LOG BOOK

PRAKTIKUM KROMATOGRAFI

DOSEN PENGAMPU:

Rizki Awaluddin, S.Farm., M.Biomed

ASISTEN DOSEN:

Anggun Mahirotun, S.Farm

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITASDARUSSALAM GONTOR
NGAWI
2019/2020
PERCOBAAN 1
IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA PADA BAHAN ALAM
MENGGUNAKAN METODE KLT DEKSTRUKTIF DAN NON-DEKSTRUKTIF

TUJUAN :
a. Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip dasar pemisahan senyawa secara kromatografi
dan penerapannya dalam bidang farmasi
b. Mahasiswa dapat menjelaskan alasan pemilihan metode KLT untuk identifikasi
golongan senyawa bahan alam
c. Mahasiswa dapat mempraktikkan identifikasi golongan senyawa menggunakan
metode KLT secara dekstruktif dan non-dekstruktif

ALAT DAN BAHAN

Alat :
o Pipet volume 10mL
o Pipet ukur 1 mL
o Vial volume 10 mL
o Gelas ukur 10 mL
o Bejana pengembang kromatografi
o Pipa kapiler (alat penotol)
o Plat KLT F254
o Pendeteksi Sinar UV
o Alat pentotol (kapiler)
o Kalkulator

Bahan :
o Ekstrak dari berbagai tanaman obat
o Pereaksi semprot
o Etanol 96% (pelarut)
o Kertas Saring
o Fase Gerak

CARA KERJA

1. Preparasi sampel
Timbang ekstrak sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan. Larutkan ekstrak dari
berbagai tanaman obat menggunakan Etanol 96% hingga didapatkan konsentrasi
100% (b/v) sebanyak 1 mL dalam wadah kaca (vial). Aduk hingga sampel terlarut
sempurna, saring menggunakan kertas saring, kemudian uapkan pelarut menggunakan
waterbath
Catatan: Pelarut ekstrak dapat disesuaikan berdasarkan sifat senyawa yang akan
diidentifikasi
2. Pembuatan fase gerak
Siapkan sebanyak 10 mL campuran fase gerak. Fase gerak dibuat dengan cara
mencampurkan heksana : diklorometan (50:50). Setelah eluen dibuat, aduk hingga
homogen dimasukkan ke dalam chamber, ditutup dengan plastik wrap dan dibiarkan
sampai jenuh (tunggu selama 15 menit).
3. Persiapan plat KLT
Disiapkan plate KLT (silica gel 60 F 254 ) ukuran 5 x 10 cm. Tandai daerah elusi
sepanjang 8 cm dengan menggunakan pensil. Bagi lebar plat (5 cm) kedalam 5 titik
dengan jarak yang sama, gunakan penggaris.
4. Elusi
Elusi dilakukan menggunakan metode penaikan (ascending type) dengan fase gerak
heksana : diklorometan (50:50). Elusi tetap dilakukan hingga eluent mencapai batas
yang telah ditentukan. Setelah selesai, angkat plat dari chamber lalu angin-anginkan
plat KLT.
5. Identifikasi Bercak
a. Non-destruktif
Bercak diamati dibawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm,
serta berikan tanda pada area bercak menggunakan pensil. Diukur jarak elusi pada
masing-masing spot, lalu catat pada logbook anda
b. Dekstruktif
Spot/bercak yang telah anda tandai lalu semprot menggunakan pereaksi semprot,
diamkan hingga mengering/ panaskan lalu amati bercak yang muncul
Reagen semprot Warna yang tampak Jenis golongan senyawa

H2SO4 10% Berbagai warna, Deteksi umum senyawa

(Identifikasi Umum) menyesuaikan jenis organik
senyawa
FeCl3 Biru hingga biru kehitaman Fenolik

Dragendorf Coklat atau jingga-coklat, Alkaloid

hingga merah jingga
dengan latarbelakang
kuning
AlCl3 kecoklatan Flavonoid
Vanilin-Asam Sulfat Kemerahan Terpenoid
 Laporan Praktikum (1)
IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA PADA BAHAN ALAM
MENGGUNAKAN METODE KLT DEKSTRUKTIF DAN NON-DEKSTRUKTIF

Hari, Tanggal :
TUJUAN :
d. Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip dasar pemisahan senyawa secara kromatografi
dan penerapannya dalam bidang farmasi
e. Mahasiswa dapat menjelaskan alasan pemilihan metode KLT untuk identifikasi
golongan senyawa bahan alam
f. Mahasiswa dapat mempraktikkan identifikasi golongan senyawa menggunakan
metode KLT secara dekstruktif dan non-dekstruktif

DATA HASIL PERCOBAAN

Nama Jumlah Non-Desktruktif* Destruktif*
Ekstrak spot (cm dan Rf) (Rf dan warna)
UV 366 UV 254 ... ... ...

*Catat semua bercak yang muncul

BAHAN DISKUSI PRAKTIKUM (Dikerjakan di rumah, tuliskan referensinya)
1. Jelaskan mengapa senyawa bahan alam dapat diidentifikasi menggunakan KLT, baik
menggunakan metode destruktif maupun non-destruktif
2. Didalam ekstrak yang anda uji tidak semua senyawa terelusi atau tidak muncul dalam
identifikasi, faktor apakah yang mempengaruhinya ?
3. Kapan anda menggunakan metode destruktif dan atau Non-destruktif pada identifikasi
senyawa bahan alam ?
4. Berdasarkan referensi yang anda baca, golongan senyawa apakah yang terkandung
didalam ekstrak anda ? gambarkan salah satu struktur senyawanya
5. Menurut anda, dalam hal apakah praktikum/percobaan ini dapat diterapkan pada
bidang farmasi ?
PERCOBAAN 2
IDENTIFIKASI KUALITATIF BAHAN KIMIA OBAT DALAM JAMU
MENGGUNAKAN KLT

TUJUAN :
1. Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip pemisahan senyawa pada kromatografi cair.
2. Mahasiswa mampu menjelaskan alasan pemilihan metode kromatografi untuk
identifikasi bahan kimia obat dalam jamu
3. Mahasiswa dapat melakukan identifikasi KLT kualitatif pada bahan kimia obat yang
terkandung dalam produk farmasi

ALAT DAN BAHAN

Alat
a. Pipet ukur 10 mL
b. Gelas ukur 5 mL
c. Cawan porselen kecil
d. Chamber KLT
e. Waterbath
f. Kalkulator
Bahan
a. Sampel jamu serbuk merk “A” dan merk “B”
b. Pelarut metanol : air (1:1)
c. Fase gerak kloroform : aseton (80:20) dan kloroform : metanol (90:10)
d. Standar paracetamol
e. Standar asetosal/ aspirin
f. Silica gel 60 F254
g. Kertas saring

CARA KERJA
1. Pembuatan fase gerak
Diukur volume eluen yang dibutuhkan berdasarkan volume chamber. Eluen/fase
gerak dibuat dari campuran kloroform : aseton (80:20) dan kloroform : metanol
(90:10). Setelah eluen dibuat, maka masukkan eluen tersebut ke dalam chamber, tutup
dan biarkan uap eluen jenuh di dalam chamber.
2. Pembuatan larutan standar
Siapkan larutan standar paracetamol dan aspirin menggunakan pelarut metanol
dengan konsentrasi 1000 ppm. Lakukan pelabelan dan siapkan dalam wadah yang
 terpisah.
3. Preparasi sampel
Sampel jamu ditimbang sebanyak 500mg, kandungan senyawa diekstraksi
menggunakan pelarut metanol : air (1:1) sebanyak 10 mL. Lakukan penggojogan
selama 30 menit, lalu disaring lalu disaring dengan kertas saring. Filtrat hasil
penyaringan diuapkan 70oC hingga menjadi mengental. Hasil ekstrak tersebut
kemudian ditotolkan pada plat KLT disertai dengan penotolan standar (beri jarak 1 cm
antar totolan sampel). Angin-anginkan plat pada suhu ruang hingga bercak
mengering.
4. Persiapan plat KLT
Disiapkan/ dipotong plat KLT silica gel 60 F254 dengan ukuran 5 cm x 10 cm. Beri
garis menggunakan pensil pada bagian atas maupun bawah plat dengan jarak 1 cm
dari bagian tepi plat KLT.
5. Elusi
Elusi dilakukan menggunakan metode penaikan (ascending type) dengan fase gerak
kloroform : aseton (80:20) dan kloroform : metanol (90:10). Bagi lebar plat (5 cm)
kedalam 4 titik dengan jarak yang sama, gunakan penggaris. Elusi tetap dilakukan
hingga eluent mencapai batas yang telah ditentukan. Setelah selesai, angkat plat dari
chamber lalu angin-anginkan plat KLT. Bercak diamati dibawah sinar UV pada
panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, serta berikan tanda pada area bercak
menggunakan pensil
6. Analisa
Lakukan analisa hasil dengan menghitung nilai Rf masing-masing bercak, bandingkan
nilai Rf pada sampel dan pada standar baku obat lalu identifikasi senyawa bahan
kimia obat dalam sampel jamu yang diteliti.
 Laporan Praktikum (2)
IDENTIFIKASI KUALITATIF BAHAN KIMIA OBAT DALAM JAMU
MENGGUNAKAN KLT

TUJUAN :
4. Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip pemisahan senyawa pada kromatografi cair.
5. Mahasiswa mampu menjelaskan alasan pemilihan metode kromatografi untuk
identifikasi bahan kimia obat dalam jamu
6. Mahasiswa dapat melakukan identifikasi KLT kualitatif pada bahan kimia obat yang
terkandung dalam produk farmasi

DATA HASIL PERCOBAAN

Sampel Kloroform : Aseton (80:20) Kloroform : metanol (90:10)
Jarak Bercak Nilai Rf Jarak Bercak Nilai Rf
pada UV 254 pada UV 254
Std. Paracetamol
Std. Aspirin
Sampel Jamu “A”
Sampel Jamu “B”

BAHAN DISKUSI PRAKTIKUM (Dikerjakan di rumah, tuliskan referensinya)

1. Gambarkan struktur kimia paracetamol dan aspirin, lalu tandai daerah yang dapat
meredam pendaran dari sinar UV 254 nm (rantai rangkap tunggal)
2. Jelaskan mengapa bahan kimia obat tidak boleh ada didalam sediaan jamu ? adakah
peraturan diindonesia yang mengatur hal tersebut ?
3. Kedua fase gerak memiliki indeks polaritas yang berbeda, sehingga Rf bercak pun
berbeda. Jelaskan perbedaan indeks polaritas keduanya (hitung indeks polaritas
campuran)
4. Jamu merupakan sediaan farmasetik, menurut anda bagaimanakah kriteria jamu yang
baik ?
PERCOBAAN 3
PENETAPAN KADAR PARASETAMOL DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS
TIPIS SECARA SEMI-KUANTITATIF

TUJUAN
1. Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip dasar pemisahan senyawa secara kromatografi
(KLT-Densitometri) dan aplikasinya.
2. Mahasiswa dapat menjelaskan alasan pemilihan metode kromatografi (KLT-
Densitometri) untuk analisis parasetamol.
3. Mahasiswa dapat mempraktikkan analisis kualitatif dan kuantitatif parasetamol dalam
sediaan farmasetik.

ALAT DAN BAHAN

Alat :
o Pipet volume 10mL
o Pipet ukur 1 mL
o Vial volume 10 mL
o Gelas ukur 10 mL
o Labu ukur 100mL
o Bejana pengembang kromatografi
o Pipa kapiler (alat penotol)
o Lampu UV 254 nm dan 366 nm
o Alat pentotol (kapiler)
o Kalkulator dan Laptop

Bahan :
o Tablet pracetamol (2 buah)
o Metanol (pelarut)
o Fase Gerak Kloroform: aseton (70:30)
o Plat Silica gel 60 F 254

CARA KERJA
a. Pembuatan fase gerak/eluen
Siapkan sebanyak 10 mL campuran fase gerak. Fase gerak dibuat dengan cara
mencampurkan kloroform : aseton (70:30). Setelah eluen dibuat, aduk hingga homogen
dimasukkan ke dalam chamber, ditutup dengan plastik wrap dan dibiarkan sampai jenuh
(tunggu selama 15 menit).
b. Pembuatan larutan standar dan kurva baku
Buat larutan standar paracetamol dengan konsentrasi 2000 ppm (2 mg/mL) sebanyak 10
mL. Timbang paracetamol standar sesuai perhitungan, lalu tambahkan metanol.
 Homogenkan hingga larutan nampak jernih. Buat pengenceran secara berseri dari larutan
stok untuk mendapatkan konsentrasi 1000, ppm, 500 ppm dan 250 ppm (total terdapat 4
konsentrasi standar paracetamol).
c. Pembuatan larutan sampel
Diserbuk tablet paracetamol sebanyak 2 tablet. Ditimbang serbuk setara dengan 500 mg
parasetamol dan masukkan serbuk ke dalam labu takar 100 ml, kemudian dilarutkan
dengan metanol hingga tanda batas. Larutan ini lalu dihomogenkan. Ambil 1 ml
larutan tersebut kemudian diencerkan dengan metanol hingga 5 ml.
d. Preparasi plat KLT
Disiapkan plate KLT (silica gel 60 F 254 ) ukuran 5 x 10 cm. Tandai daerah elusi
sepanjang 8 cm dengan menggunakan pensil. Bagi lebar plat (5 cm) kedalam 5 titik
dengan jarak yang sama, gunakan penggaris.
e. Cara penotolan
Ditotolkan larutan standard (4 seri kadar) dan sampel (2 kali replikasi) sebanyak 2
mikroliter. Larutan sampel juga ditotolkan pada plat yang bersejajaran dengan senyawa
standar kurva baku Plat KLT yang telah ditotoli standar & sampel, kemudian dimasukkan
ke dalam chamber untuk dielusi sampai batas yang ditentukan.
f. Elusi
Elusi dilakukan menggunakan metode penaikan (ascending type) dengan fase gerak
kloroform : aseton (70:30). Elusi tetap dilakukan hingga eluent mencapai batas yang telah
ditentukan. Setelah selesai, angkat plat dari chamber lalu angin-anginkan plat KLT.
Bercak diamati dibawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, serta
berikan tanda pada area bercak menggunakan pensil
g. Cara Analisa
Bercak atau spot yang muncul pada plat KLT kemudian difoto dengan resolusi yang
tinggi dan kualitas yang bagus. Hasil foto kemudian dianalisa menggunakan ImageJ
untuk mendapatkan ketebalan/densitas warna pada masing-masing bercak. Densitas
warna pada kurva baku standar dihitung untuk mendapatkan persamaan regresi linear
y=bx+a. Nilai densitas sampel di hitung rata-rata dari ketiga pengukuran, lalu nilai
tersebut diasumsikan sebagai nilai Y dan disubstitusikan kedalam persamaan diatas,
hitung kadar paracetamol dalam per-tabletnya.
 Laporan Praktikum (3)
PENETAPAN KADAR PARASETAMOL DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS
TIPIS SECARA SEMI-KUANTITATIF

TUJUAN
1. Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip dasar pemisahan senyawa secara kromatografi
(KLT-Densitometri) dan aplikasinya.
2. Mahasiswa dapat menjelaskan alasan pemilihan metode kromatografi (KLT-
Densitometri) untuk analisis parasetamol.
3. Mahasiswa dapat mempraktikkan analisis kualitatif dan kuantitatif parasetamol dalam
sediaan farmasetik.

DATA HASIL PERCOBAAN

Kadar Jarak elusi Nilai Rf Luas Area
analit (ImageJ)
PCT 2000 ppm
PCT 1000 ppm
PCT 500 ppm
PCT 250 ppm

Regresi linear y=bx+a

Slope (b) :
Intercept (a) :
Linearitas (r) :
Maka, didapat persamaan regresi linear ialah: ....

Luas Faktor
Jarak elusi Rerata Kadar
Sampel Nilai Rf Area Pengencer
analit Luas area (ppm) ± SD
(ImageJ) an
Sampel
Replikasi 1
Sampel
Replikasi 2

BAHAN DISKUSI PRAKTIKUM (Dikerjakan di rumah, tuliskan referensinya)

1. Gambarkan struktur kimia paracetamol lalu tandai daerah yang dapat meredam
pendaran dari sinar UV 254 nm (rantai rangkap tunggal)
2. Berdasarkan referensi, bagaimanakah metode analisa kuantitatif menggunakan KLT ?
3. Berapakah minimal toleransi perbedaan kadar antara konsentrasi paracetamol yang
terukur dan klaim dosis yang tertera pada produk (500 mg) ?
4. Menurut anda, dalam hal apakah praktikum/percobaan ini dapat diterapkan pada
bidang farmasi ?
PERCOBAAN 4
PEMISAHAN CAMPURAN SENYAWA OBAT MENGGUNAKAN
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

TUJUAN
1. Mahasiswa mampu menjelaskan prinsip pemisahan senyawa pada kromatografi
2. Mahasiswa mampu mengaplikasikan faktor yang mempengaruhi pemisahan senyawa dan
kecepatan elusi pada kromatografi cair
3. Mahasiswa mampu mempraktikkan metode kromatografi untuk memisahkan senyawa
obat dalam campuran

ALAT DAN BAHAN

Alat :
o Pipet volume 10mL
o Pipet ukur 1 mL
o Vial volume 10 mL
o Gelas ukur 10 mL
o Labu ukur 100mL
o Bejana pengembang kromatografi
o Pipa kapiler (alat penotol)
o Lampu UV 254 nm dan 366 nm
o Alat pentotol (kapiler)
o Kalkulator

Bahan:
a. Plat Silica gel 60 F 254
b. Fase gerak kloroform : aseton (80:20) dan kloroform : aseton (50:50).
c. Kertas saring
d. Standar parasetamol
e. Standar asam mefenamat
f. Standar ibuprofen
g. Sampel serbuk obat “X”

CARA KERJA
a. Pembuatan fase gerak/eluen
Siapkan sebanyak 10 mL campuran fase gerak. Fase gerak dibuat dengan cara
mencampurkan kloroform : aseton (80:20) dan kloroform : aseton (50:50). Setelah eluen
dibuat, aduk hingga homogen dimasukkan ke dalam chamber, ditutup dengan plastik
 wrap dan dibiarkan sampai jenuh (tunggu selama 15 menit).
b. Pembuatan larutan standar
Siapkan larutan standar paracetamol, ibuprofen dan asam mefenamat menggunakan
pelarut metanol dengan konsentrasi 1000 ppm. Lakukan pelabelan dan siapkan dalam
wadah yang terpisah.
c. Preparasi sampel serbuk “X”
Sampel yang diduga mengandung campuran beberapa obat terserbut diekstraksi
menggunakan metanol. Ekstraksi dilakukan dengan cara menimbang 50 mg serbuk dalam
10 mL pelarut (metanol). Aduk dan homogenkan selama 5 menit agar campuran senyawa
dapat terlarut sempurna. Siapkan kertas saring, lalu saring sampel dan tampung filtratnya
kedalam wadah terpisah.
d. Preparasi plat KLT
Disiapkan plate KLT (silica gel 60 F 254 ) ukuran 5 x 10 cm. Tandai daerah elusi
sepanjang 8 cm dengan menggunakan pensil. Bagi lebar plat (5 cm) kedalam 5 titik
dengan jarak yang sama, gunakan penggaris.
e. Cara penotolan
Ditotolkan 3 larutan standard (standar paracetamol, ibuprofen dan asam mefenamat ) dan
2 totolan sampel sebanyak 2 mikroliter dengan menggunakan mikrotube. Plate KLT yang
telah ditotoli standar & sample, kemudian diangin-anginkan hingga mengering, lalu
dimasukkan ke dalam chamber untuk dielusi sampai batas yang ditentukan.
f. Elusi
Elusi dilakukan menggunakan metode penaikan (ascending type) dengan fase gerak
kloroform : aseton (80:20) dan kloroform : aseton (50:50).Elusi tetap dilakukan hingga
eluent mencapai batas yang telah ditentukan. Setelah selesai, angkat plat dari chamber
lalu angin-anginkan plat KLT. Bercak diamati dibawah sinar UV pada panjang
gelombang 254 nm dan 366 nm, serta berikan tanda pada area bercak menggunakan
pensil
g. Cara Analisa
Bercak atau spot senyawa diidentifikasi menggunakan UV pada panjang gelombang
254nm dan 366 nm, daerah bercak ditandai menggunakan pensil agar tidak memunculkan
bercak baru pada plat. Hitung jarak analit dan jarak eluen menggunakan penggaris.
Hitung nilai Rf pada masing-masing bercak dan bandingkan Rf pada campuran dan
senyawa baku standar.
 Laporan Praktikum (4)
PEMISAHAN CAMPURAN SENYAWA OBAT MENGGUNAKAN
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

TUJUAN
4. Mahasiswa mampu menjelaskan prinsip pemisahan senyawa pada kromatografi
5. Mahasiswa mampu mengaplikasikan faktor yang mempengaruhi pemisahan senyawa dan
kecepatan elusi pada kromatografi cair
6. Mahasiswa mampu mempraktikkan metode kromatografi untuk memisahkan senyawa
obat dalam campuran

DATA HASIL PERCOBAAN

Sampel Kloroform : Aseton (80:20) kloroform : aseton (50:50)
Jarak Bercak Nilai Rf Jarak Bercak Nilai Rf
pada UV 254 pada UV 254
Std. Paracetamol
Std. Aspirin
Std. Ibuprofen
Std. Asam
mefenamat
Sampel “X”

BAHAN DISKUSI PRAKTIKUM (Dikerjakan di rumah, tuliskan referensinya)

1. Gambarkan struktur kimia paracetamol, aspirin, ibuprofen, dan asam mefenamat.
Cantumkan nilai koefisien partisi pada masing-masing senyawa
2. Koefisien partisi merefleksikan kelarutan senyawa dalam lemak dan air, serta tingkat
polaritas senyawa. Apa saja faktor yang mempengaruhi migrasi senyawa pada KLT ?
dan berdasarkan hasil percobaan anda apakah berbedaan Rf bercak senyawa
bersesuaian dengan koefisien partisi ?
3. Berdasarkan referensi, berapa kadar minimal pengotor (impurity) yang dapat
ditoleransi didalam sediaan farmasetik ?
4. Menurut anda, dalam hal apakah praktikum/percobaan ini dapat diterapkan pada
bidang farmasi ?
PERCOBAAN 5
PEMISAHAN GOLONGAN SENYAWA BAHAN ALAM MENGGUNAKAN
KROMATOGRAFI KOLOM

TUJUAN
1. Mahasiswa mampu menjelaskan prinsip pemisahan pada kromatografi kolom
2. Mahasiswa mampu menjelaskan prinsip pemisahan senyawa berdasarkan polaritas fase
gerak
3. Mahasiswa mampu memisahkan senyawa dari bahan alam berdasarkan polaritasnya
menggunakan kromatografi kolom

ALAT DAN BAHAN

Alat:
o Kolom kromatografi 50 mL
o Pipet volume 10mL
o Pipet ukur 1 mL
o Vial volume 10 mL
o Gelas ukur 10 mL
o Labu ukur 100mL
o Bejana pengembang kromatografi
o Pipa kapiler (alat penotol)
o Lampu UV 254 nm dan 366 nm
o Alat pentotol (kapiler)

Bahan:
o Serbuk Silica gel 60 F 254
o Plat KLT Silica gel 60 F 254
o Fase gerak Etanol (100), Etanol : Etil asetat (50:50), Etil Asetat (100)
o Kertas saring
o Metanol

CARA KERJA
1. Persiapan Kolom
Rangkai alat kromatografi kolom pada statif. Taruh sedikit kapas pada dasar kolom.
Timbang serbuk silika sebanyak 5 gram, lalu tuang kedalam kolom kromatigrafi dan ketuk-
ketuk pada dinding kolom. Teteskan metanol pada serbuk silika yang terdapat pada kolom
agar silika menjadi basah.
2. Preparasi Sampel
Siapkan ekstrak simplisia bahan alam, dan timbang sebanyak 500 mg. Timbang 2 gram
serbuk silika dan campurkan dengan ekstrak yang sudah ditimbang. Aduk hingga homogen.
Tuang silika yang mengandung sampel pada kolom (lapisan paling atas).
3. Elusi senyawa

Siapkan fase gerak Etanol (100), Etanol : Etil asetat (50:50), Etil Asetat (100) sebanyak 25
mL pada wadah yang berbeda. Siapkan wadah dibawah kolom kromatografi untuk
menampung hasil pemisahan senyawa.Tuang perlahan fase gerak dari yang paling polar
dengan bantuan corong gelas, tampung hasil pemisahan dan lakukan pelabelan hasil fraksi,
tampung hingga fase gerak habis dari kolom pemisahan. Lakukan hal tersebut pada fase
gerak yang lain !
4. Identifikasi Bercak senyawa
a. Pembuatan fase gerak/eluen
Siapkan sebanyak 10 mL campuran fase gerak. Fase gerak dibuat dengan cara
mencampurkan kloroform : aseton (80:20) dan kloroform : aseton (50:50). Setelah
eluen dibuat, aduk hingga homogen dimasukkan ke dalam chamber, ditutup dengan
plastik wrap dan dibiarkan sampai jenuh (tunggu selama 15 menit).

b. Preparasi sampel
Hilangkan pelarut dari hasil fraksi dengan cara memanaskannya pada waterbath,
hingga cairan sedikit mengental. Siapkan plate KLT (silica gel 60 F 254 ) ukuran 5 x
10 cm. Tandai daerah elusi sepanjang 8 cm dengan menggunakan pensil. Bagi lebar
plat (3 cm) kedalam 3 titik dengan jarak yang sama, gunakan penggaris.
Ditotolkan sampel dan labeli pada plat dengan tulisan (pensil) jenis fraksi yang
ditotolkan, kemudian dimasukkan ke dalam chamber untuk dielusi sampai batas yang
ditentukan.
c. Elusi
Elusi dilakukan menggunakan metode penaikan (ascending type) dengan fase gerak
kloroform : aseton (80:20) dan kloroform : aseton (50:50).Elusi tetap dilakukan
hingga eluent mencapai batas yang telah ditentukan. Setelah selesai, angkat plat dari
chamber lalu angin-anginkan plat KLT. Bercak diamati dibawah sinar UV pada
panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, serta berikan tanda pada area bercak
menggunakan pensil
c. Cara Analisa
Bercak atau spot senyawa diidentifikasi menggunakan UV pada panjang gelombang
254nm dan 366 nm, daerah bercak ditandai menggunakan pensil agar tidak
memunculkan bercak baru pada plat. Hitung jarak analit dan jarak eluen
menggunakan penggaris. Hitung nilai Rf pada masing-masing bercak
 Laporan Praktikum (5)
PEMISAHAN GOLONGAN SENYAWA BAHAN ALAM MENGGUNAKAN
KROMATOGRAFI KOLOM

TUJUAN
4. Mahasiswa mampu menjelaskan prinsip pemisahan pada kromatografi kolom
5. Mahasiswa mampu menjelaskan prinsip pemisahan senyawa berdasarkan polaritas fase
gerak
6. Mahasiswa mampu memisahkan senyawa dari bahan alam berdasarkan polaritasnya
menggunakan kromatografi kolom

DATA HASIL PERCOBAAN

Sampel UV 254 nm UV 366 nm
Jarak Bercak Nilai Rf Jarak Bercak Nilai Rf

BAHAN DISKUSI PRAKTIKUM (Dikerjakan di rumah, tuliskan referensinya)

1. Gambarkan skema kromatografi kolom yang anda buat dan jelaskan mekanisme
pemisahan pada kromatografi kolom
2. Berdasarkan referensi, senyawa apa saja yang terkandung didalam ekstak yang anda
pisahkan ?
3. Apakah terdapat perbedaan bercak pada masing-masing fase gerak ?, mengapa hal
tersebut dapat terjadi, jelaskan!
4. Apakah metode ini dapat digunakan sebagai salah satu metode isolasi senyawa ?,
jelaskan !
5. Menurut anda, dalam hal apakah praktikum/percobaan ini dapat diterapkan pada
bidang farmasi ?
DAFTAR PUSTAKA

Christian, D., 2003. Analytical Chemistry. Washington: John Wiley & Sons Inc.

Deinstrop, E., 2007. Applied Thin-Layer Chromatography: Best Practice and Avoidance of
Mistakes. Weihheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & KGaA .

Khopkar, S., 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Universitas Indonesia Press.

Peter, E. W., 2005. Thin- layer Chromatography. A Modern Practical Approach. UK: The
Royal Society of Chemistry.

Rahman, A., 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Bandung: ITB Press.

Sastrohamidjojo, H., 2005. Kimia Organik (Stereokimia, Karbohidrat, Lemak, dan Protein).
Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Shargel, L. &. Y. A. B., 2005. Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan. Ed. 2 ed.
Surabaya: Airlangga University.

Sudarmadji, S. d., 2007. Analisis Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta: Liberty.

Wulandari, L., 2011. Kromatografi Lapis Tipis. Jember: Pt. Taman Kampus Presindo.