MATERI XII.

BIOAUTOGRAFI

TUJUAN PRAKTIKUM

Mahasiswa dapat melakukan uji potensi antimikroba melalui KLT -Bioautografi

TEORI

KLT-Bioautografi
KLT-Bioautografi adalah metode pendeteksian untuk menetukan senyawa antimikroba yang
belum teridentifikasi dengan melokalisir aktivitas antimikroba pada efek biologi (antibakteri,
antiprotozoa, antitumor) dan substansi yang diteliti.
Uji Bioautografi merupakan metode spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil
KLT (Kromatografi Lapis Tipis) yang memiliki aktivitas antibakteri, antifungi, dan anti
virus sehingga mendekatkan metode separasi dengan uji biologis.
Ciri khas dari prosedur KLT-Bioautografi adalah didasarkan atas tehnik difusi agar, dimana
senyawa antimikrobanya dipisahkan dari lapisan KLT-ke medium agar yang telah diinokulasikan
bakteri dengan merata. Dari hasil inkubasi pada suhu dan waktu tertentu akan terlihat zona
hambatan ditampakkan oleh aktivitas senyawa aktif terdapat dalam bahan yang diperiksa
terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji.

Bioautografi dibagi dalam tiga kelompok yaitu:

a. KLT-Bioautografi langsung
Dimana mikroorganisme tumbuh secara langsung di atas lempeng kromatografi lapis tipis.
b. KLT-Bioautografi kontak
Dimana senyawa antimikroba dipindahkan dari lempeng KLT ke medium agar yang telah
diinokulasi melalui kontak langsung.
c. KLT-Bioautografi pencelup (agar overlay)
Dimana medium agar yang telah diinokulasikan dengan suspense bakteri dituang diatas lempeng
kromatografi yang telah dielusi diletakkan dalam cawan petri sehingga permukaan ditutupi oleh
medium agar yang berfungsi sebagai based layer.
Setelah medium agar memadat dengan mikroorganisme yang berfungsi sebagai seed layer dan
diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai.
Keuntungan metode ini adalah sifatnya yang efisien untuk mendeteksi adanya senyawa
antimikroba karena letak bercak dapat ditentukan walaupun berada dalam campuran yang
kompleks sehingga memungkinkan untuk mengisolasi senyawa aktif tersebut, kerugiannya
metode ini tidak dapat menentukan KHM dan KBM.

ALAT DAN BAHAN

A. Alat yang digunakan
1. autoklaf
2. bunsen,
3. bejana maserasi,
4. cawan petri,
5. chamber (camag),
6. gelas ukur,
7. incubator (Memmert),
8. Erlenmeyer
9. dryer,
10. jarum ose,
11. Laminar Air Flow (LAF),
12. lampu UV 254 nm dan 366nm,
13. oven (Memmert),
14. pinset,
15. spektrofotometer UV (Genesis),
16. spuit,
17. tabung reaksi,
18. timbangan analitik,
19. pipa kapiler
20. vial.

B. Bahan
 1. Air suling steril,
2. ekstrak etanol daun pala (Myristica fragrans Houtt.),
3. dimetil sulfoksida (DMSO),
4. etanol 96%,
5. lempeng KLT,
6. medium (Nutrien Agar (NA) dan
7. mikroba biakan uji Streptococcus mutans,
8. n-heksan:etil asetat (4:1)
9. NaCl 0,9%.

PROSEDUR KERJA
1. Pembuatan ekstraksi etanol daun pala
Sebanyak 600 gram serbuk daun pala dimaserasi menggunakan etanol 96% selama 5x24 jam,
ditutup dan dibiarkan terlindung dari cahaya sambil berulang-ulang diaduk. Setelah lima hari
sari disaring, ampas diperas kemudian ditambah etanol 96%, diaduk dan disaring kembali. Hasil
penyarian yang diperoleh disatukan dalam wadah kemudian diuapkan menggunakan hairdryer
sehingga diperoleh ekstrak etanol kental.
2. Sterilisasi alat dan bahan
3. Penyiapan mikroba uji
4. Peremajaan bakteri uji
5. Pembuatan suspensi mikroba uji
Mikroba uji hasil peremajaan masing-masing disuspensikan dengan larutan NaCl fisiologis 0,9%
steril dan dimasukkan ke dalam kuvet. Diukur transmitan suspensi biakan itu dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm dengan transmittan 25% T untuk bakteri.
Sebagai blanko digunakan NaCl fisiologis 0,9% steril
6. Uji skrining antimikroba
Ekstrak daun pala (Myristica fragrans Houtt.) ditimbang sebanyak 10 mg lalu dilarutkan dengan
DMSO sebanyak 200 μL (0,2 mL). Eskstrak ditambahkan medium 9,8 mL sehingga diperoleh
konsentrasi 1 mg/mL. Campuran tersebut dituang kedalam cawan petri, lalu dihomogenkan dan
dibiarkan memadat. Suspensi bakteri digoreskan diatas medium yang telah memadat dengan
menggunakan ose bulat kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 x 24 jam
0
untuk bakteri. Diamati aktivitas antimikrobanya yang ditandai dengan ada atau tidaknya
pertumbuhan bakteri.
7. Pemisahan senyawa secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Ekstrak etanol daun pala (Myristica fragrans Houtt.) dilarutkan dalam cairan pengelusi yang
sesuai. Ditotolkan pada lempeng KLT dengan ukuran 7 x 1 cm menggunakan pipa kapiler.
Lempeng KLT sebelum digunakan perlu diaktifkan dahulu dengan cara dipanaskan dalam oven.
Ekstrak dan pembanding ditotolkan kira-kira 1 cm dari tepi bawah lempeng, Biarkan beberapa
saat sampai kering. Lempeng dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang berisi cairan
pengelusi (n-heksan : etil asetat (4:1)) yang telah dijenuhkan. Lempeng dibiarkan terelusi sampai
batas 0,5 cm dari tepi atas lempeng. Lempeng dikeluarkan dari bejana dan diangin-anginkan
sampai cairan pengelusinya menguap. Kromatogram yang dihasilkan diamati nodanya dibawah
sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Noda-noda yang memberikan
flouresensi ditandai pada lempeng.
8. Pengujian secara KLT-Bioautografi
Medium Nutrien Agar (NA) steril yang telah didinginkan sebanyak 10 mL diinokulasikan
dengan bakteri 1 ose dan dituang ke dalam cawan petri steril dan dilakukan secara aseptis.
Lempeng KLT yang telah dielusi diletakkan diatas permukaan medium agar yang sudah
memadat. Lempeng dibiarkan 30 menit dan dipisahkan dari medium. Media diinkubasi pada
suhu 37 C selama 1x24 jam. Zona hambatan akan terlihat pada medium agar, dan dibandingkan
0

dengan kromatogram hasil pengujian KLT.

9. Identifikasi komponen kimia
Kromatogram disemprot dengan menggunakan pereaksi semprot untuk masing-masing
komponen kimia berikut:
1. Pereaksi flavonoid
Aluminium klorida (AlCl3); setelah disemprot tampak bercak berpendar dalam sinar UV 366 nm.
2. Pereaksi fenolik
Pereaksi FeCl3; dipanaskan kromatogram pada suhu 100 C selama 5-10 menit. Diamati noda
O

pada lempeng maka yang akan tampak warna hijau kebiruan atau biru.
3. Pereaksi minyak atsiri
Pereaksi toluena:etil asetat; setelah disemprot tampak bercak berpendar dalam sinar UV 366 nm.
4. Pereaksi terpenoid
Pereaksi H2SO4; setelah disemprot kemudian diamati noda pada lempeng maka yang akan
tampak warna merah.

Pustaka:
1. Uji aktivitas AM dari ekstrak etanol daun pala dengan metode KLT-Bioautografi
2. Sensitivitas Metode Bioautografi Kontak dan Agar Overlay dalam Penentuan Senyawa
Antikapang Eni Kusumaningtyas, Estie Astutf, Darmono
3. Profil Klt-Bioautografi Metabolit Sekunder Actinomycetes Kk 6-1 Dari Rhizosfer Kumis
Kucing (Orthosiphon Stamineus Benth.) Sebagai Penghasil Senyawa Antifungi
4. Thin-Layer and High Performance Liquid Chromatography of Chinese Drugs
5. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity:A review Mounyr Balouirin,
Moulay Sadiki, Saad Koraichi Ibnsouda