Pencarian senyawa anti

mikroba
Antibiotik yang ideal:

◦ Mudah didapat/banyak tersedia di masyarakat

◦ Murah
◦ Strukturnya stabil
◦ Mudah penggunaan
◦ Nontoxic and nonallergenic
◦ Selektif terhadap patogen
Pencarian senyawa antimikroba baru
biasanya melalui tahapan:

Penapisan tahap pertama,

 yaitu uji antagonis isolat-isolat terhadap

mikrob uji dengan metode konfrontasi di

media agar di cawan Petri.
Penapisan tahap kedua
 Isolat yang berpotensi kemudian diuji lebih

lanjut dengan menumbuhkan isolat pada media

cair untuk diambil ekstraknya.
 Ekstrak dapat berasal dari filtrat kultur atau sel.

Filtrat kultur dapat diuji langsung pada media

agar di cawan Petri dengan metode sumur atau
dapat diekstrak terlebih dahulu, demikian juga
dengan sel yang harus diekstrak terlebih dahulu
sebelum diuji dengan metode cakram kertas
Penapisan tahap ketiga
 dilakukan untuk mengetahui sifat-sifat awal

dari senyawa-senyawa antimikrob tersebut.

 Perlu dilakukan purifikasi atau pemisahan

senyawa aktif dari senyawa aktif yang lain

atau dari senyawa pengotor yang ada.
Produksi senyawa antimikroba

 Tahap produksi dilakukan dengan cara

mengambil sejumlah starter dan
diinokulasikan ke dalam media produksi
 Contoh: medium produksiBacto peptone

Yeast Extract.
 Fermentasi dilakukan pada suhu kamar pada

rotary shaker selama 5 hari.

Ekstraksi dengan Pelarut Organik

 Proses ekstraksi dilakukan dengan menambahkan pelarut

(misal: butanol , etil asetat). Volume pelarut ditambahkan
dengan perbandingan 1:1, kocok selama 1 jam dengan
shaker lalu disentrifugasi selama 15 menit dengan
kecepatan 8000 rpm.
 Supernatan dipisahkan dari filtrat dan dimasukkan ke dalam
labu rotavapor yang telah diketahui berat konstannya.
 Pemekatan dilakukan menggunakan rotary vacum
evaporator dan ditimbang berat ekstrak kering yang
diperoleh.
 Ekstrak kasar dilarutkan dengan pelarut pada konsentrasi
tertentu untuk keperluan uji aktivitas, purifikasi dan
karakterisasi.
Produksi dan ekstraksi senyawa aktif

Uji
aktivitas

Kultur 6 hari, Ekstrak

120 rpm Ekstraksi
Contoh Uji Aktivitas Antimikroba

 Uji aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi

agar dengan menggunakan kertas cakram diameter 6 mm.
 Mikroba uji E. coli, S. aureus, P. aeruginosa dan B. subtilis
ditumbuhkan pada medium NA (Nutrient Agar) sedangkan
C. albicans dan A. niger ditumbuhkan pada PDA (Potato
Dextrose Agar).
 Sebanyak 15 μl ekstrak sampel diteteskan dalam kertas
cakram, kemudian dikeringkan dengan cara diangin-
anginkan. Selanjutnya diletakkan pada permukaan agar
yang telah diinokulasikan 15 μl (106 sel/ml) mikroba uji
per cawan petri. Inkubasi dilakukan pada suhu 30 °C
selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk diukur
diameter zonanya (Prescott et al. 2002).
Uji Difusi Agar
Kromatografi lapis tipis

 Pemisahan dengan kromatografi lapis tipis dilakukan

menggunakan aluminium silika gel 60 F254 (Merck).
 Ekstrak kasar dikembangkan dengan pelarut organik

non polar sampai polar (benzena, dietil eter,

kloroform, etil asetat, metilen klorida, butanol, iso
propanol, n-propanol, aseton, metanol, etanol).
 Noda hasil pemisahan diamati dibawah UV 254 dan

366 nm. Pelarut yang dapat memisahkan komponen

paling baik dan banyak maka digunakan sebagai
eluen pada kromatografi kolom.
Pemisahan dan Pemurnian Senyawa Aktif
 Ekstrak yang sudah dipekatkan selanjutnya
difraksinasi menggunakan kromatografi kolom
(φ20 x 320 mm), dengan fasa diam silika gel 60
(0,063-0,200 mm) dan fasa gerak butanol, iso-
propanol dan metanol dengan sistem gradien.
 Tiap kelompok fraksi diuji aktivitas

antimikrobanya untuk mendapatkan kelompok

fraksi yang aktif. Kelompok fraksi aktif yang
terpilih kemudian dimurnikan lebih lanjut dengan
menggunakan metoda HPLC preparatif, hingga
diperoleh senyawa tunggal yang murni dan aktif.
Contoh pengujian fraksi-fraksi
Elusidasi Struktur Molekul

 Elusidasi struktur merupakan suatu proses

yang dilakukan untuk menentukan rumus
struktur dari suatu senyawa yang dilakukan
dengan teknik spektroskopi.
 Teknik ini memanfaatkan jejak suatu molekul

yang dikonversi menjadi sinyal listrik dan

dicatat oleh suatu pencatat (rekorder).
 Dalam mengelusidasi struktur diperlukan

data spektrum dari suatu sampel, baik

berupa spektrum UV-Vis, IR, MS dan NMR.
Spektroskopi UV

 Untuk keperluan penentuan struktur

spektroskopi UV memiliki kemampuan untuk
mengukur jumlah ikatan rangkap atau
konjugasi aromatik dalam suatu molekul.
 Daerah panjang gelombang dari spektrum UV

berkisar 200 - 400 nm. Penyerapan sinar UV

oleh suatu molekul akan menghasilkan
transisi diantara tingkat energi elektronik
molekul tersebut.
Spektroskopi IR

 Spektrum IR dapat memberikan informasi mengenai gugus

fungsi yang terdapat pada suatu molekul. Hal ini disebabkan
oleh perbedaan frekuensi vibrasi setiap jenis ikatan kimia.
 Frekuensi vibrasi juga berbeda pada jenis ikatan yang sama
pada molekul yang berlainan akibat dari perbedaan
lingkungan yang dimiliki oleh ikatan tersebut. Perbedaan ini
menyebabkan spektrum IR disebut sebagai spektrum sidik
jari, dengan daerah sidik jari (finger print region) pada
frekuensi 1300-900 cm-1. Setiap struktur molekul memiliki
spektrum yang spesifik. Meski spektrum IR spesifik untuk
setiap molekul, tetapi gugus fungsi yang berbeda
memberikan pita-pita absorbsi di frekuensi yang sangat
dekat. Hal ini berakibat spektrum IR tidak dapat digunakan
sebagai satu-satunya cara identifikasi struktur molekul.
 Spektrum IR lebih sering digunakan untuk
mengidentifikasi keberadaan gugus fungsi
yang memiliki pita spesifik yaitu : C=O, O-H,
N-H, C-O, C=C, C≡ N dan NO 2. Saat ini ada
dua macam instrumen yaitu spektrofotometer
IR dan FTIR (Fourier Transform Infrared). FTIR
lebih sensitif dan akurat, misalkan dapat
membedakan bentuk cis dan trans, ikatan
rangkap terkonjugasi dan terisolasi dan lain-
lain yang dalam spektrofotometer IR tidak
dapat dibedakan (Sitorus 2009).
Spektroskopi massa
 Spektrometer massa bekerja dengan memilah dan
mengidentifikasi ion menurut massa, sesuai dengan
rasio fragmentasi (m/z). Komponen utama dari alat ini
adalah sumber ion (ion source) yang menghasilkan ion
dan penganalisis massa (mass analyzer) yang menseleksi
ion. Sistem LC-MS umumnya menggunakan beberapa
jenis ion source dan mass analyzer yang dapat
disesuaikan dengan kepolaran senyawa yang akan
dianalisis.
 Spektroskopi massa (MS) akan melengkapi pelacakan

struktur untuk suatu molekul yang belum diketahui

bobot molekulnya. Spektroskopi massa akan
memberikan informasi harga bobot molekul (g/mol)