PENENTUAN SPEKTROFOTOMETRI MIKROPARTIKEL DAN METODE VALIDASI

METODE GENTAMICIN LOADED MELALUI KOMPLEKS NINHYDRIN-

GENTAMICIN SEBAGAI PENDEKATAN KUANTIFIKASI CEPAT

ABSTRAK

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memberikan metode kuantifikasi dengan cepat, sensitif,
dapat direproduksi dan efektif biaya untuk gentamicin dalam bentuk kompleks ninhydrin-
gentamicin. Pemanfaatan modul spektrofotometri untuk memvalidasi pengembangan metode
untuk mikropartikel bermuatan gentamisin dimaksudkan untuk memberikan metode kuantifikasi
alternatif tanpa merusak sensitivitas metode yang dikembangkan. Proses fabrikasi mikropartikel
terbukti sesuai dalam enkapsulasi gentamisin dengan menggunakan poli (asam laktat co-glikolat)
PLGA tanpa mengurangi kemanjuran antibiotik itu sendiri. Linieritas dari 6 konsentrasi
kompleks ninhidrin-gentamisin yang diketahui diperoleh dengan R2 0,9998. Prasyarat interday
dan intraday ditentukan dengan penerimaan% nilai RSD kurang dari 2%. Nilai% RSD tertinggi
adalah 1,09% yang menyarankan metode ini tepat diterima. Nilai batas deteksi (LOD) dan batas
kuantifikasi (LOQ) masing-masing tercatat 0,016 dan 0,196 mg / mL. % Pemulihan 4
konsentrasi yang diketahui menunjukkan akurasi metode ini tinggi dengan kisaran pemulihan
antara 98,66% dan 101,8%. Parameter yang dianalisis dalam penelitian ini sesuai dengan
pedoman ICH Q2 (R1). Metode kuantifikasi ini merupakan pendekatan yang menjanjikan untuk
memberikan yang cepat dan efektif biaya dalam mengevaluasi konsentrasi gentamisin untuk
aplikasi in vitro.

PENGANTAR

Gentamicin adalah antibiotik milik keluarga aminoglikosida yang ditemukan pada tahun 1963
dan diisolasi dari Micromonospora purpurea. Ini mudah larut dalam air karena adanya gugus
hidroksil pada struktur kimianya, tetapi praktis tidak larut dalam pelarut organik (Šoltés, 1999).
Kisaran terapi sempit yang dimiliki oleh gentamicin telah membuat antibiotik menjadi salah satu
topik perdebatan hangat di antara para dokter, apakah itu tidak boleh digunakan sama sekali atau
hanya bahwa itu tidak boleh digunakan secara luas (Ariano et al., 2008). Ototoxicity dan
nephrotoxicity telah dilaporkan secara luas menjadi perhatian utama setiap kali aminoglikosida
diberikan kepada pasien (Šoltés, 1999; Ariano et al., 2008; Al-Hamad, 2014; Yusof et al., 2014).
Kekhawatiran ini telah menjadi faktor pendorong bagi banyak peneliti untuk mengembangkan
metode yang dapat meminimalkan ketersediaan hayati aminoglikosida secara sistemik tetapi
pada saat yang sama memaksimalkan efek terapeutik hanya jika diperlukan. Sistem pembawa
dengan karakteristik pelepasan berkelanjutan adalah opsi umum yang tersedia untuk mengatasi
masalah (Chung dan Huang, 2001; Balmayor et al., 2012; Abed dan Couvreur, 2014).
Ada cukup banyak literatur yang telah diterbitkan mengenai pelepasan gentamisin yang
berkelanjutan dengan menggunakan polimer yang dapat terbiodegradasi seperti poli (asam laktat-
ko-glikolat) atau yang umum dikenal sebagai PLGA (Friess dan Schlapp, 2002; Schlapp dan
Friess, 2003; Ismail) et al., 2012). Metode kuantifikasi dikembangkan dan divalidasi berdasarkan
persyaratan yang tercantum oleh Konferensi Internasional tentang Harmonisasi Persyaratan
Teknis untuk Pendaftaran Obat-obatan untuk Penggunaan Manusia (ICH). Meskipun gentamicin
telah banyak digunakan sebagai subjek untuk formulasi rilis berkelanjutan, tinjauan literatur
telah menunjukkan bahwa tidak ada kesepakatan umum tentang pengembangan validasi metode
analitik (AMV) untuk gentamicin dengan menggunakan spektrofotometer UV. Ini cepat dan
hemat biaya dengan sensitivitas sedang secara signifikan dalam mendeteksi gentamisin
menggunakan spektrofotometri UV dibandingkan dengan metode analitik menggunakan HPLC
atau GC-MS.

Ketika datang ke hubungan antara transmitansi dan absorbansi solusi dalam penerapan deteksi
spektrofotometri UV, Hukum Beer-Lambert adalah salah satu prinsip dasar dalam memahami
konsep. Secara singkat, kekuatan satu berkas cahaya melewati sel tembus cahaya atau kuvet
yang memegang larutan penyerap akan memiliki proporsi terbalik antara intensitas berkas yang
terdeteksi dan konsentrasi larutan (Behera et al., 2012; Ismail et al., 2015). Dilaporkan di tempat
lain bahwa konsentrasi gentamisin ditentukan dengan menggunakan uji fluorescent pada panjang
gelombang 450 nm, dengan nilai R2 untuk linearitas yang dibangun pada panjang gelombang ini
kurang dari 0,98 (Lecároz et al., 2006). Selain itu, literatur yang sama juga melaporkan bahwa
korelasi linearitas yang dibangun menggunakan HPLC untuk gentamisin yang diekstraksi dari
mikropartikel menggunakan diklorometana dan natrium hidroksida memberikan nilai masing-
masing 0,889 dan 0,855.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode untuk mengukur keberadaan
gentamisin dalam bentuk kompleks gentamicin-ninhydrin dengan menggunakan spektrometer
UV. Metode ini akan dikembangkan dan divalidasi berdasarkan persyaratan yang tercantum
dalam pedoman ICH Q2 (R1). Selain itu, penelitian ini dilakukan untuk membuktikan stabilitas
dan kemanjuran gentamisin untuk proses post fabrikasi dengan mengevaluasi respon antibiotik
terhadap staphylococcus aureus.

Dipercayai bahwa metode analitik yang dikembangkan dan divalidasi dalam penelitian ini akan
memberikan kuantifikasi in vitro yang cepat dan efektif biaya untuk gentamicin.

BAHAN

Bahan Kimia dan Reagen

Gentamisin sulfat dibeli dari apotek lokal. Purasorb® PLGA dengan tiga viskositas intrinsik
yang berbeda; 0,2 dL / g (14 kDa), 0,4 dL / g (34 kDa) dan 1,0 dL / g (100 kDa) dibeli dari Purac
(Belanda). Ninhydrin dengan grade reagen laboratorium dibeli dari Fisher Scientific (Inggris
Raya). Poly Vinyl Alcohol (PVA) dengan berat molekul sekitar 115 kDa (BDH Laboratory
Supplies, Inggris) digunakan. Semua pelarut dibeli dari Merck (Jerman) dengan tingkat analitis.
Staphylococcus aureus (ATCC 29523) dibeli dari Microbiologics® (USA).

Instrumentasi

Analisis dilakukan menggunakan modul spektrofotometri sinar UV tunggal (U 1900 Toshiba,

Jepang) dengan panjang gelombang yang dipindai dari 600 nm hingga 190 nm. Cuvette sel
kuarsa silika kuadrat (Optima, Jepang) dengan transmitansi 51,4 ± 0,3% pada panjang
gelombang 545 nm digunakan sepanjang seluruh percobaan.

METODE EKSPERIMENTAL

Pereaksi kolorimetri

Akurat 50 mg bubuk ninhidrin ditimbang dan dilarutkan dengan 10 mL larutan buffered saline
(PBS) fosfat (pH 7,4) untuk mendapatkan larutan stok dengan konsentrasi 5 mg / mL. Solusi stok
disimpan di bawah 4 oC dan dilindungi dari sumber cahaya apa pun.

Pembuatan Mikropartikel Gentamicin

Metode penguapan pelarut emulsi ganda yang dimodifikasi diadopsi dari Ismail et al. (2012).
Secara singkat, PLGA dilarutkan dalam 2 mL kloroform sebelum dicampur dengan 200 μL
larutan air yang mengandung 100 mg gentamisin untuk dianggap sebagai emulsi primer. Emulsi
sekunder diperoleh dengan mencampur antara emulsi primer 8 mL larutan 1% b / v PVA,
sebelum dipindahkan ke tangki pengerasan (100 mL larutan 1% b / v PVA) untuk proses
penguapan pelarut yang memakan waktu 3 jam. Proses pencampuran untuk emulsi primer dan
sekunder dilakukan dengan menggunakan ultra sonicator (QSonica, USA; 3 siklus selama 3 detik
masing-masing pada 50 MHz). Mikropartikel dikumpulkan dengan cara sentrifugasi (4000 rpm,
5 menit) dan diikuti dengan pencucian untuk menghilangkan PVA sebelum mereka diliofilisasi
dengan tekanan rendah.

Tabel 1: Sembilan formulasi mikropartikel berdasarkan rasio dan campuran PLGA yang
digunakan. Jumlah gentamisin yang dimuat untuk setiap formulasi adalah masing-masing 100
mg.
Mikropartikel bermuatan gentamisin dievaluasi berdasarkan distribusi ukuran partikel dan
jumlah jebakan obat. Untuk penelitian ini, sembilan formulasi berbeda dipilih berdasarkan
kombinasi bobot molekul PLGA dan rasio yang digunakan antara campuran berat molekul
tersebut (Tabel 1).

Distribusi ukuran partikel

Distribusi ukuran partikel dievaluasi dengan menggunakan Laser Particle Size Analyzer
(Bettersize Instruments, China) dan dilakukan dalam rangkap tiga. Partikel-partikel tersuspensi
dalam air deionisasi sebelum dikenai pengukuran.

Efisiensi Enkapsulasi

Secara singkat, 5-8 mg mikropartikel bermuatan gentamisin ditempatkan dalam tabung dan
dilarutkan menggunakan 1 mL kloroform diikuti dengan penambahan 1 mL larutan PBS lainnya
(pH 7,4).

Metode ini diadopsi dari Ismail et al. (2012) dan dimodifikasi sesuai. Tabung diputar dari ujung
ke ujung selama 1 jam sebelum 800 μL bagian berair diekstraksi dan dipindahkan ke tabung lain
setelah proses sentrifugasi (4000 rpm, 5 menit). Jumlah yang sama dari reagen kolorimetri
ditambahkan ke larutan sebelum dikenakan perlakuan panas menggunakan penangas air (95 oC,
15 menit) dan diikuti dengan perlakuan dingin menggunakan penangas air dingin selama 10
menit. Solusi akhir ini menjadi sasaran evaluasi spektrofotometri UV dengan panjang gelombang
418 nm. Kuantifikasi untuk setiap formulasi dilakukan dalam rangkap tiga dan nilai rata-rata
dicatat.

Khasiat Gentamicin untuk Fabrikasi Pasca Mikropartikel

Singkatnya, 10 mg mikropartikel bermuatan gentamisin dilarutkan dalam 1 mL kloroform dan

ditambahkan 1 mL larutan PBS. Rotasi ujung ke ujung dilakukan selama 1 jam untuk
memastikan semua partikel mikro dilarutkan sebelum bagian berair diekstraksi. 100 μL dari
larutan yang diekstraksi dijatuhkan pada disk kertas kosong dan diuji terhadap staphylococcus
aureus. Metode difusi disk diadopsi dan dimodifikasi dari Ismail et al. (2012) digunakan dengan
menyiapkan rumput S. aureus dengan menggunakan nutrien agar. Kepadatan optik kaldu bakteri
diukur menggunakan spektrometer UV (Hitachi U1900 Single Beam, Tokyo Jepang) yang sesuai
dengan standar 0,5 McFarland. Konsentrasi 108 unit pembentuk koloni (CFU) / mL (0,5
McFarland Standard) dicapai dengan mengukur kepadatan optik yang berada di antara nilai
absorbansi 0,008-0,1 (Andrews, 2001).

S. aureus dikultur dengan menggunakan kaldu nutrisi dan agar nutrien digunakan sebagai media
untuk halaman rumput bakteri. Zona penghambatan untuk setiap formulasi mikropartikel diukur
dengan menggunakan Absolute Digimatic Caliper Mitutoyo (Jepang) dengan sensitivitas hingga
0,01 mm.

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE

Persiapan stok Larutan Gentamicin

Secara akurat 1 g bubuk gentamiin ditimbang dan dilarutkan dengan 10 mL larutan PBS (pH 7,4)
dan disimpan pada suhu 4 oC. Larutan stok ini dengan konsentrasi akhir 100 mg / ml (10% b / v)
diencerkan sesuai bila diperlukan. PVA 1% b / v dibuat dengan melarutkan bubuk PVA dengan
menggunakan air ultra murni.

Kekhususan

Kompleks Gentamicin-ninhydrin dalam PBS akan memberikan warna ungu dengan solusi non
keruh yang jelas. Gentamicin saja dalam larutan air tidak akan memberikan warna pada
konsentrasi yang relatif rendah dan tidak dapat dideteksi dengan spektrofotometer UV. Awalnya,
pemindaian panjang gelombang dilakukan untuk mendapatkan puncak terbaik untuk kompleks
gentamicin-ninhydrin tanpa kemungkinan interferensi dengan komponen lain yang mungkin ada
dalam larutan. Solusi PBS digunakan sebagai solusi kosong dan dianggap sebagai bacaan latar
belakang. Proses pemindaian yang sama dilakukan untuk PLGA dan ninhydrin saja untuk
menghilangkan false positive dalam memilih puncak terbaik untuk kompleks gentamicin-
ninhydrin. Panjang gelombang yang ditentukan akan digunakan sepanjang penelitian kapan pun
dibutuhkan.

Linearitas dan Kurva Standar

Linieritas dari enam konsentrasi kompleks gentamisin-ninhidrin yang diketahui berbeda menjadi
sasaran panjang gelombang yang telah ditentukan sebelumnya. Absorbansi konsentrasi yang
dihormati dicatat. Grafik konsentrasi vs absorbansi diplot di mana persamaan 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑐 dan R2
dibuat. Konsentrasi analit ditentukan dengan notasi 𝑥 dengan 𝑦 adalah nilai absorbansi. Nilai
koefisien korelasi R2 untuk semua kurva standar yang dibangun untuk penelitian ini ditetapkan
menjadi tidak kurang dari 0,995 sebagai salah satu kriteria penerimaan (Rajesh et al., 2014;
Ismail et al., 2015)

Akurasi dan Presisi

Untuk akurasi, empat konsentrasi berbeda yang diketahui kompleks gentamicin-ninhydrin
menjadi sasaran panjang gelombang yang ditetapkan (418 nm) dan konsentrasi eksperimental
dicatat. Setiap konsentrasi menjadi sasaran panjang gelombang dalam rangkap tiga dan mean dan
standar deviasi dicatat. Presisi dievaluasi dengan mempertimbangkan persentase penyimpangan
nilai absorbansi yang diperoleh dari konsentrasi aktual. Presisi antar hari dilakukan dengan
melakukan pengukuran dalam 3 hari berbeda untuk 3 persiapan berbeda. Presisi intraday di sisi
lain dilakukan dengan menundukkan empat konsentrasi sampel yang diketahui dengan panjang
gelombang yang sama (418 nm) tetapi dalam 3 titik waktu spesifik yang berbeda pada hari yang
sama. Persentase pemulihan tidak boleh kurang dari 98% dan lebih dari 102% dengan% nilai
RSD lebih kecil dari 2,0% untuk memenuhi kriteria penerimaan (Rajitha et al., 2011; Ismail et
al., 2015).

Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantification (LOQ)

Evaluasi untuk LOD dan LOQ dilakukan dengan menundukkan solusi kosong (larutan PBS
dengan pH 7,4) dengan panjang gelombang yang sama yang digunakan untuk mengukur sampel.
Ada perhitungan khusus untuk menentukan LOD dan LOQ seperti yang dijelaskan di bawah ini;

S.D atau standar deviasi dalam rumus mengacu pada standar deviasi nilai absorbansi dari blanko
dan 𝑚 adalah kemiringan kurva standar yang dibangun sebelumnya (Iqbal et al., 2013). Semua
pembacaan untuk LOD dan LOQ diambil 3 kali.

Kekokohan

Kekokohan metode ditentukan dengan secara sengaja memperkenalkan perubahan kecil dalam
prosedur atau persiapan sampel. Penyimpangan data yang dikumpulkan untuk ketahanan
dibandingkan dengan data asli dan setiap perubahan signifikan dicatat. Panjang gelombang
sengaja diubah menjadi 421 nm, 415 nm dan 400 nm dan kurva standar untuk setiap panjang
gelombang dibangun dengan koefisien korelasi nilai R2 dicatat. Selain itu, analis kedua
ditugaskan untuk membangun kurva standar untuk mendapatkan nilai R2 dan persamaan linear
berdasarkan nilai absorbansi dari enam konsentrasi kompleks gentamicin-ninhydrin yang
diketahui berbeda. Metode ini dianggap kuat jika nilai R2 yang diperoleh tidak kurang dari
0,995.
HASIL DAN DISKUSI

Distribusi Ukuran Partikel dan Efisiensi Enkapsulasi

Distribusi ukuran untuk semua formulasi menunjukkan bahwa ukuran partikel jatuh dalam
kisaran antara 1,624 μm ± 0,194 hingga 5,103 μm ± 1,537 (Tabel 2). Relatif, distribusi ukuran
mikropartikel untuk semua formulasi dapat dianggap terdispersi secara homogen. Homogenisitas
ini ditentukan berdasarkan nilai rentang untuk setiap formulasi. Nilai rentang dihitung
berdasarkan distribusi ukuran partikel pada 3 distribusi berbeda (10%, 50% dan 90%) dengan
formulasi seperti yang dijelaskan sebagai berikut:

Dimana oleh D90, D10 dan D50 adalah distribusi partikel masing-masing pada 90%, 10% dan
50%. Nilai rentang yang lebih rendah dari 1 menunjukkan bahwa distribusi ukuran dapat
dianggap terdispersi secara homogen. Meskipun ukuran partikel terdistribusi secara homogen,
distribusi ukuran bukanlah prioritas utama dalam penelitian ini karena mikropartikel
dimaksudkan untuk digunakan secara lokal di lokasi infeksi tanpa harus melalui rute parenteral
apa pun. Hasil efisiensi enkapsulasi (EE) menunjukkan bahwa berat molekul dan campuran
PLGA mempengaruhi jumlah gentamisin yang dienkapsulasi menggunakan metode fabrikasi ini.
Metode penguapan pelarut emulsi ganda dimaksudkan untuk merangkum obat-obatan yang
bersifat hidrofilik seperti gentamisin (Ismail et al., 2012). Gambar 1 menunjukkan bahwa
meskipun gentamisin dapat dienkapsulasi dalam mikropartikel, jumlah tertinggi dari gentamisin
yang dienkapsulasi adalah 42,98% ± 2,60 untuk F8. Namun EE terendah (11,64% ± 2.66)
diwakili oleh formulasi (F1) yang digunakan 0,2 dL / g dan 0,4 dL / g PLGA dengan rasio 50:50.
Di antara penjelasan yang masuk akal untuk temuan ini adalah bahwa berat molekul PLGA
memainkan peran penting dalam menentukan jumlah gentamisin yang dienkapsulasi dalam
mikropartikel. Jelas bahwa berat molekul yang lebih tinggi (viskositas intrinsik yang lebih
tinggi) dengan rasio yang lebih tinggi akan menjebak lebih gentamisin dibandingkan dengan
berat molekul PLGA yang lebih rendah.

Meskipun kontradiksi diamati, penemuan ini direkam dengan sistem fabrikasi menggunakan
emulsi polimer tunggal dan gaya geser mekanis. Namun penelitian saat ini telah memanfaatkan
gelombang ultrasonik sebagai rata-rata untuk menghomogenisasi emulsi di samping penggunaan
campuran berat molekul polimer yang digunakan. Emulsi lebih stabil bila polimer yang
digunakan memiliki berat molekul tinggi. Emulsi yang lebih tebal akan dibentuk dengan polimer
dengan berat molekul tinggi dibandingkan dengan polimer dengan berat molekul rendah. Oleh
karena itu, tetesan yang terbentuk lebih stabil dengan tingkat koalesensi yang lebih sedikit antara
tetesan.
Gambar 1: Efisiensi enkapsulasi mikropartikel bermuatan gentamisin berdasarkan pada
formulasi yang digunakan.

Tabel 2: Distribusi ukuran mikropartikel gentamisin yang dimuat sesuai dengan formulasi

Khasiat Gentamicin untuk Fabrikasi Pasca Mikropartikel

Proses pembuatan untuk merangkum gentamisin terbukti sesuai dan kompatibel tanpa mengubah
kemanjuran obat itu sendiri. Kemanjuran untuk proses pabrikasi dievaluasi dengan
mengekstraksi gentamisin yang dienkapsulasi dan tunduk pada halaman bakteri. Gambar 2
menunjukkan aksi antimikroba gentamisin terhadap S. aureus. Ditemukan bahwa kemanjuran
gentamisin masih utuh berdasarkan pada pembentukan zona inhibisi. Meskipun diameter zona
hambatan dapat diukur sesuai dengan formulasi yang digunakan, itu tidak cocok secara ilmiah
untuk mewakili data yang sesuai dengan jumlah pemuatan obat kecuali semua variabel dikontrol
secara ketat. Menariknya berdasarkan hasil yang diperoleh, terbukti bahwa gentamisin
enkapsulasi masih bisa efektif melawan S. aureus. Diameter zona hambatan menurut formulasi
ditabulasi di bawah Tabel 3. Gentamicin memiliki kemampuan untuk mengikat urutan rRNA
bakteri yang terkonservasi yang sangat dekat dengan lokasi pengenalan kodon-antikodon dari
subunit 30S (Yoshizawa et al., 1998).
Pengikatan ini akan mengurangi keakuratan bakteri dalam menerjemahkan bahan genetik dan
menghambat translokasi ribosom yang mengganggu sintesis bahan protein. Inhibitor polikationik
dari subunit ribosom 30S ini akan menyebabkan bakterisida terhadap S. aureus dengan
mengganggu transportasi membran sel dan permeabilitas dinding sel (McLawhon, 2012).

Tabel 3: Diameter rata-rata zona hambatan menurut formulasi.

Gambar 2: Zona penghambatan untuk beberapa formulasi (F2, F6 dan F7) gentamisin terhadap
Staphylococcus aureus.

Kekhususan

Dalam penelitian ini, mikropartikel bermuatan gentamisin dibuat menggunakan PLGA dan
jumlah pemuatan obat untuk postingan. fabrikasi dikarakterisasi dengan menggunakan
spektrofotometer UV. Karena gentamisin kurang diserap oleh cahaya tampak dan sinar UV,
metode spektrofotometri tidak langsung perlu dikembangkan.

Ninhydrin digunakan untuk menghasilkan prosedur kolorimetri untuk mengukur gentamisin

yang dienkapsulasi. Reaksi prinsip antara ninhidrin dan gentamisin didasarkan pada interaksi
kimia ninhidrin dengan gugus amina primer dan sekunder yang terdapat dalam struktur kimia
gentamisin yang menghasilkan warna ungu (Frutos et al., 2000). Metode spektrofotometri
dengan cepat, sensitif dan hemat biaya untuk analisis komponen tunggal dalam larutan dapat
dicapai untuk obat apa pun yang mematuhi Hukum Beer-Lambert.

Berdasarkan pemindaian panjang gelombang yang dilakukan untuk kompleks gentamicin-

ninhydrin, panjang gelombang 418 nm dipilih karena penampilan kolorimetri dari larutan
(berwarna ungu) yang mengindikasikan deteksi tidak boleh di bawah wilayah UV (di bawah 400
nm). Selain itu, spektrum pemindaian dari 600 nm hingga 200 nm memverifikasi bahwa pada
wilayah 418 nm, deteksi tidak akan terganggu dengan panjang gelombang PLGA dan ninhidrin
saja (Gambar 3).

Meskipun panjang gelombang 418 nm ditentukan oleh modul UV, kompleks gentamicin
ninhydrin juga mengalami 400 nm untuk mengevaluasi tingkat penyimpangan dengan
membangun linieritas dan memperoleh koefisien korelasi nilai R2. Berdasarkan nilai R2 yang
diperoleh dari linearitas yang dibangun pada 400 nm, itu di bawah persyaratan penerimaan
(0,9772) yang tidak kurang dari 0,995. Nilai koefisien korelasi yang tidak diinginkan ini
menjadikan panjang gelombang pada 418 nm sebagai pilihan terbaik untuk spesifisitas dalam
mendeteksi kompleks gentamicin-ninhydrin.

Linearitas dan Kurva Standar

Linieritas ditentukan berdasarkan pada hubungan proporsional langsung yang konstan antara
konsentrasi gentamisin ninhidrin kompleks dan nilai absorbansi secara khusus pada panjang
gelombang 418 nm.

Enam konsentrasi gentamisin-ninhidrin kompleks diketahui disiapkan (2,0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0 dan
10.0 mg / mL) dan dikenakan 418 nm untuk mendapatkan nilai absorbansi. Kurva standar yang
diperoleh dari spektrofotometri UV berdasarkan pada 6 konsentrasi ini adalah dalam bentuk
linier dengan persamaan dan R2 masing-masing 𝑦 = 0,069𝑥 + 0,007 dan 0,9998. Kurva standar
diilustrasikan pada Gambar 4.

Pembacaan untuk setiap konsentrasi dilakukan dalam rangkap tiga dan rata-rata dari ketiga
dihitung untuk memaksimalkan keandalan data. Inkonsistensi bacaan dari modul UV dapat
diabaikan karena pelarut latar belakang yang digunakan dalam penelitian ini adalah solusi PBS.
Disebutkan oleh Ismail dan rekan kerja bahwa pelarut organik yang mudah menguap seperti
diklorometana yang digunakan sebagai larutan latar belakang akan berkontribusi pada
inkonsistensi pembacaan yang diperoleh karena penguapan cepat pelarut itu sendiri (Ismail et al.,
2015).
Gambar. 3: Spektrum pemindaian panjang gelombang PLGA, reagen ninhydrin (NH), dan
gentamisin ninhydrin kompleks untuk spesifisitas.

Gambar. 4: Kurva standar dibangun untuk studi linearitas.

Akurasi dan Presisi

Presisi menengah dilakukan dengan menggunakan 4 konsentrasi kompleks gentamicin-ninhydrin

yang diketahui (2,0, 4,0, 6,0 dan 8,0 mg / mL) dan diukur dalam 3 hari berturut-turut. Ke 4
konsentrasi yang diketahui disiapkan baru setiap hari dan untuk setiap konsentrasi, pembacaan
dilakukan dalam rangkap tiga. Berdasarkan data untuk presisi menengah (Tabel 4), metode
kuantifikasi dianggap tepat dalam mendeteksi kompleks gentamisin-ninhidrin pada konsentrasi
yang berbeda karena% RSD yang diperoleh kurang dari 2,0%. Temuan serupa ini diamati dan
dilaporkan oleh beberapa orang lain dengan kriteria penerimaan yang sama dipantau (Behera et
al., 2012; Ismail et al., 2015).

Untuk studi pengulangan (presisi intraday), hasil yang sama diamati di mana 3 pembacaan
selanjutnya diambil pada hari yang sama. Semua 4 konsentrasi yang diketahui (2,0, 4,0, 6,0 dan
8,0 mg / mL) disiapkan baru setiap kali. Data pengulangan ditabulasikan dalam Tabel 5 dengan%
RSD untuk semua konsentrasi menunjukkan nilai kurang dari 2,0%. Metode kuantifikasi ini
adalah. dianggap tepat dan memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh pedoman ICH Q2 (R1).
Studi keakuratan untuk metode ini dimodifikasi karena intensitas warna ungu yang tinggi jika
konsentrasi gentamisin ninhydrin complex dinaikkan hingga 100% b / v dan lebih banyak lagi.

Pembacaan absorbansi akan melompati 2.0 ketika transparansi solusi turun secara drastis.
Deteksi modul untuk sampel yang terlalu terkonsentrasi akan turun di bawah 0,1% untuk
transmitansi.
Transmisi rendah yang dihasilkan dari sampel yang terlalu terkonsentrasi akan memberikan
kesalahan standar yang sangat tinggi dalam pembacaan. Konsekuensinya, konsentrasi yang sama
digunakan (2.0, 4.0, 6.0 dan 8.0 mg / mL) dalam menentukan keakuratan metode tanpa
mengurangi persyaratan penerimaan data yang dikumpulkan.

Hampir masalah yang sama dijelaskan dalam penelitian lain yang dilakukan di tempat lain
dengan metode kuantifikasi dikembangkan untuk minyak Nigella sativa menggunakan
spektrofotometri UV (Ismail et al., 2015). Tabel 6 menunjukkan data akurasi yang dikumpulkan
dengan masing-masing konsentrasi dilakukan dalam rangkap tiga. Pemulihan rata-rata berada di
antara rentang penerimaan (98% hingga 102%) dengan% RSD kurang dari 2,0%.

Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantification (LOQ)

LOD dan LOQ dihitung berdasarkan formulasi yang disebutkan dalam metode eksperimental.
Dengan mempertimbangkan kondisi eksperimental kontrol untuk penelitian ini, nilai LOD dan
LOQ adalah 0,016 mg / mL ± 0,0003 mg / mL dan 0,196 mg / mL ± 0,001 mg / mL masing-
masing dengan kemiringan kurva standar adalah 0,07. Koefisien korelasi R2 untuk kurva standar
adalah 0,9998.

Tabel 4: Presisi antara diperoleh dengan menggunakan spektrofotometer UV untuk kompleks

gentamicin-ninhydrin.

Tabel 5: Studi pengulangan (presisi intraday) dengan menggunakan spektrofotometri UV.

Tabel 6: Keakuratan metode dievaluasi berdasarkan rata-rata pemulihan dan nilai% RSD dari
setiap konsentrasi.

Tabel 7: Koefisien korelasi nilai R2 dan persamaan linear.

Kekokohan

Panjang gelombang yang ditentukan oleh modul UV dimodifikasi dengan penyesuaian kecil dan
konsentrasi yang sama yang digunakan dalam membangun linieritas dikenakan pada panjang
gelombang baru. Untuk ketahanan, panjang gelombang aktual disesuaikan ke 421 nm dan 415
nm sebelum linearitas untuk kedua panjang gelombang ditentukan. Dari data pada Tabel 7, jelas
bahwa perubahan kecil yang dilakukan dengan sengaja terhadap metode yang dikembangkan
tidak mempengaruhi keandalan dalam mengukur konsentrasi gentamisin dalam larutan yang
diberikan. Meskipun perubahan dilakukan dengan nilai +3 nm dan -3 nm dari panjang
gelombang aktual, nilai R2 yang diperoleh untuk kedua panjang gelombang yang disesuaikan
tidak kurang dari 0,995. Pengamatan serupa diperoleh dengan konstruksi kurva standar oleh
analis kedua. Nilai R2 adalah 0,9996 dan masih di atas batas penerimaan. Oleh karena itu, ini
membuktikan bahwa metode yang dikembangkan untuk mengukur kompleks gentamicin-
ninhydrin cukup kuat untuk tahan terhadap perubahan kecil yang disengaja.

KESIMPULAN

Metode kuantifikasi untuk gentamisin dalam bentuk kompleks gentamicin-ninhydrin

dikembangkan dan divalidasi dengan menggunakan spektrofotometri UV-. Persyaratan dasar
untuk kriteria penerimaan yang digarisbawahi oleh pedoman ICH Q2 (R1) jika dipenuhi dan
dipenuhi. Eksplorasi hubungan antara konsentrasi gentamisin dan nilai absorbansi UV untuk
mengembangkan metode analitik untuk kuantifikasi cepat in vitro berhasil. Oleh karena itu,
secara ringkas, penelitian saat ini menyarankan bahwa metode analitik ini cepat, tepat, spesifik,
akurat, kuat dan hemat biaya untuk digunakan dalam menghitung gentamisin untuk penilaian in
vitro. Selain itu, proses fabrikasi mikropartikel terbukti cocok untuk merangkum gentamisin
dengan menggunakan PLGA tanpa mengurangi kemanjuran antibiotik itu sendiri.