MAKALAH KROMATOGRAFI

(Kromatografi Lapis Tipis)

“Validasi Metode Analisis α-Mangostin Dalam Plasma Darah Manusia Secara In Vitro
Dengan Kromatografi Lapis Tipis Densitometri”

Oleh:

Kelompok: B7

1. Muhammad Dimas Arzy (K1A021084)

2. Nisrina Huurul Ain (K1A021086)
3. Nur Ramdhani Kanata (K1A021088)
4. Pisqiantin Aenan Salsabila (K1A021090)
5. Weny Syafitri Utari (K1A021096)

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS MATARAM

SEMESTER GENAP TAHUN AKADEMIK 2023

 DAFTAR ISI

DAFTAR ISI .......................................................................................................................... 2

BAB I PENDAHULUAN ......................................................................................................... 3
1.1 Latar Belakang........................................................................................................ 3
1.2 Tujuan..................................................................................................................... 3
BAB II METODOLOGI........................................................................................................... 4
1.3 1.1 Alat & Bahan ..................................................................................................... 4
1.4 1.2 Prosedur ........................................................................................................... 4
1.5 1.2.1 Preparasi sampel ........................................................................................... 4
1.6 1.2.2 Prosedur Analisis ........................................................................................... 4
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................................... 7
1.7 2.1 Validasi Metode ................................................................................................ 7
1.8 2.1.1 Uji Kualitatif .................................................................................................... 7
1.9 2.1.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi α Mangostin (Linearitas) ..................................... 7
1.10 2.1.3 Penetapan Kadar ........................................................................................... 8
1.11 2.1.4 Penetapan Akurasi ......................................................................................... 9
1.12 2.1.5 Penentuan Presisi .......................................................................................... 9
1.13 2.1.6 Penentuan Batas Deteksi ............................................................................. 10
BAB V KESIMPULAN ......................................................................................................... 11
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................ 12

2
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kebutuhan terkait dengan obat-obatan terus meningkat setiap waktu baik dari segi
kualitatif maupun kuantitatif. Obat yang digunakan tidak hanya obat paten saja namun
masyarakat banyak memanfaatkan bahan-bahan alam untuk mengobati berbagai penyakit.obat
tradisional merupakan salah satu alternatif yang digunakan dalam pemenuhan kebutuhan obat
baru. Salah satu senyawa obat yang didapat dari obat tradisional yang kerap dimanfaatkan
masyarakat adalah α-mangostin yang merupakan senyawa turunan xanton (Yunitasari,2011).

Sebelum dilakukan uji praklinik dan uji farmakologi klinik dilaksanakan, harus
dilakukan satu metode analisis yang harus divalidasi terlebih dahulu. Validasi metode analisis
mencakup semua prosedur yang menunjukkan metode yang digunakan untuk pengukuran
kuantitatif analit yang berasal dari matriks biologis. Salah satu metode untuk analisis α-
mangostin yang banyak digunakan adalah KLT-densinometri.

1.2 Tujuan

Penelitian dalam jurnal ini dilakukan bertujuan untuk memvalidasi metode analisis
penetapan kadar α-mangostin dalam plasma darah manusia secara in vitro dengan metode
KLT-densitometri.

3
 BAB II
METODOLOGI

1.3 1.1 Alat & Bahan

- Alat
1. TLC Scanner 4 (Camag)
2. UV lamp 254nm (camag)
3. Bejana pengembangan (camag)
4. Pipet kapiler 2nl
5. Pipet volume
6. Labu ukur
7. Sentrifugator (Eba 20 Hettich)
8. Vortex (Ika)
9. Timbangan analitik (Precissa)
10. Tabung reaksi
11. Tabung sentrifuge dan rak
12. Pipet gondok
13. Erlenmeyer
14. Corong
15. Spatel
16. Gelas ukur
- Bahan
1. α-mangostein murni
2. Plat silika gel 60 F254
3. Plasma darah manusia golongan AB
4. Kloroform p.a (MErck)
5. Etil asetat p.a (Merck)
6. Metanol p.a (Merck)

1.4 1.2 Prosedur

1.5 1.2.1 Preparasi sampel

Pembuatan Larutan Induk α-Mangostin 1000 ppm.

Ditimbang seksama 50 mg αmangostin, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50

mL, dilarutkan dengan 5 mL metanol, dan cukupkan dengan metanol sampai tanda batas.
1.6 1.2.2 Prosedur Analisis
1. Analisis Kualitatif dengan KLT

Dipipet larutan induk α-mangostin 1000 ppm sebanyak 4 mL ke dalam labu ukur 10 mL
dan ditambah dengan plasma sampai tanda batas sehingga didapatkan larutan α-mangostin
dengan konsentrasi 400 ppm. Larutan tersebut dipipet sebanyak 3 mL ditambahkan metanol
sampai tanda batas dalam labu ukur 10 mL sehingga didapatkan larutan sampel αmangostin
4
konsentrasi 120 pp divortex selama satu menit, lalu disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm
selama 10 menit dan akan didapatkan bagian supernatan. Kemudian siapkan larutan campuran
pembanding αmangostin 1000 ppm dan larutan sampel α-mangostin 120 ppm (1:1). Larutan
pembanding α-mangostin 1000 ppm, larutan sampel α-mangostin 120 ppm dan larutan
campuran pembanding dan sampel, ditotolkan pada plat KLT ukuran 10 x 4 cm dengan volume
penotolan 2 µL dengan jarak penotolan masing-masingnya 1 cm. Dimasukkan plat KLT ke
dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak koroform : etil asetat (9:1)
(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2010), chamber ditutup dan dibiarkan sehingga
fase gerak bergerak sampai mencapai garis atas dari plat KLT. Plat KLT diambil Kemudian
diamati dengan lampu UV 254 nm dan ditentukan nilai Rf dan Rr dari bercak.

2. Pembuatan Kurva Kalibrasi α Mangostin

Dibuat seri larutan pembanding αmangostin dengan konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 150
ppm, 200 ppm, dan 250 ppm. Caranya dengan dipipet larutan induk α-mangostin 1000 ppm
masing-masingnya 0,5 mL, 1 mL, 1,5 mL, 2 mL, dan 2,5 mL, dan dimasukkan ke dalam labu
ukur 10 mL, encerkan dengan metanol dan dicukupkan sampai tanda batas. Kemudian
jenuhkan chamber dengan fase gerak kloroform : etil asetat (9:1). Setelah itu totolkan masing-
masing larutan diatas pada plat KLT ukuran 10 x 9 cm dengan volume penotolan 2 μL. Lalu
dielusi dalam chamber yang telah dijenuhkan. Tutup chamber dan biarkan fase gerak mencapai
garis atas pada plat. Chamber dibuka, plat KLT diambil dan dikeringanginkan. Kemudian amati
bercak dengan lampu UV 254 nm. Kemudian dilanjutkan dengan TLC scanner dengan panjang
gelombang maksimum α-mangostin yaitu 317 nm sehingga didapatkan luas area dari
masingmasing konsentrasi. Kurva kalibrasi dibuat dengan memplot antara luas area dengan
masing-masing konsentrasi larutan pembanding α-mangostin. Kemudian ditentukan
persamaan regresi linear dari kurva kalibrasi tersebut.

3. Linearitas
Linearitas ditentukan dengan cara mengolah data konsentrasi seri kadar (x) dan luas area
(y) dari kurva kalibrasi yang diperoleh menggunakan persamaan regresi linear sehingga
diperoleh nilai koefisien korelasi (r). Persamaan regresi ini dapat digunakan jika koefisien
korelasinya 0,99 ≤ r ≤ 1 (Harmita, 2004).
4. Penetapan kadar dan uji akurasi αmangostin dalam plasma in vitro
Dibuat larutan αmangostin dengan konsentrasi 400 ppm dengan cara larutan α-mangostin
dengan konsentrasi 1000 ppm dipipet sebanyak 4 mL ke dalam labu ukur 10 mL kemudian
dicukupkan dengan plasma sampai tanda batas. Larutan tersebut dipipet sebanyak 3 mL
ditambahkan metanol sampai tanda batas dalam labu ukur 10 mL sehingga didapatkan larutan
α-mangostin konsentrasi 120 ppm. Larutan tersebut divortex selama satu menit, lalu disentrifus
pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit.
Bagian supernatannya diambil lalu, ditotolkan pada plat KLT ukuran 10 x 9 cm dengan
volume penotolan 2 μL dengan jarak penotolan masing-masingnya 1 cm. Masukkan plat ke
dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak kloroform : etil asetat (9:1), tutup
chamber dan dibiarkan sehingga fase gerak bergerak sampai mencapai garis atas dari plat KLT.
Chamber dibuka, plat KLT diambil dan dikeringanginkan. Kemudian diamati dengan lampu

5
UV 254 nm. Kemudian bercak di scaning dengan alat Camag TLC Scanner 4 dengan panjang
gelombang maksimum α-mangostin yaitu 317 nm dan didapat data luas area dari senyawa uji.
Hitung konsentrasi senyawa dan persen perolehan kembali dengan menggunakan persamaan
regresi linear dari kurva kalibrasi.
5. Presisi
Larutan standar α-mangostin dengan berbagai konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 150 ppm
sebanyak tiga totolan dari masing-masing konsentrasi ditotolkan pada plat KLT pada hari yang
sama dengan waktu yang berbeda yaitu pagi, siang dan sore untuk variabel intraday, kemudian
tiga hari berturut-turut untuk variabel interday. Masing-masing konsentrasi ditotolkan
sebanyak tiga totola pada plat KLT ukuran 10 x 10 cm dengan volume penotolan 2 µL dan
jarak penotolan masing-masingnya 1 cm. Dimasukkan plat ke dalam chamber yang telah
dijenuhkan dengan fase gerak kloroform : etil asetat (9:1), tutup chamber dan dibiarkan fase
gerak bergerak sampai mencapai garis atas plat. Chamber dibuka, plat KLT diambil dan
dikeringanginkan. Kemudian diamati dengan lampu UV 254 nm. Kemudian bercak discanning
dengan alat Camag TLC Scanner 4 dengan panjang gelombang maksimum 317 nm dan didapat
data luas area dari senyawa uji. Dihitung konsentrasi dari larutan pembanding α-mangostin
dengan menggunakan persamaan regresi linear dari kurva kalibrasi. Presisi dinyatakan sebagai
Relatif Standar Deviasi (RSD) atau Koefisien Variasi (KV).
6. Penentuan Batas Deteksi (BD) dan Batas Kuantitasi (BK)
Batas deteksi (BD) dan batas kuantitasi (BK) dihitung berdasarkan persamaan regresi
linear. Nilai BD = 3 x (SD/b) dan BK = 10 x (SD/b).

6
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

1.7 2.1 Validasi Metode

1.8 2.1.1 Uji Kualitatif

Uji kualitatif α-mangostin bertujuan untuk melihat melihat senyawa α-mangostin dalam
sampel menggunakan metode KLT. Dari uji kualitatif yang telah dilakukan didapatkan hasil
nilai Rr = 1. Nilai Rr tersebut dinyatakan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh sampel
dengan jarak yang ditempuh pembanding kimia. Menurut Farmakope Indonesia edisi III,
identifikasi pendahuluan terhadap suatu sampel harus dilakukan dengan menggunakan zat
pembanding kimia. Berdasarkan hal tersebut dibuat 3 totolan pada satu plat KLT, yaitu zat
pembanding (P), sampel (S) dan campuran (C) dari zat pembanding kimia dengan sampel.

Berdasarkan kromatogram uji kualitatif α-mangostin yang diamati dengan lampu sinar
UV 254 nm diatas menunjukkan hasil dari nilai Rf yang sama antara ketiga totolan yaitu 0,533
dan kromatogram campuran memberikan bercak tunggal, yang berarti α-mangostin juga
terdapat dalam sampel yang telah disiapkan dengan nilai Rr yang diberikan sama dengan 1.
Dari hasil KLT yang telah dilakukan dengan nilai Rf dari α mangostin yaitu 0,53 hal tersebut
sesuai dengan teori yang ada pada Farmakope Herbal Indonesia 2010.

1.9 2.1.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi α Mangostin (Linearitas)

Tujuan dari Pembuatan Kurva Kalibrasi α Mangostin adalah untuk membuktikan
linearitas antara konsentrasi analit dengan luas area. Dari konsentrasi yang diukur yaitu 50,
100, 150, 200, 250 ppm didapatkan hasil luas area berturut-turut 1612,19; 2729,28; 3858,69;
4416,25; dan 5974,31. Dari data tersebut dapat ditentukan persamaan regresi linear dan

7
koefisien korelasi (r). Koefisien korelasi tersebut menunjukkan linearitas antara konsentrasi
analit dengan luas area seperti gambar berikut.

Persamaan regresi yang didapatkan dari hasil uji linearitas α-mangostin, Y = 20,82242x
+ 594,781 dengan koefisien korelasi (r) = 0,992206. Nilai 0,99 ≤ r ≤ 1. Hal tersebut
menunjukkan hubungan yang linear antara konsentrasi dan luas area sehingga semakin besar
konsentrasi analit maka akan semakin besar juga luas area.

1.10 2.1.3 Penetapan Kadar

Kadar α-mangostin secara in vitro dengan konsentrasi sampel 120 ppm dari 3 kali
penotolan berturut-turut adalah 116,1027 ppm, 118,5851 ppm dan 111,1249 ppm. Rata-rata
kadar α-mangostin dari 3 totolan tersebut adalah 115,2709 ppm dengan Standar Deviasi (SD)
3,7990 ppm. Adapun rata-rata % perolehan kembali adalah 96,0591%.

8
 Apabila dibandingkan dengan penelitian terdahulu, penelitian jurnal ini memperoleh
kadar α-mangostin yang lebih tinggi. Hal ini disebabkan pada penelitian ini α-mangostin murni
ditambahkan ke dalam plasma darah manusia dan ikatan protein yang terbentuk antara plasma
dan α-mangostin dilepaskan terlebih dahulu dengan cara divortex dengan kecepatan tinggi
sebelum diukur kadarnya. Sedangkan penelitian terdahulu hanya mengukur kadar α-mangostin
yang terkandung dalam kulit buah manggis dan kulit batang asam kandis.
1.11 2.1.4 Penetapan Akurasi
Menurut Harmita (2004), akurasi merupakan ukuran yang menunjukkan ketepatan hasil
yang diperoleh dari suatu metode analisis dengan kadar sebenarnya, serta sebagai parameter
untuk akurasi menggunakan persen perolehan kembali. Menurut penelitian Fauziah et.al.,
(2017), larutan sampel α-mangostin dengan konsentrasi 120 ppm dengan 3 kali penotolan
memberikan nilai akurasi berturut-turut 96,7522%, 98,8209%, dan 92,6041% dengan rata-rata
96,0591%. Hal ini membuktikan bahwa metode ini memberikan hasil yang akurat karena
memenuhi syarat dari akurasi karena memasuki pada rentang yang diperbolehkan yaitu 90-
107% (Harmita, 2004).

1.12 2.1.5 Penentuan Presisi

Presisi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil individu,
diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara
berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran homogen. Kriteria keseksamaan
diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi ≤ 2%, tetapi
kriteria ini sangat fleksibel karena tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah
sampel, dan kondisi laboratorium.
Penentuan presisi intraday α-mangostin dilakukan pada konsentrasi 50 ppm dengan
nilai % RSD berturut-turut 2,8125%, 1,2790%, dan 0,8404%; konsentrasi 100 ppm dengan
nilai % RSD berturut-turut 4,6809%, 0,7007%, dan 1,2164%; dan konsentrasi 150 ppm dengan
nilai % RSD berturut-turut 0,9038%, 1,7189%, dan 2,2941%. Penentuan presisi interday

9
dilakukan dengan menotolkan pembanding α-mangostin murni selama 3 hari berturut-turut
pada konsentrasi 50 ppm dengan nilai %RSD berturut-turut 0,8408%, 5,5968%, dan 2,1222%;
konsentrasi 100 ppm dengan nilai %RSD berturut-turut 1,2164%, 1,4933%, dan 1,5528%; dan
konsentrasi 150 ppm dengan nilai %RSD berturut-turut 2,2942%, 5,5319%, dan 1,4693%. Dari
nilai % RSD yang didapatkan pada penelitian ini diperoleh nilai %RSD yang kurang dari 1%
maka dapat dikatakan bahwa metode ini mempunyai nilai keterulangan yang baik
1.13 2.1.6 Penentuan Batas Deteksi
Tujuan ditentukan batas deteksi adalah untuk mengetahui konsentrasi analit terendah
yang dapat dianalisis. Sedangkan batas kuantitasi ditentukan agar mengetahui konsentrasi
terendah yang dapat ditentukan oleh suatu metode pada tingkat ketelitian dan ketepatan yang
baik. Nilai batas deteksi dan batas kuantitasi dapat ditentukan melalui persamaan regresi dan
standar deviasi. BD dan BK α-mangostin dalam penelitian ini adalah 37,8323 ppm dan
110,8014 ppm. Hasil penetapan kadar α-mangostin dalam plasma darah yang diperoleh akan
berhubungan dengan batas deteksi dan batas kuantitasi, dimana kadar α-mangostin yang
terukur harus berada diatas nilai batas deteksi dan batas kuantitasi. Dari hasil penetapan kadar
yang dilakukan, diperoleh kadar α-mangostin dalam plasma darah berada diatas BD dan BK.

10
 BAB V
KESIMPULAN

Metode KLT-densinometri dapat digunakan sebagai metode yang valit untuk analisis
α-mangostin dalam plasma darah secara in vitro. Hal ini dapat dilihat dari terpenuhinya
parameter validasi dengan rata-rata persen RSD yaitu 1,6440%, 2,1993% dan 1,6389%; presisi
interday yaitu 2,8533%, 1,4208%, 3,0985%, batas deteksi 37,832332ppm dan batas kuantitasi
110,8014ppm.

Kadar α-mangostin yang terdapat dalam darah manusia yang sebelumnya ditambahkan
larutan α-mangostin secara in vitro yaitu ±3,7990ppm dari kadar sampel 120ppm.

11
 DAFTAR PUSTAKA

Fauziah, F., Kardela, W., Rasyid, R., & Silvi, M. (2017). Validasi metode analisis α-
mangostin dalam plasma darah manusia secara in vitro dengan kromatografi lapis tipis-
densitometri. Jurnal Farmasi Higea, 9(2), 96-102.

Harmita. (2004). Metode penetapan kadar meloxicam dalam darah manusia in vitro
secara kromatografi cair kinerja tinggi. Majalah Ilmu Kefarmasian, I, (2), 79-92.

12