2.

4 Tipe Kromatografi

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran

berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam
media tertentu. Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya
distribusi komponen-komponen dalam fase diam dan fase gerak
berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan.
Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase
yaitu fase diam (stationer) dan fase bergerak (mobile)
(Ardianingsih, 2009).

Tipe-tipe kromatografi diantaranya kromatografi lapis tipis,

kromatografi kertas, kromatografi kolom cair vakum, kromatografi
cair kinerja tinggi, dan kromatografi afinitas.

a. Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis

kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan
memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran. Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan
perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang
digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari
bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis
sampel yang ingin dipisahkan (Syamsul, dkk., 2018).

Proses kerja kromatografi lapis tipis ini adalah, silica gel dapat
membentuk ikatan hidrogen pada permukaanya, karena pada
permukaan silica gel terdapat gugus hidroksil dan silica gel sendiri
bersifat sangat polar. Jika fase gerak yang digunakan sifatnya non-
polar, maka pada saat silica gel yang sudah ditotol dengan pigmen
dimasukkan kedalam fase gerak, maka senyawa yang bersifat polar
akan semakin lama bertahan pada fase stasioner, sedangkan
senyawa yang bersifat sedikit atau non polar akan terbawa keluar
dengan cepat (Kondororik, dkk., 2018).

b. Kromatografi kertas

Kromatografi kertas yang berfungsi untuk memisahkan

warna-warna pada tumbuhan. Jika berat molekulnya kecil maka
pigmen fotosintesis akan terbawa larutan kromatografi lebih jauh.
Sebaliknya, jika berat molekul pigmen besar, maka pigmen warna
akan terbawa lebih dekat (Jintan, dkk., 2015).

c. Kromatografi kolom cair vakum (KCV)

KCV bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa

didalam ekstrak. Sampel tersebut bermigrasi terhadap fasa diam
dan fasa gerak dengan cepat karena berada dalam suasana vakum
Prinsip kerja KVC yaitu partisi dan adsorpsi komponen senyawa
yang pemisahannya dibantu dengan tekanan dari alat vakum
(Mutmainnah, dkk., 2017).

d. Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah

pengembangan terkini dari kromatografi cair kolom klasik, dimana
pada KCKT ini terdapat pengembangan teknologi pada kolom,
detektor yang lebih sensitif dan peka serta kemajuan teknologi
pada pompa bertekanan tinggi yang menyebabkan KCKT menjadi
suatu metode dengan sistem pemisahan zat yang cepat dan efisien
(Aulia, dkk., 2017).

e. Kromatografi afinitas

Kromatografi afinitas menggunakan prinsip afinitas untuk

memurnikan atau memisahkan berbagai macam komponen.
Afinitas merupakan gaya tarik antar dua komponen atau zat yang
besarannya sangat spesifik untuk tiap komponen. Gaya tarik inilah
yang akan membuat dua komponen berkombinasi satu sama lain.
Persitiwa ini terjadi pada interaksi enzim dengan substrat atau
antibodi dan antigen yang merupakan substansi biologis. Interaksi
ini bersifat sangat spesifik sehingga sangat bisa diandalkan untuk
memurnikan produk dengan kualitas tinggi (Ikhsan, 2015).

Interaksi antara dua komponen karena afinitas tersebut

dimanfaatkan pada kromatografi afinitas dengan cara membuat
salah satu komponen terimobilisasi pada matriks atau dapat disebut
material pendukung (support material). Media padat tersebut
kemudian dimasukan dalam kolom kromatografi yang kemudian
dikenal sebagai ligan afinitas (affinity ligand). Ligan tersebut
merupakan fasa stasioner pada kolom kromatografi afinitas
(Ikhsan, 2015).

2.5 Pengukuran Pigmen Menggunakan Spektrofotometer

Hubungan antara penyerapan cahaya dengan kosentrasi larutan

merupakan prinsip dasar dari penggunaan spektrofotometer yang
menggunakan cahaya monokromatik. Metode ini berdasarkan
penyerapan sinar ultraviolet maupun sinar tampak yang
menyebabkan terjadinya transisi elektron (perpindahan elektron
dari tingkat energi yang rendah ketingkat energi yang lebih tinggi).
Sifat fisik klorofil adalah menerima dan atau memantulkan cahaya
dengan gelombang yang berlainan (berpendar = berfluoresensi).
Klorofil banyak menyerap sinar dengan panjang gelombang antara
400- 700 nm, terutama sinar merah dan biru (Ai & Banyo, 2011;
Octaviani, dkk., 2014).
 Daun sebagian besar tumbuhan menyerap 90% panjang
gelombang ungu dan biru yang mengenainya dan hampir sebesar
presentase panjang gelombang jingga dan merah. Hampir semua
penyerapan ini dilakukan oleh pigmen kloroplas. Tiap foton dapat
mengekstasi sebuah elektron pada karotenoid atau klorofil yang
terjadi dalam tilakoid. Klorofil berwarna hijau karena tidak efektif
dalam menyerap panjang gelombang hijau, melainkan
memantulkannya. Pengukuran penyerapan nisbi berbagai panjang
gelombang cahaya oleh pigmen yang dimurnikan dapat
menggunakan spektrofotometer. Spektrum serap klorofil a dan
klorofil b adalah panjang gelombang ungu, biru, jingga, dan merah
(600-700 nm) dan sedikit menyerap pada panjang gelombang 500-
600 nm (hijau dan kuning-hijau). β-karoten dan lutein (suatu
xantofil) hanya menyerap panjang gelombang biru dan ungu in
vitro dan memantulkan panjang gelombang hijau, kuning, jingga,
dan merah, sehingga terlihat berwarna kuning atau jingga (Maulid
& Laily, 2015).

Penyerapan cahaya pada panjang gelombang tertentu :

- Klorofil a: 13,7 x OD 665 – 5,76 OD 649 (mg/ml)

- Klorofil b: 25,8 x OD 649 – 7,7 OD 665 (mg/ml)
- Klorofil total: 20,0 x OD 649 + 6,1 OD 665 (mg/ml)

(Maulid & Laily, 2015)

 BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian fotosintesis ini dilaksanakan pada hari Kamis

tanggal 18 Oktober 2018, pukul 13:30 hingga 16:30 WIB
bertempat di Laboratorium Biosains dan Teknologi Tumbuhan,
Jurusan Biologi, Fakultas Ilmu Alam, Institut Teknologi Sepuluh
Nopember, Surabaya.

3.2 Alat dan Bahan dan Cara Kerja

3.2.1 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktkum ini adalah kertas saring

ukuran 3 x 15 cm, alat spektrofotometer, kuvet, cawan petri, mortar
dan alu, solatip, alumunium foil, dan gelas erlenmeyer. Sedangkan
bahan yang digunakan adalah daun Excoecaria bicolor dan alkohol
95%.

3.2.2 Cara Kerja

Pada penelitian mengenai pemisahan pigmen fotosintetik

pada daun Excoecaria bicolor, diambil 2 gram daun dan digerus
dengan mortar dalam 25 ml alkohol 95% sampai seluruh klorofil
terlarut. Ekstrak akan terlihat berwarna hijau. Ekstrak dibiarkan
beberapa menit sampai ampas daun mengendap. Dituangkan cairan
ekstrak ke dalam cawan petri. Diambil kertas saring yang telah
disediakan dan dicelupkan bagian ujung yang kertas saring yang
lancip tersebut ke dalam ekstrak klorofil yang berada pada cawan
petri. Ujung kertas saring yang lainnya diberi solatip kemudian
ditempelkan di dinding. Dibiarkan kertas saring untuk beberapa
lama sampai terlihat pemisahan pigmen yang terkandung di
dalamnya. Diperhatikan ada berapa macam pigmen diperoleh
dalam ekstrak. Penelitian pengukuran pigmen menggunakan
spektrofotometer dilakukan dengan cara diambil 0.1 gram daun
dan digerus dengan mortar dalam 10 ml alkohol 95% sampai
seluruh klorofil terlarut. Ekstrak dibiarkan beberapa menit sampai
ampas daun mengendap. Cairan ekstrak di saring menggunakan
kertas saring. Cairan ekstrak daun Excoecaria bicolor dimasukkan
ke dalam kuvet. Kuvet dimasukkan ke alat spektrofotometer.
Spektrofotometer dinyalakan dan hasil OD (Optical Density)
muncul di layar. Dilakukan perhitungan panjang gelombang
klorofil a, klorofil b, dan klorofil total.

3.5 Metode yang Digunakan

Pada penelitian ini dilakukan pengamatan pemisahan pigmen

fotosintetik pada daun Excoecaria bicolor dengan perlakuan
berupa penumbukan 2 gram daun Excoecaria bicolor yang
ditambahkan dengan 25 ml alkohol 95% sampai terbentuk ekstrak
daun, kemudian ujung kertas saring dicelupkan ke dalam cairan
ekstrak. Pada pengukuran pigmen menggunakan spektrofotometer
dilakukan perlakuan berupa penumbukan 0.1 gram daun
Excoecaria bicolor yang ditambahkan dengan 10 ml alkohol 95%
sampai terbentuk ekstrak daun, kemudian cairan ekstrak di
masukkan ke dalam kuvet dan ditentukan OD (Optical Density)
menggunakan alat spektrofotometer.

3.6 Analisa Data

Warna pigmen yang muncul pada kertas saring dicatat dan

dihitung nilai refensifaktor (Rf) masing-masing warna dengan
perhitungan jarak tempuh warna pigmen dibagi dengan jarak
tempuh pelarut. Pada perhitungan panjang gelombang klorofil a,
klorofil b, dan total klorofil digunakan alat spektrofotometer untuk
menentukan OD (Optical Density) pada masing-masing pigmen
yang terdeteksi.
 DAFTAR PUSTAKA

Ardianingsih, R. 2009. Penggunaan High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) dalam Proses Analisa Deteksi

ion. Berita dirgantara, Vol. 10 (4), pp. 101-104.

Aulia, S. S., Sopyan, I., & Muchtaridi. 2017. Penetapan Kadar

Simvastatin Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi (KCKT) : Review. Farmaka, Vol. 14 (4).

Ai1, N. S. dan Banyo, Y. 2011. Konsentrasi Klorofil Daun sebagai

Indikator Kekurangan Air pada Tanaman. Jurnal Ilmiah

Sains, Vol. 11 (2).

Kondororik, F., Martosupono, M., dan Susanto, A. B. 2016.

Identifikasi Komposisi Pigmen, Isolasi, dan Aktivitas

Antioksidan β Karoten pada Rumput Laut Merah
Gracilaria gigas Hasil Budidaya. Jurnal Biologi dan
Pembelajarannya, Vol.3 (1), pp : 8-17.

Jintan, Yuzammi, Suwastika, I. N., & Pitopang, R. 2015. Studi

Beberapa Aspek Botani Amorphophallus paeoniifolius

Dennst. Nicolson (Araceae) di Lembah Palu. Online
Jurnal of Natural Science, Vol. 4(1).

Maulid, R. R. dan Laily, A. N. 2015. Kadar Total Pigmen Klorofil

 dan Senyawa Antosianin Ekstrak Kastuba (Euphorbia
pulcherrima) Berdasarkan Umur Daun. Seminar Nasional
Konservasi dan Pemanfaatan Sumber Daya Alam.

Mutmainnah, P. A., Hakim, A., Savalas, L. R. T. 2017. Identifikasi

Senyawa Turunan Hasil Fraksinasi Kayu Akar Artocarpus

odoratissimus. Jurnal Penelitian Pendidikan IPA, Vol. 3
(2).

Octaviani, T., Guntarti, A., & Susanti, H. 2014. Penetapan Kadar

ß-Karoten pada Beberapa Jenis Cabe (Genus Capsicum)

dengan Metode Spektrofotometer Tampak. Pharmaҫiana,
Vol. 4 (2), pp. 101-109.

Syamsul, E. S., Mulyani, R. N., Jubaidah, S. 2018. Identifikasi

Rhodamin B pada Saus Tomat yang Beredar di Pasar Pagi

Samarinda. Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, Vol. 3(1), pp. 125-
133.