MAKALAH

“ELEKTROGRAVIMETRI”

Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas

Mata Kuliah Analisis Instrumentasi

Dosen Pengampuh : Prof. Dr. H. Baharuddin Hamzah, S.Farm., MS.

Oleh :

Kelompok IV

1. Aprilianti Pauner (A251 17 084)

2. Dandi (A251 17 050)
3. Khairun Nisa (A 251 17 154)
4. Muhammad Rizal (A 251 17 035)
5. Sitti Armiyanti Lahangko (A 251 17 085)
6. Sufia (A 251 17 012)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

JURUSAN PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS TADULAKO

2019
 KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang
telah melimpahkan rahmat dan hidayahNya sehingga kami dapat menyelesaikan 
makalah dengan judul “Elektrogravimetri” sebagai pemenuhan tugas mata kuliah
Analisis Instrumentasi yang diberikan demi tercapainya tujuan pembelajaran yang
telah direncanakan.

Dalam penulisan makalah ini tidak terlepas dari bantuan, bimbingan, cinta
kasih dan kerja sama serta doa dari berbagai pihak. Untuk itu kami menyampaikan
terima kasih yang sebesar-besarnya kepada orang yang ada di sekitar, yang telah
membantu tercapainya makalah ini tepat pada waktu yang ditentukan.

Kami menyadari bahwa masih banyak kekurangan baik dari kuantitas maupun
kualitas dalam penulisan makalah ini. Karena itu kami mengharapkan kritik serta
saran yang membangun dari berbagai pihak demi perbaikan dan demi terciptanya
makalah yang lebih baik selanjutnya.. Maka kami dengan penuh rasa syukur
mempersembahkan makalah ini semoga bermanfaat untuk kita semua.

Palu, 30 September 2019

Penyusun
Kelompok IV

DAFTAR ISI

Analisis Instrumentasi Page ii

HALAMAN JUDUL
KATA PENGANTAR
DAFTAR ISI
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
1.2 Rumusan Masalah
1.3 Tujuan Penulisan
1.4 Manfaat Penulisan
BAB II PEMBAHASAN
2.1 Pencernaan Protein oleh Enzim Pankreas di dalam Usus Halus
2.1 Pencernaan Protein oleh Enzim dari Sel Usus
2.2 bsorpsi Protein

BAB III PENUTUP

3.1 Kesimpulan
3.2 Saran
DAFTAR PUSTAKA

Analisis Instrumentasi Page iii

 BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan
Schraiber. Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai peunjang
fase diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah
kromatogram.Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan tinggi dan mudah untuk
memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.Pada dasarnya kromatografi
lapis tipis (KLT atau TLC = Thin layer Chromatography) sangat mirip dengan
kromatografi kertas, terutama pada cara melakukannya. Perbedaan nyata terlihat pada
media pemisahannya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben halus yang tersangga
pada papan kaca, aluminium atau plastic sebagai pengganti kertas. Lapisan tipis
adsorben ini pada pross pemisahan berlaku sebagai fasa diam.
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran
menjadi komponen-komponennya, misalnya senyawa Flavonoida dan isoflavonoida
yang terdapat pada tahu, tempe, bubuk kedelai dan tauco serta Scoparia dulcis,
Lindernia anagalis, dan Torenia violacea. Yang pada senyawa isoflavon memiliki
banyak manfaat. Beberapa kelebihan senyawa isoflavon yang potensial bagi
kesehatan manusia, di antaranya adalah sebagai antioksidan, antitumor / antikanker,
antikolesterol, antivirus, antialergi, dan dapat mencegah osteoporosis. Dan semua
kromatografi bekerja berdasarkan metode kromatografi.Kromatografi juga
merupakan pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan
mengetahui kuantitasnya. Untuk itu, kemurnian bahan atau komposisi campuran
dengan kandungan yang berbeda dapat dianalisis dengan benar. Tidak hanya kontrol
kualitas, analisis bahan makanan dan lingkungan, tetapi juga kontrol dan optimasi
reaksi kimia dan proses berdasarkan penentuan analitik dari kuantitas material.
Teknologi yang penting untuk analisis dan pemisahan preparatif pada campuran
bahan adalah prinsip dasar kromatografi.Pemisahan senyawa biasanya menggunakan
beberapa tekhnik kromatografi.

Analisis Instrumentasi Page 1

 Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan
senyawa yang akan dipisahkan.Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa
teknik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada
sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Semua kromatografi memiliki fase
diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa
cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-
komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis
tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serap masing-masing
komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fase diam (penyerap) dengan
membandingkannya dengan standar yang sangat memakan waktu dan harus
dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini untuk mendapatkan
resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda,
meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama.

B. Rumusan Masalah
Rumusan masalah dalam makalah ini antara lain:

1. Apa pengertian kromatografi lapis tipis?

2. Bagaimana prinsip kerja kromatografi lapis tipis?

3. Bagaimana prosedur kerja pada pemisahan sampel menggunakan kromatografi

lapis tipis?

4. Apa saja fase diam dan fase gerak dalam kromatografi lapis tipis?

5.  Apa saja kelebihan dari kromatografi lapis tipis?

6. Bagaimana aplikasi kromatografi lapis tipis dalam dunia farmasi?

Analisis Instrumentasi Page 2

C. Tujuan
Ada beberapa tujuan yang telah disimpulkan yaitu:
1. Dapat mengetahui pengertian kromatografi lapis tipis.

2. Dapat mengetahui bagaimana prinsip kerja kromatografi lapis tipis.

3. Dapat mengetahui bagaimana prosedur kerja pada pemisahan sampel

menggunakan kromatografi lapis tipis.

4. Dapat mengetahui apa saja fase diam dan fase gerak dalam kromatografi lapis

tipis.

5.  Dapat mengetahui apa saja kelebihan dari kromatografi lapis tipis?

6. Dapat mengetahui bagaimana aplikasi kromatografi lapis tipis dalam dunia

farmasi?

D. Manfaat Penulisan

Adapun manfaat dari makalah ini adalah sebagai berikut : manfaat dari penulisan

makalah ini adalah mahasiswa dapat memahami mengenai kromatografi lapis tipis

sehingga dapat mengaplikasikannya.

Analisis Instrumentasi Page 3

 BAB II

PEMBAHASAN

A. Pengertian kromatografi

Pemberian terperinsi kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael

Tsweet, seorang botani Rusia yang bekerja di Warsawa. Pada tahun 1906 dia
mengumumkan pemerian pemisahan klorofil dan pigmen lainnya dalam suatu sari
tanaman dengan menggunakan alat. Larutan eter protelium yang mengandung
cuplikan diletakkan pada ujung atas tabung gelas sempit yang telah diidi dengan
serbuk kalsium karbonat. Ketika kedalam kolom itu dituangi eter proteleum maka
akan terlihat bahwa pigmen-pigmen itu terpisah dalam beberapa daerah. Setiap
daerah berwarna diisolasi dan diindentifikasi senyawa penyusunnya. Adanya pita
berwarna itu maka dia mengusulkan nama “kromatografi” yang berasal dari bahasa
Yunani “kromatos” yang berarti warna dan “graphos” yang berarti menulis (Sudjadi,
1988).

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang

akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk
lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan
cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner (Underwood, 1983).

Analisis Instrumentasi Page 4

B. Pengertian kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapisan tipis adalah (TLC) merupakan teknik pemisahan yang

menggunakan lembaran tipis aluminium oksida, gel silika, selulosa atau suatu bahan
lain yang didukung oleh suatu lembaran logam atau suatu polimer.

Pengertian dari Kromatografi adalah cara pemisahan zat berkhasiat dan zat
yang lain yang ada dalam bahan atau sediaan dengan jalan penyarian
berfraksi,  penyerapan atau penukaran ion pada zat berpori, menggunakan cairan atau
gas yang mengalir. Zat yang diperoleh dapat digunakan untuk uji identifikasi atau
penetapan kadar.

Kromatografi lapis tipis  (KLT) adalah suatu metode analisis yang digunakan

untuk memisahkan suatu campuran senyawa secara cepat dan sederhana. Prinsipnya
didasarkan atas partisi dan adsorpsi. Zat penjerap merupakan fase stasioner, berupa
bubuk halus dibuat serba rata dan tipis diatas lempeng kaca. Fase diam yang umum
digunakan adalah silika gel, baik yang normal fase maupun reversed fase.

Suatu metode pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip partisi dan

adsorpsi antara fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen), komponen kimia
bergerak naik mengikuti cairan pengembang karena daya serap adsorben (silika gel)
terhadap komponen-komponen kimia tidak sama sehingga komponen dapat bergerak
dengan kecepatan yang berbeda-beda berdasarkan tingkat kepolarannya dan hal inilah
yang menyebabkan terjadinya pemisahan.

Mekanisme panampakan noda pada UV yaitu suatu molekul yang

mengabsorbsi cahaya ultraviolet akan mencapai suatu keadaan tereksitasi dan
kemudian memancarkan cahaya ultraviolet atau cahaya tampak pada waktu kembali
ke  tingkat dasar (emisi), emisi inilah yang digambarkan sebagai fluoresensi.

Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor

retensi, Rf :

Analisis Instrumentasi Page 5

 jarak yang ditempu h senyawaterlarut
Rf =
jarak yang ditempu h pelarut

Jarak yang telah ditempuh pelarut dapat diukur dengan mudah dan jarak
tempuh cuplikan diukur pada pusat bercak itu, atau pada titik kerapatan maksiumum.
Definisi koefisien distribusi K adalah perbandingan dingin kadar senyawa terlarut
dalam fasa gerak CM dan kadar senyawa terlarut dalam fasa diam Cs,

CS
K
CM

Ada hubungan sederhana antara harga K dan Rf. Jarak tempuh rata-rata
molekul terlarut berbanding langsung dengan kecepatan alir pelarut dikalikan dengan
fraksi waktu senyawa terlarut terdapat dalam fasa gerak. Kemudian dapat dinyatakan
sebagai jumlah molekul dalam setiap fasa, atau sebagai distribusi senyawa terlarut
dalam dua fasa :

jumla h mol senyawa terlarut dalam fasa gerak

Rf =
Mol total senyawaterlarut dalam dua fasa

CM AM

CM AM  CS AS

Dimana AM dan AS, adalah luas penampang melihat dua fasa itu (tegak lurus
lempeng). Penjabaran lebih lanjut persamaan di atas, diperoleh

AM AM
Rf  
AM  AS CS CM AM  KAS

Luas penampang melintang sukar diukur, oleh karena itu persamaan di atas
kurang praktis, tetapi dapat menunjukan bahwa harga Rf adalah bentuk modifikasi
dari tetapan keseimbangan. Karnanya harga Rf dapat diharapkan tergantung pada
parameter sama seperti pada metode kromatografi kolom. Harga R f juga merupakan

Analisis Instrumentasi Page 6

subyek terhadap beberapa pengaruh, seperti macam penyerapan, ketebalan, metode
arah pengembangan, kadar dan jumlah cuplikan, dan juga jarak yang ditempuh
bercak. Dengan seperti diatas, lebih mudah dan lebih tepat menggunakan harga Rf
relatif atau Rstandar, dimana suatu senyawa standar ditambahkan pada cuplikan. Harga
Rstd adalah angka banding jarak tempuh dua bercak itu dalam waktu pengembangan
yang sama.

Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan

kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara

permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan

diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini

dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta

kepolaran dan ukuran molekul.

Pada kromatografi lapis tipis, eluent adalah fase gerak yang berperan

penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam

(adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan

terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen

secara  kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah

umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya

pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang

banyak digunakan adalah jenis  adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika.

Analisis Instrumentasi Page 7

 Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak

polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara

senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak

tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like”.

2.3.Pelaksanaan kromatografi Kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika

atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik

yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk

kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat

berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau

campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna

yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi

pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning

 Kromatogram

Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna

yang merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.

Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis:Sebuah garis menggunakan pinsil

digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran

pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di

lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan

Analisis Instrumentasi Page 8

 menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya

kromatogramdibentuk.Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan

ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah

yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di

bawah garis dimana posisi bercak berada.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi

dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan

kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring

yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap

mencegahpenguapanpelarut.Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan,

komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak

pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak

warna.

 Perhitungan nilai Rf

perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh

dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang

muncul.Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut

dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing.

Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari

gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum

mengalami proses penguapan.Pengukuran berlangsung sebagai berikut:

Analisis Instrumentasi Page 9

 Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:Rf=jarak

yang ditempuh oleh komponenjarak yang ditempuh oleh pelarut.

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatrografi lapis

tipis yang juga mempengaruhi harga Rf :

 Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan

 Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya. 

Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan

mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari

penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar

terhadap harga  Rf meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang

sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama,   jika

menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap  dan jika pengikat

(kalau ada) dicampur hingga homogen.

 Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu

diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran

pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.

 Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.

Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam

kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut

digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.

Analisis Instrumentasi Page 10

 Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.

 Teknik percobaan.

Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya

diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran

penurunan dan mendatar juga digunakan

 Jumlah cuplikan yang digunakan.

Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil

penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak

kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan

pada harga-harga Rf.

 Suhu.

Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama

untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang

disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase

 Kesetimbangan.

Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam

kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana

jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak

jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi

pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase

bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi  dan keadaan ini harus dicegah.

Analisis Instrumentasi Page 11

 digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan

pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian

tepi-tepi  dan keadaan ini harus dicegah.

Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau

kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase

gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang

terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada

laju yang berbeda.Sedangkan fase diam untuk kromatografi lapis tipis

seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour

dalam sinar ultra violet. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada

kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika

dilihat dengan mata. Namun, apabila di sinarkan dengan sinar UV pada

lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi

bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.Sementara

UV tetap di sinarkan pada lempengan, harus dilakukan penandaan posisi-

posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah

bercak-bercak itu. Ketika sinar UV dimatikan, bercak-bercak tidak tampak

kembali.

Prinsip pemisahan noda adalah berdasarkan kepolarannya sehingga

menghasilkan kecepatan yang berbeda-beda saat terpartisi dan terjadilah

pemisahan.Untuk memisahkan noda dengan sebaik-baiknya maka digunakan

kombinasi eluen non polar dengan polar. Apabila noda yang diperoleh terlalu

Analisis Instrumentasi Page 12

 tinggi, maka kecepatannya dapat dikurangi dengan mengurangi kepolaran.

Namun apabila nodanya lambat bergerak atau hanya ditempat, maka

kepolaran dapat ditambah.

 Mengidentifikasi senyawa-senyawa

Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawa

Caranya : Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis

tipis dan bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah

diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi.

Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang sesuai

dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan

asam amino yang telah diketahui ditandai 1-5.Bagian kiri gambar

menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir mencapai bagian atas dari

lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan

apa yang terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.Tidak diperlukan

menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat membandingkan

bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah

diketahui melalui posisi dan warnanya.

Kromatografi Lapis Tipis Pada Substansi Tidak Berwarna

a. Menggunakan pendarflourfase

diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi

yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour

ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika menyinarkannya

Analisis Instrumentasi Page 13

 dengan sinar UV, akan berpendar.Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana

bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak

tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa menyinarkan

sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda

dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang

gelap.Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, dan tandai posisi-

posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari

daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-

bercak tersebut tidak tampak kembali.

b. Menggunakan bercak secara kimia

Untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan

mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang

berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan

dari campuran asam amino.Kromatogram dapat dikeringkan dan

disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam

amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau

ungu.Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan

kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan

tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada

kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada

Analisis Instrumentasi Page 14

 lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak

kecoklatan.

2.4.Hal-Hal Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

 Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan terlebih dahulu agar pada

proses elusi lempeng silica gel dapat menyerap dan berikatan dengan sampel.

Pengaktifan lempeng dilakukan dalam oven pada suhu 1100C selama 30

menit.

 Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air atau gas lain yang

mengisi fase penjerap yang akan menghalangi laju eluen.

  Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu pekat sebab

pemisahannya akan sulit sehingga didapat noda berekor.

 Penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda yang baik.

  Eluen yang digunakan harus murni sehingga tidak menghasilkan noda lain.

Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :

 Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat

 Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa

 . Lempeng yang tidak rata

Analisis Instrumentasi Page 15

2.5.Prosedur Kerja Pemisahan dengan KLT

Gel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon

dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada

permukaan gel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.

           Permukaan gel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk

ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai di sekitarnya, sebagaimana

halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.

Pada kromatografi lapis tipis, fase diam berupa plat yang biasanya disi dengansilica

gel. Sebuah garis pensil di gambar dekat bagian bawah fase diam dan setetes larutan

campuran ditempatkan di atasnya. Garis pada fase diam berguna untuk menunjukkan

posisi asli campuran.  Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua

ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai

kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri

dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak dengan posisi fase gerak di bawah

garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh

dengan uap pelarut.

. CARA KERJA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

a. Fase diam-jel silika

Analisis Instrumentasi Page 16

Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh

atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika,

atom silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada permukaan jel silika terdapat

ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan

silika.

Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan

hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya

gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.. Fase diam lainnya yang biasa digunakan

adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki

gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa

untuk alumina.

b. Senyawa-senyawa pemisah dari Kromatogram

Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan

senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-

senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya

pergerakan pelarut.

Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan,

tergantung pada:

• Kelarutan senyawa dalam pelarut. Tergantung pada besar atraksi antara molekul-

molekul senyawa dengan pelarut.

Analisis Instrumentasi Page 17

• Senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Tergantung pada bagaimana

besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.

Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih

kuat dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der

Waals yang lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari

senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu

substansi pada permukaan.

Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut

dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi

antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan

hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik

pada larutan keluar dari permukaan silika.

Penyerapan pada kromatografi lapis tipisbersifat tidak permanen, terdapat pergerakan

yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang

kembali pada larutan dalam pelarut.

Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu

terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu

proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa

semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas

lempengan.

Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan

baik ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat

Analisis Instrumentasi Page 18

membantu dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.

2.4. Fase Diam dan Fase Gerak KLT

Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase

yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran

sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang

mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah

larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase

diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa

cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-

komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda

bergerak pada laju yang berbeda.

Fase Diam

Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika gel atau

alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras.

Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis

tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam

sinar ultra violet. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium

oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH.

Analisis Instrumentasi Page 19

Fase Gerak

Dalam kromatografi, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses

elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi

antara adsorbentdengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen.

Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau

campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan

adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal

sebagai deret eluotropik pelarut.

Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif

tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika).

Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada:

        Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, Hal ini bergantung pada

bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

        Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya gel silika. Hal ini

tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan gel silica

2.6. Aplikasi Metode KLT Dalam Bidang Farmasi

            Contoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis

(KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein

dalam sediaan obat paten seperti poldanmig yang beredar di pasaran apakah

Analisis Instrumentasi Page 20

memenuhi persyaratan mutu obat atau tidak. Sehingga dengan kadar yang tepat obat

dapat memberikan efek terapi yang dikehendaki.

            Setiap komponen memiliki harga Rf sendiri-sendiri, dengan bantuan dari sinar

ultraviolet maka dapat ditentukan noda yang tidak tampak oleh kasat mata. Cara yang

biasa dilakukan dengan menyemprotkan KMNO4 dalam H2SO4 yang kemudian akan

berinteraksi dengan komponen-komponen sampel baik secara kimia maupun

berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna tertentu.

            Noda kemudian dihitung harga Rf-nya. Harga Rf dihitung dengan

menggunakan perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang ditempuh

fase gerak. Nilai maksimum Rf adalah 1 dan nilai minimumnya 0. Dengan

menggunakan silika gel sebagai fase diam, harga Rf 1 menunjukkan jika senyawa

tersebut sangat nonpolar sedangkan harga Rf 0 menunjukkan bahwa senyawa tersebut

sangat polar.

Adapun manfaat dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yaitu :

1.     Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.

2.    Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.

3.    Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.

4.    Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif campuran senyawa obat.

Analisis Instrumentasi Page 21

Keburukan dari teknik ini mungkin hanya pada prosedur pembuatan lempengnya yang

memerlukan tambahan waktu, kecuali bila telah tersedia lempeng yang diproduksi secara

komersial.

Analisis Instrumentasi Page 22

C. Fasa diam
Pada semua prosedur kromatografi, kondisi optimum untuk suatu pemisahan
merupakan hasil kecocokan antara fasa diam dan fasa gerak. Pada umumnya sebagai
fasa diam digunakan silika gel. Fasa diam dapat dikelompokkan berdasarkan
beberapa hal, misalnya berdasarkan sifat kimianya, dapat dikelompokkan dalam
senyawa organik dan anorganik. Jika dilihat mekanisme pemisahan, fasa diam
dikelompokkan :

a. Kromatografi serapan (Silika gel, alumina, keiselguhr)

b. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, silika gel)
c. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina penukar ion)
d. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel)
Ada bebrapa fasa diam yang sukar dikelompokkan, misalnya poliamida,
plimer organik berpori seperti porapak.

 Silika gel merupakan fasa diam yang paling sering digunakan untuk KLT.
Silika gel mempunyai ukuran 10–40 µ. Sedangkan proses serapan terutama
bervariasi dari 20-150 Å. Silika gel berpori 80-150 dinamakan berpori besar.
Luas permukaan silika gel bervariasi dari 300 – 1000 m 2/g. Pada kelembapan
45 -75 % dapat mengikat air 7 – 20%.
 Alumina merupakan fasa diam yang paling banyak digunakan setelah silika
gel. Alumina untuk KLT bersifat sedikit basa (pH 9), di samping itu juga ada
alumina netral (pH 7) dan alumina asam (pH 4). Dalam banyak hal digunkaan
CaSO4 sebagai pengikat.
 Keiselguhr merupakan penyerap dengan aktivitas rendah. Tidak banyak
digunakan dalam KLT. Penggunaan utama sebagai padatan pendukung untuk
fasa diam dalam kromatografi partisi.

Analisis Instrumentasi Page 23

  Selulosa memiliki panjang serat bervariasi dari 2-20 µ. Serat pendek
menyebabkan difusi rendah selama pengembangan dan menghasilkan noda
lebih kecil. Pada KLT selulosa digunakan untuk pemisahan senyawa hidrofil.

D. Fasa gerak
Jika sebagai fasa gerak digunakan sistem pelarut campuran, pada lapisan fasa
diam susunan pelarut itu dapat mengalami perubahan sedikit demi sedikit. Hal ini
akan menghasilkan kedpat-ulangan agak jelek. Oleh karenanya sistem dua pelarut
lebih disenangi.

Air n-Amil alkohol

Formamida
Etil asetat
Metanol
Asam asetat Eter
Etanol
n-Butil asetat
Isopropanol
Aseton Kloroform

n-Propanol Benzena

tert-Butanol Toluena

Fenol Sikloheksana

n-Butanol Eter protelium

Proteleum

Minyak parafin

Analisis Instrumentasi Page 24

 Penyusunan sistem pelarut dapat dipilih sesuai dengan kemampuannya
membentuk ikatan hidrogen dalam satu seri dari hidrofil sampai ke hidrofob.
Kombinasi pelarut yang mempunyai sifat berbeda memungkinkan didapatkannya
sistem pelarut yang cocok.

Pada sistem partisi air sebagai fasa diam, terikat oleh pendukung, dan fasa
geraknya digunakan yang tidak bercampur dengan air. Sistem ini biasanya dibuat
dengan mencampur air dengan pelarut organik dalam corong pisah. Setelah kedua
fasa itu terpisah keduanya digunakan untuk penjenuhan bejana pengembangan dan
fasa organik bertindak sebagai fasa gerak.

E. Metodologi
a. Pembuatan lempeng
Ukuran lempeng gelas yang biasa digunakan 20 x 20, 20 x 10 dan 20 x 5
cm. Sebelum dilapisi lempeng kaca ini dibersihkan dengan air dan deterjen,
kemudian dikeringkan. Cuci lagi dengan aseton dan permukaan kaca yang
bersih jangan samapi tersentuh.
30 gram silika gel atau penyerap lain dibuat bubur dengan sejumlah air atau
pelarut lain, dan segera dipindahkan dalam alat perata. Ratakan bubur itu untuk
4-5 lempeng (20x20 cm) dalam waktu 4 menit jika digunakan bahwa pengikat
dalam bubur penyerap itu dapat juga ditambahkan dapar untuk membuat
keasaamn tertentu atau kandungan air pada lapisan fasa diam. Pindahkan
lempeng itu dengan hati-hati pada rak dan setelah 30 menit keringkan pada 100-
120o selama 1 jam untuk mengaktifkan fasa diam. Dinginkan dan simpan
lempeng itu dalam desikator. Tebal lapisan fasa diam biasanya 0,25 mm,
sedangkan untuk pemisahan preparatif digunakan tebal 0,5-2,0 mm.
Perbandingan bahan dan pelarut untuk pembuatan lempeng

Nama Perbandingan bahan

Analisis Instrumentasi Page 25

 dan air

Silika gel 1 : 1,5

Silika gel G atau GF 1:2
Alumina 1 : 1,1
Alumina oksida G 1:2
Serbuk selulosa MN 300 1:5
Serbuk selulosa MN 300G 1:6
Keiselguhr G 1:2
Serbuk poliamida 1:9

b. Pentolan cuplikan
Pada lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20 cm, 10 x 20 cm, 5 x 20 cm,
tebal 0,2 mm) cuplikan biasanya di totolkan sebagai bercak bulat atau garis,
1,5-2,0ncm dari tepi bawah. Bercak sebaiknya berukuran sama dan mempunyai
diameter 3-6 mm.
Pentotolan dapat dilakukan dengan mikropipet atau dengan “microsyringe”,
biasanya diperlukan 1-20 ul. Volume lebih besar dari itu dapat ditotolkan
terhadap dalam bagian-bagian kecil dengan pengeringan di antara penotolan itu.
Kelebihan beban menyebabkan bercak asimetri dan peruabahan harga R f, yang
dapat dihindari jika cuplikan kurang dari 10-20 µg.
Pada lempeng kromatografi lapis tipis efesiensi tinggi (KLTET) (biasanya
10x10 cm atau 10x20 cm) hanya diperlukan dalam nano sampai samapai
pikogram setiap bercak. Diameternya tidak harus lebih 1-1,5 mm dan volume
cuplikan tidak lebih 0,2 ul. Diperlukan tehnik penotolan khusus, yaitu dengan
syringe 1 µl yang dihubungkan dengan sekrup mikrometer, atau dengan sebuah
kapiler platina iridium dalam aplikator otomatis.
c. Pengembangan kromatogram

Analisis Instrumentasi Page 26

 Kromatogram biasanya dikembangkan dengan tehnik naik linier dengan
menggunakan bejana pengembang gelas atau logam. Pada bejana itu diberi
kertas saring dan fasa gerak sampai kedalaman 0,5 cm. Supaya kedapat-ulangya
baik, jarak antar permukaan fasa gerak dan garis batas harus sama (1-2 cm).
Harga Rf sering tidak sama karena perbedaan kejenuhan.
Pengembangan menurun atau horisontal dapat dapat digunakan dalam
beberapa kasus, yaitu pada lapisan tebal atau dengan fasa gerak kental. Fasa
gerak dialirkan pada lapisan melalui kertas saring. Pengembangan horisontal
biasanya digunakan pada KLTET. Untuk memperbaiki pemisahan dapat
dilakukan tehnik
- Pengembangan berkelanjutan. Fasa gerak dialirkan pada bagian atas dari
lempeng pengembangan horisontal dan dihisap oleh fasa diam. Tehnik ini
terutama dilakukan untuk senyawa yang mempunyai harga R f 0,05-0,2
setelah pengembangan pertama.
- Pengembangan dua dimesi. Cuplikan di totolkan pada lempeng 3-4 cm dari
salah satu pojok dan dikembangkan seperti biasanya. Lempeng kemudian
diputar 90o sehingga pita pemisahan dari hasil pengembangan pertama
terletak pada bagian bawah lempeng, dan kemudian dilakukan
pengembangan kedua. Fasa gerak harus diganti sehingga diperoleh
pengaruh pemisahan berbeda pada arah kedua. Tehnik ini berguna untuk
cuplikan yang mengandung banyak senyawa penyusun.
- Pengembangan sirkuler. Pada kromatografi sirkuler fasa gerak dialirkan
dengan sebuah sumbu atau pompa melalui pipa kapiler ditengah lapisan
fasa diam.senyawa terlarut bergerak cepat dari tengah penotolan
menghasilkan lingkaran-lingkaran sempit.
- Pengembangan beberapa kali. Fasa gerak biasanya mudah menguap dapat
diuapkan setelah pengembangan dan lempeng itu dapat dikembangkan lagi
dengan fasa gerak sama atau fasa gerak lain. Tehnik ini dinamakan

Analisis Instrumentasi Page 27

 pengembangan beberapa kali. Bercak cuplikan berbentuk bulat telur
dengan aksisi pendek kepada arah fasa gerak bergerak.
d. Metode identifikasi
Untuk melihat senyawa tak berwarna pada lempeng, biasanya digunakan
metode sebagai berikut:
1. Melihat kromatogram dibawah sinar ultraviolet (245 atau 366 nm)
a. Pada lapisan berfluoresensi, misalnya silica gel GF245, bercak
muncul sebagai noda hitam.
b. Untuk senyawa berfluoresensi digunakan lapisan biasa, bercak
terlihat berfluoresensi.
2. Menyemprot dengan pereaksi yang menghasilkan warna dan atau
berfluoresensi.
Metode yang sering digunakan adalah deteksi asam sulfat. Reaksi ini
dapat terbentuk dalam keadaan dingin atau dengan pemanasan lempeng
pada 100-200o. Cara ini tidak dapat digunakan pada fasa diam organik
atau dimana sebagai pengikat digunakan pati. Pereaksi lain yang banyak
digunakan adalah uap yodium.
Data batas deteksi yang tertera dalam buku sering sukar dicapai
karena jumlah terkecil suatu senyawa yang masih dapat diamati
tergantung pada harga Rf-nya.
e. KLT preparative
Pemisahan preparatif sering dilakukan pada lapisan yang agak tebal
(0,5-2,0 mm). Cuplikan ditotolkan sebagai garis sempit dengan alat yang
sesuai. Ukuran maksimum cuplikan tergantung pada jumlah relatif
senyawa penyusun, perbedaan Rf-nya dan lebar lempeng. Jika selisih
harga Rf lebih besar dari 0,2 dapat ditotolkan 50-100 mg cuplikan pada
lempeng 20 cm.

F. Analisis kuantitatif

Analisis Instrumentasi Page 28

 Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan KLT biasanya
dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng KLT (insitu). Alat ini dapat
bekerja secara serapan atau fluoresensi. Kebanyakan densitometer mempunyai
sumber cahaya, monokromator untuk memilih panjang gelombang yang cocok,
sistem untuk memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda foton dan rekorder.

Pada sistem serapan dapat dilakukan dengan model pantulan atau transmisi.
Cairan transmisi dilakukan dengan menyinari bercak dari satu sisi dan mengukur
sinar yang diteruskan pada sisi lain. Pada kenyataannya hanya sinar tampak yang
dapat digunakan untuk metode ini. Pada cara pantulan, yang diukur sinar pantulan.
Gangguan utama pada sistem serapan adalah fluktuasi latar belakang yang dapat
dikurangi dengan beberapa cara , misalkan dengan menggunakan alat berkas ganda,
sitem transmisi dan pantulan secara bersamaan atau sistem dua panjang gelombang.
Pada cara pantulan dapat digunakan sinar tampak maupun ultraviolet.

Kurva baku dibuat setiap lempeng dan kadar senyawa dihitung seperti pada
metode spektofotometri. Ketelitian penetapan termaksud penolakan cuplikan,
pengembangan kromatogram dan pengukuran, 2-5 %.

Sistem fluoresensi biasanya lebih disenangi jika senyawa itu dapat dibuat
berfluoresensi. Batas deteksi sistem ini lebih rendah dan kelinieran respon dan
selektifitasnya lebih tinggi. Gangguan fluktuasi latar belakang juga lebih rendah.

Bercak yang diukur dengan sistem fluoresensi, serapan ultraviolet atau sinar
tampak dapat ditetapkan lebih teliti daripada bercak yang disemprot dengan pereaksi
warna. Faktor keseragaman pada penyemprotan merupakan hal yang sangat
menentukan.

Pengambilan senyawa dari fasa diam biasanya digunakan tabung Craig dengan
cara penyarian. Hal ini snagat berguna terutama untuk KLT preparatif karena

Analisis Instrumentasi Page 29

senyawa yang dipisahkan membentuk suatu pisah dan jumlah serbuk yang agak
banyak ini diambil dengan penyedotan.

Cara lain, bercak dikerok dan disinari dengan pelarut polar misalnya etanol.
Untuk menghindari kontaminasi minyak dan serabut pada penyaringan fasa diam
digunakan penyaring kaca masir. Karena jumlah yang disarig kecil, semua alat harus
benar-benar bersih. Kemudian dilanjutkan pengukuran secara spektofotometri. Cara
ini memerlukan waktu cukup lama, lagi pula kepekaanya tidak setinggi densitometri.

G. Penggunaan
KLT biasaya merupakan metode pilihan pertama jika seseorang ingin
memisahkan suatu campuran. Hal ini disebabkan metode ini sederhana dan cepat.
Berikut ini contoh penggunaan KLT pada pemisahan alkaloida kinina, kinidina,
sinkonina dan sinkonidina dalam kulit kina.
a. larutan cuplikan
0,1 gram serbuk kulit kina dibahasi dengan 2 tetes amonia 25 % f dan
dikocok dengan 5 ml kloroform selama 10 menit. Saring dan uapkan filtrat
samapi kering. Larutan dalam 1,0 ml metanol, totolkan 5 -10 ul larutan ini 2 cm
dari tepi bawah.
b. fasa diam
Silika gel GF254 atau lempen jadi silika gel F254 20x20 cm.
c. fasa gerak
Ada beberapa sistem fasa gerak yang telah banyak digunakan untuk
pemisahan alkalida utama kulit kina

No Sistem fasa gerak

Analisis Instrumentasi Page 30

 S1 Kloroform-dietilamina (9:1)
S3 Kloroform-aseton-dietilamina (5:4:1)
S6 Kloroform-etilasetat-isopropanol-dietilamina (20:70:4:6)
S9 Minyak tanah-aseton-dietilmina (23:9:9)
S14 Toluena-dietil-eter-dietilamina (20:12:5)

Kromatogram dikembangkan dalam bejana kromatografi, pada dinding

dalam ditaruh kertas saring. Bejana ini dijenuhi dengan fasa gerak selama 30
menit. Lempeng dielusi dengan jarak 10 cm.

d. Deteksi
Pertama panaskan lempeng KLT pada 100° selama 10 menit untuk
menghilangkan amina.
Deteksi alkaloida utama kina

Pereaksi Kepekaan Warna bercak Warna latar belakang

Penyinaran pada 254 0,1 Biru -
nm
Fluoresensi 366 nm 0,01 Biru -
(asam sulfat -
metanol)
Uap yod 0,1 Coklat Kuning
Yod dalam metanol 0,1 Coklat Kuning
Iodoplatinat 0,01-0,1 Violet, biru violet

e. Analisis kuantitatif
Bercak pada KLT dapat disari dengan kloroform, etanol mutlak, asam
klorida 0,1 N, atau asam sulfat 0,1 N, kemudian dilanjutkan pengukuran secara
fluorimetri atau spektofotometri. Pada fluorimetri digunakan juga gelombang

Analisis Instrumentasi Page 31

 eksitasi 350 nm dan emisi diukur pada 450 nm untuk kinidina dan 455 nm untuk
kinina dalam asam encer. Pada spektofotometri kinina diukur pada panjang
gelombang 332 nm, 324 nm dan 366 nm sedangkan sinkonia pada 316 nm.

Pada fluorimetri dengan desitometer, lempeng KLT disemprot dengan asam

sulfat dalam metanol lebih dulu. Untuk kinina panjang gelombang eksitasi 361 nm
atau 345 nm dan emisi pada 438 nm dan 430 nm. Panjang gelombang eksitasi
kinidina 335 nm atau 365 nm dengan emisi 455 nm atau 430 nm. Sinkinina dan
sikkinidina dapat ditetapkan tanpa terganggu kinina dan kinidina jika dieksitasi
pada 313 nm dan emisi diukur pada 390 nm. Batas deteksi cair ini 1 ng.

Penetapan densitometri secara serapan dapat juga dilakukan setelah lempeng

KLT disemprotkan asam sulfat-etanol. Serapan maksimum kinina dan kinidina
pada 330 nm sedangkan sinkonina dan sinkonidina pada 288 nm, dengan batas
deteksi 100 ng.

BAB III

Analisis Instrumentasi Page 32

 PENUTUP

A. Kesimpulan
 Kromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan

campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam

medium tertentu. Kromatografi lapis tipis merupakan salah

satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan

memisahkan komponen-komponen sampelberdasarkan perbedaan kepolaran

 Prinsip kerja kromatografi lapis tipis adalah terjadinya hubungan

kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara

permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan

diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Semakin dekat

kepolaran antara senyawa dengan eluent maka senyawa akan semakin terbawa

oleh fase gerak tersebut, sesuai dengan prinsip “like dissolve like”.

 Pada prosedur pengerjaannya Pelarut (fase gerak) perlahan-lahan bergerak

naik, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada

tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang

berbeda.Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara

dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak.Identifikasi pemisahan

komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan

radiasi menggunakan sinar ultraviolet, Dapat untuk memisahkan senyawa

hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa, dan

masih banyak lagi keuntungan lainnya.

Analisis Instrumentasi Page 33

   Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya

senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti poldanmig.

3.2 Saran

Diharapkan agar seluruh praktikan mematuhi tata tertib yang telah

ditentukan dan selalu menerapkan kedisiplinan dalam melakukan pengamatan

agar hasil dapat sesuai dengan yang diharapkan

DAFTAR PUSTAKA

Analisis Instrumentasi Page 34

Anggraeni,Megawatt.2009. KromatografiLapisTipis.

[online].Tersedia:http://greenhati.blogspot.com/2009/01/kromatografi-lapis-

tipis.html. diakses tanggal 21 april 2012.

Baharuddin, Hamzah. dkk. 2017. Pemisahan Kimia Analitik. Palu: Program Studi

Pendidikan Kimia, FKIP, Universitas Tadulako.

Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi

Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.

Lipsy, P. 2010. Thin Layer Chromatography Characterization of the Active

Ingredients in Excedrin and Anacin. USA: Departement of Chemistry and

Chemical Biology, Stevens Institute of Technology.

Kantasubrata, Julia. 1993. Warta Kimia Analitik Edisi Juli 1993. Situs Web Resmi

Kimia Analitik : Pusat Penelitian Kimia LIPI

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi.

Bandung: Penerbit ITB.

Sudarmadji, S., dkk, 2007. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta:

Penerbit Liberty:

Analisis Instrumentasi Page 35

Analisis Instrumentasi Page 36