut disebut metabolit.
Bakteri memiliki zat-zat tertentu, baik untuk mengambil zat-zat makanan maupun untuk
membongkarnya. Zat-zat itu secara umum disebut sekret; enzim-enzim terutama dari golongan hidrolase
merupakan sekret yang banyak dihasilkan bakteri.

http://dyahitp12.blogspot.co.id/2014/02/aktivitas-mikroba.html?m=1