LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS FARMASI DASAR

KROMATOGRAFI II
(KROMATOGRAFI KOLOM DAN KAPILARITAS)

Responser: Baitha Palanggatan Maggadani, M.Farm., Apt.

Disusun oleh:
1. Khairunisa R ( 1706034514 )
2. Reza Fadillah Achmad ( 1706027710 )
3. Sarah Aminah Kherid ( 1706026020 )
4. Shabrina Assafrina ( 1706027811 )
5. Siska Silvany ( 1706034382 )

LABORATORIUM KIMIA FARMASI – ANALISIS FARMASI

DASAR
PRODI SARJANA FARMASI
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS INDONESIA
2018
 DAFTAR ISI
LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS FARMASI DASAR .................................................
DAFTAR ISI .............................................................................................................................i
BAB I ......................................................................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ......................................................................................................... 1

1.2 Tujuan Praktikum ................................................................................................... 1
BAB II ....................................................................................................................................... 2

2.1 Prinsip Kromatografi .............................................................................................. 2

2.2 Prinsip Kromatografi Kolom .................................................................................. 2
BAB III ...................................................................................................................................... 4

3.1 Alat dan Bahan ......................................................................................................... 4

3.1.1 Alat .................................................................................................................... 4
3.1.2 Bahan ................................................................................................................ 4
3.2 Cara Kerja ................................................................................................................ 4
BAB IV ...................................................................................................................................... 6

4.1 Hasil Pengamatan .................................................................................................... 6

4.2 Pembahasan .............................................................................................................. 7
BAB V ..................................................................................................................................... 10

5. 1 Kesimpulan ............................................................................................................. 10
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 11
LAMPIRAN ................................................................................................................. 1

i
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam bidang farmasi, analisis suatu senyawa kimia menjadi sangat penting.
Analisis berfungsi untuk menyelidiki senyawa kimia dan penyusunnya dalam obat.
Dalam metode analisis dikenal istilah analisis kromatografi. Analisis kromatografi
digunkanan untuk memisahkan dan mengidentifikasi suatu senyawa. Pemisahan
dengan kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling banyak digunakan
karena data dari proses ini dapat digunakan untuk penentuan kadar, terutama
kromatografi dengan instrumen
Kromatografi merupakan metode analisis fisika-kimia untuk memisahkan
komponen dalam sampel (analit) dimana komponen tersebut didistribusikan ke
sistem dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Kromatografi terdiri dari beberapa
jenis, yaitu kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom,
kromatografi gas, dan kromatografi cair kinerja tinggi. Pemilihan kromatografi
didasarkan pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan.
Pada praktikum kali ini kami akan membahas cara pemisahan zat warna dengan
metode kromatografi kolom. Diharapkan dengan dilakukan percobaan ini
pemisahan zat warna dapat terjadi dengan baik dan pemahaman kami terhadap
konsep kromatografi khususnya kromatografi kolom menjadi lebih baik.

1.2 Tujuan
a. Mengetahui prinsip kerja kromatografi kolom
b. Memisahkan komponen zat warna dalam suatu campuran secara
kromatografi kolom
c. Mengindentifikasi zat warna apa yang terkandung dalam zat uji

1
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Prinsip Kromatografi

Kromatografi adalah prosedur pemisahan zat terlarut yang didasarkan pada
perbedaan distribusi komponen-komponen zat dalam sistem yang terdiri dari dua
fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Faktor yang
memengaruhi pemisahan pada kromatografi adalah karakteristik molekuler terkait
adsorpsi, partisi dan afinitas. Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka
dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase
diamnya zat cair disebut kromatografi pembagian (partition chromatography)

2.2 Prinsip Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan senyawa kimia dari
campurannya. Pada kromatografi kolom, fase diam berupa zat padat atau cair dan
fase geraknya adalah zat cair. Fase diam berada pada kolom yang biasanya terbuat
dari gelas, logam, atau plastik. Pemisahan dilakukan dengan cara mengalirkan fase
gerak diatas sampel dan fase diam sehingga sampel atau analit terbawa oleh fase
gerak dan terpisah di dalam kolom. Proses mengalirkan fase gerak disebut elusi.
Proses elusi tersebut dipengaruhi oleh gaya gravitasi, tekanan hidrostatik dan juga
disedot dari bawah. Komponen yang paling tidak tertahan oleh fase diam akan
keluar lebih dahulu dan diikuti oleh komponen lain. Semuanya ditampung sebagai
fraksi, volume tiap fraksi tergantung besarnya sampel (kolom).
Ada beberapa klasifikasi kromatografi kolom berdasarkan prinsip pemisahan.
Pertama, adsorpsi, didasarkan pada adsorpsi fase diam terhadap sampel. Kedua,
partisi, didasarkan pada perbedaan koefisien partisi sampel pada padatan
pendukung inert. Ketiga, penukar ion, sampel dihambat dengan cara pertukaran
dengan mengganti kedudukan ion-ion pada fase diam. Keempat, eksklusi,

2
didasarkan pada perbedaan ukuran molekul. gel permeable pada kolom
menyebabkan pemisahan pada suatu penyaring berdasarkan ukuran molekul.
Kolom biasanya berbentuk seperti buret untuk titrasi, ukurannya beragam.
Perbandingan panjang kolom sekurang-kurangnya 10 kalinya diameternya,
perbandingan ini tergantung mudah tidaknya komponen dipisahkan. Perbandingan
berat sampel dan fase gerak (1 : 30) biasanya cukup memadai untuk pemisahan
yang mudah, perbandingan dapat ditingkatkan hingga (1:50) untuk komponen yang
susah dipisahkan
Fase diam untuk kromotografi kolom biasanya memiliki ukuran partikel lebih
besar dari ukuran partikel fase diam untuk Kromatografi Lapis Tipis, ukuran yang
digunakan antara 63-250 µm. Ukuran partikel fase diam yang lebih kecil dari fase
geraknya akan mengalir lebih lambat sehingga perlu ditekan atau dihubungkan
dengan pipa hisap. Silika gel (SiO2) adalah fase diam yang banyak digunakan. Pada
pembuatannya silica gel perlu diaktifkan panaskan pada 150-160°C selama 3-4 jam.
Penentuan fase gerak dan fase diam mempengaruhi proses pemisahan.
Pemilihan fase gerak dapat dilakukan melalui dua pendekatan, yaitu dengan
penelusuran literatur dan pemisahan pendahuluan dengan kromatografi lapis tipis
(KLT). Pemilihan fase diam dan fase gerak dalam kromatografi kolom dibagi
menjadi dua tipe, yaitu kromatografi fase normal (normal phase) dan kromatografi
fase terbalik (reverse phase). Pada kormatografi fase normal, fase diam yang
digunakan lebih polar dibanding fase geraknya sedangkan pada kromatografi fase
terbalik, fase diam yang digunakan lebih nonpolar dibanding fase geraknya.
Proses pengepakan kolom dapat melaui dua cara, yaitu dengan metode basah
(wet method) dan metode kering (dry method). Pada metode basah atau wet method,
fase diam dihomogenkan terlebih dahulu dengan fase gerak kemudian dimasukkan
ke dalam kolom. Metode ini sering digunakan untuk pemisahan zat dengan partikel
skalam makro (macroscale separation)

3
 BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
1 Kolom kromatografi
2 Statif dan klep
3 Kawat lentur
4 Corong pisah
5 Lumpang dan alu
6 Peralatan gelas lab (corong, beaker, Erlenmeyer, tabung pereaksi, pipet
tetes, dsb)
7 Stopwatch

3.1.2 Bahan
1 Fase diam (Silica gel)
2 Fase gerak (etanol, aquadest, NaOH)
3 Sampel
4 Kapas
5 Kertas saring

3.2 Cara Kerja

1. Siapkan perangkat kromatografi kolom (harus lurus terhadap statif),
dengan stopcock (kran) yang diberi vaselin terlebih dahulu
2. Masukkan kapas dan kertas saring ke dalam kolom dank ran kolom
ditutup
3. Bersihkan kolom dengan mengalirkan fase gerak
4. Siapkan absorben (silica gel) yang telah dihomogenkan ke dalam
beaker glass, tambahkan fase gerak ke dalam beaker

4
5. Masukkan secara perlahan absorben (sesuai pembagian kelompok)
yang telah diberi fase gerak dengan memakai corong ke dalam kolom.
Usahakan agar tidak ada rongga (gelembung) udara pada fase diam.
Panjang fase diam dalam kolom sekitar 2/3 bagian dari panjang
kolom. Fase gerak usahakan lebih dari 2 cm diatas fase diam.
2. Secara perlahan buka kran, pastikan eluen mengalir secara perlahan.
Pastikan tidak ada gelembung udara pada fase diam dan jaga
keberadaan fase gerak pada kolom. Kran ditutup kembali, dan siap
digunakan
3. Masukkan analit (campuran zat warna dalam sampel) sebanyak kurang
lebih 2-5 ml.
4. Perlahan kran dibuka dan dicatat waktu pertama penetesan fase gerak
5. Fraksi yang keluar ditampung, dan waktu penetesan analit pertama
dicatat. Demikian seterusnya
6. Perhatian: penambahan fase gerak jangan sampai terhambat, sehingga
fase diam kering. Fase gerak ditambahkan dengan hati-hati / perlahan.

5
 BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

1. Eluen yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah Etanol, H2O, dan
NaOH dengan perbandingan Etanol : H2O : NaOH = 7 : 2 : 1

6
 No. Waktu analit pertama Warna yang Volume
keluar dihasilkan warna
1. Menit ke- 20.07 Jingga 6 ml
2. Menit ke- 30.26 Merah 4 ml
3. Menit ke- 35.35 Merah muda 1,6 ml
4. Menit ke- 43.34 Merah muda (peach) 2,2 ml
5. Menit ke- 51.35 Ungu 3,4 ml
6. Menit ke- 56.29 Ungu muda 3 ml

4.2 Pembahasan
Pemisahan pada kromatografi kolom adalah teknik pemisahan campuran zat
yang didasarkan pada afinitas komponen zat terhadap fase diam. Pada kromatografi
kolom terdapat dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Apabila afinitas dengan
absorbennya besar, komponen tersebut akan bergerak lebih lambat sehingga keluar
lebih lama. Sebaliknya, apabila afinitasnya kecil komponen tersebut akan bergerak
lebih cepat sehingga keluar lebih awal.
Eluen yang digunakan adalah campuran etanol : aquades : NaOH = 7:2:1,
sedangkan fase diam yang digunakan adalah silica gel (SIO2).Fase diamnya bersifat
polar.Hal yang dilakukan pertama adalah membasahi silika gel (SiO3) dengan air dan
dimasukkan kedalam kolom yang sudah dibersihkan dan dikeringkan. Sampel yang
kami dapatkan adalah campuran dari sunset yellow dan fenolfatlen, karena setelah
sampel dimasukan kedalam kolom warnanya terpisah menjadi kuning dan merah muda.

7
 Sunset Yellow

Fenolftalein mulai berubah warna menjadi merah muda pada rentangan pH 8,3-
10,0 , jika penambahan titrat dilanjutkan sehingga memiliki rentangan pH diatas 10,0 ,
maka warna larutan akan menjadi merah. Pada larutan yang bersifat basa pada
rentangan pH 8,3-10,0 indikator fenolftalein akan memberikan perubahan warna
menjadi merah muda, dan pada rentangan pH >10,0 indikator fenolftalein akan
memberikan perubahan warna menjadi merah (Bassett, 1994). Namun dalam suasana
basa pekat berlebih indikator fenolftalein kembali menjadi tidak berwarna. Hal ini
didukung dengan hasil percobaan yang menunjukkan bahwa dalam konsentrasi NaOH
yang semakin pekat, warna fenolftalein semakin pudar (Petruševski dan Risteska,
2007).

Perubahan Struktur Fenolftalein Dalam Suasana Basa

8
 Saat sampel dimasukkan kedalam kolom kromatografi,warna merah dari
sampel tadi tidak muncul..Hal ini terjadi karena kelompok kami salah memasukkan
eluen.Jadi, kami memasukkan aquades menjadi eluennya. Namun,lama-kelamaan
muncul gradasi warna merah sampai merah muda ditengah kolom
kromatografi.Kelompok kami menduga hal ini trejadi karena sebagian aquades
mengalir ke gelas beaker yang terletak dibawahnya.
Pemisahan pada kromatografi kolom sederhana komponen tidak terpisah
dengan baik sehingga hasil yang diberikan berupa gradasi warna. Warna yang pertama
keluar adalah warna jingga kekuningan .Setelah kurang lebih 5 menit warna kuning
menghilang.Lalu lama-kelamaan akan muncul warna merah muda.Kira-kira 3 menit
kemudian,muncul warna muncul warna ungu muda.
Koefisien partisi (log p) menunjukkan kemampuan suatu molekul dalam
menembus membran biologis yang bersifat seperti halnya lapisan lemak. Semakin
besar koefisien partisinya semakin non polar zat tersebut sehingga semakin mudah
melewati membrane biologis. Fenoftalen memiliki log p yang lebih besar dibandingkan
sunset yellow sehingga dapat disimpulkan bahwa sunset yellow lebih polar daripada
fenoftalen. Sunset yellow yang lebih polar tersebut akan keluar lebih awal
dibandingkan bromotimol blue sehingga dihasilkan gradasi warna merah jingga
diawalnya.

9
 BAB V

KESIMPULAN

5. 1 Kesimpulan
Prinsip kerja kromatografi kolom adalah adsorbs komponen-komponen
campuran yang mmeiliki afinitas yang berbeda-beda pada permukaan fase
diam.Aliran fase gerak akan membawa komponen-komponen campuran
dengan kecepatan yang berbeda-beda sesuai dengan afinitas komponenn
terhadap adsorben.Komponen yang memiliki afnitas paling kecil akan bergerak
lebih cepat.
Dalam praktikum ini menggunakan sampel yang mengandung sunset
yellow dan fenoftalen.Fase gerak yang digunakan adalah campuran
etanol:aquades:NaOH=7:2:1.Dalam percobaan ini,sunset yellow keluar
pertama kemudian diikuti dengan fenoftalen.Hal ini terjadi karena sunset
yellow memiliki afinitas yang lebih kecil dan lebih polar dibandingkan
fenoftalen.

10
 DAFTAR PUSTAKA

Harmita. 2015. Analisis Fisikokimia Kromatografi Vol 2. Jakarta: Penerbit Buku

Kedokteran EGC
Buku Penuntun Praktikum Analisis Farmasi Dasar
Chemistry courses. Column chromatography. Diakses dari
http://courses.chem.psu.edu/chem36/Experiments/PDF's_for_techniques/CC.p
df
Coskun, Ozlem. Separation technique: Chromatography.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5206469/
Ismail, Baraem., Nielsen, Suzanne. (2010). Basic Principle of Chromatography.
Diakses dari http://anuragaja.staff.ipb.ac.id/files/2017/05/1_Prinsip-
dasarkromatografi.pdf

11
 LAMPIRAN
No Gambar Keterangan
1 Fase diam : silica gel

2 Fase gerak terdiri atas: 70 ml

etanol; 20 ml aquadest; 10 ml
NaOH

3 Etanol 70 ml

1
4 Aquadest 20 ml

5 NaOH 10 ml

6 Kertas saring

2
7 Sampel

8 Kromatografi Kolom

3
4