I.

A
II. X
III. ALAT DAN BAHAN
3.1. Alat
 Plat HPTLC silica gel 60F254 dengan ukuran 20 cm x 20 x cm, dan tebal
6-8 µm.
 Chamber
 Aplikator Camag Linomat V
 Camag TLC scanner III
 Syringe Camag 100 µL
 Komputer
 Labu ukur 25 mL
 Pipet ukur
 Bulb filler
3.2 Bahan
 Gemifloxacin mesylate (GFX) murni (99,8%)
 Montelukast (MK)
 Sampel plasma kosong
 Sampel plasma pasien Rumah Sakit Universitas Assiut
 Etil Asetat
 Ammonia 25%
 Methanol
 Akuades

IV. METODE
1.1 Pada penelitian ini menggunakan metode HPTLC (High
Performance Thin Layer Chromatography)/KLT-KT (Kromatografi
Lapis Tipis Kinerja Tinggi). KLT-KT memiliki prinsip yang hamper sama
dengan metode KLT konvensional. Namun, pemisahan dengan KLT-KT
memiliki beberapa klebihan dibandingkan dengan metode KLT
 konvensional antara lain fase diam yang digunakan sangat halus dan pori-
porinya seragam serta tebal lapisannya hanya 0,1 mm. Ukuran partikel fase
gerak yang lebih kecil ini menyebabkan semakin besarnya jumlah lempeng
teoritis, karena itulah pemisahan menjadi lebih efisien. Keunggulan lainnya
adalah sampel yang digunakan hanya sedikit sehingga bercak penotolannya
berdiameter antara 0,1-0,5 mm (Gandjar dan Rohman, 2007).
Fase diam yang digunakan pada KLT-KT hanya silika gel dan tidak
menggunakan fase diam lainnya sebagaimana dalam menggunakan KLT/
konvensional. Penyiapan sampel pada KLT-KT serta pemilihan fase
geraknya dapat dikatakan tidak ada perbedaan dengan KLT, hanya saja
konsentrasi sampel pada KLT-KT ini lebih kecil jika dibandingkan dengan
KLT konvensional. Pada KLT-KT, resolusi sudah tampak nyata pada jarak
pengembangan sampel 3-6 cm (Gandjar dan Rohman, 2007).

4.1 Penyiapan Larutan Standar

Larutan stok GFX dibuat dengan konsentrasi 1 mg/mL menggunakan pelarut
air. Kemudian dibuat larutan standar kerja (seri) dengan konsentrasi 6
µg/mL, 30 µg/mL, 60 µg/mL, 120 µg/mL, 240 µg/mL, 360 µg/mL dengan
mengencerkan larutan stok GFX 1 mg/mL. Selain kedua larutan tersebut,
juga disiapkan larutan standar internal yaitu montelukast (MK) yang dibuat
dengan cara 25 mg MK dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, lalu
ditambahkan 10 mL methanol dan air hingga volumenya menjadi 25 mL.
Selanjutnya, larutan standar internal diencerkan dengan air hingga diperoleh
konsentrasi 300 µg/mL.
4.2 Penyiapan sampel plasma
1 mL plasma manusia kosong dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 2
mL. Ditambahkan 250 µL larutan standar internal MK 300 µg/mL.
Kemudian dari masing-masing larutan seri (6 µg/mL – 360 µg/mL)
ditambahkan sebanyak 250 µL untuk memperoleh konsentrasi akhir yaitu 1
µg/mL - 60 µg/mL.
4.3 Studi stabilitas GFX
4.3.1 Kualiti control sampel
Studi stabilitas dari sampel GFX dalam plasma dapat dilakukan studi
stabilitas jangka pendek dan jangka panjang. Studi ini dilakukan untuk
sampel dengan konsentrasi terendah (1 µg/mL) dan konsentrasi tertinggi (60
µg/mL). Untuk studi stabilitas jangka pendek dapat dilakukan untuk dua
konsentrasi sampel yaitu 1 µg/mL dan 60 µg/mL yang didiamkan pada suhu
kamar selama 4 jam. Sedangkan untuk stabilitas jangka panjang dapat
dilakukan dengan cara sampel dengan konsentrasi 1 µg/mL dan 60 µg/mL
yang telah disimpan pada suhu -80 ◦C selama 7 minggu dibebukan selama
24 jam pada suhu -80 ◦C. Kemudian dilelehkan seluruhnya pada suhu
kamar. Uji stabilitas ini dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali. Hasil yang
diperoleh kemudian dibandingkan dengan larutan sampel yang baru dibuat
(baseline).
4.3.2 Larutan stok
Stabilitas larutan stok GFX ditentukan dengan cara mengencerkan larutan
stok GFX dengan konsenttrasi 1 µg/mL dan 60 µg/mL menggunakan air.
Disimpan pada suhu kamar selama 48 jam atau pada suhu -80 ◦C selama 7
minggu. Kemudian dianalisis pada baseline.
4.4 Aplikasi pada sampel plasma sebenarnya
Pada penelitian ini digunakan plasma dari lima pasien yang baru saja
dirawat di Rumah Sakit Universitas Assiut. Pasien diberikan tablet Factive®
yang setara dengan 320 mg gemifloxacin/tablet sebagai rejimen obat normal.
Setelah 1 jam pemberian, sampel darah dari pasien diambil dan ditempatkan
pada tabung stopper yang mengandung K2EDTA sebagai antikoagulan.
Kemudian disentrifugasi dan sampel plasma dipisahkan. Sampel disimpan
dalam kulkas dengan suhu -80◦C.
4.5 Pengkondision kromatografi
Fase gerak yang digunakan untuk elusi terdiri dari etil asetat: metanol:
amonia 25% dengan perbandingan 8:4,5:3 v/v/v yang disiapkan secara fresh.
Chamber dijenuhkan dengan fase gerak secara menaik linier. Ditotolkan
masing-masing larutan dalam bentuk pita berukuran 4 mm sebanyak 3
µg/mL dengan konstan. Plat HPTLC kemudian dielusi. Kemudian dipidai
dengan deteksi fluoresensi. Intensitas emisi diukur dengan menggunakan
filter optik K400 setelah eksitasi pada 342 nm.