Kelompok 3
Dini Sri Octaviani (06101181419021)
Nopianti Firdatama (06101181419003)
Puji dan syukur saya panjatkan kehadirat Allah SWT, karena berkat limpahan rahmat
dan hidayah-Nya, sehingga kami dapat menyelesaikan makalah tentang Kromatografi
Kolom (Cair-Padat), meskipun dalam bentuk yang sederhana.
Penyusunan makalah ini, dapat diselesaikan dengan baik dan tepat waktu meskipun
tidak mudah dan ada beberapa hambatan dan kesulitan yang penyusun hadapi.Tetapi semua
itu dapat kami lalui berkat bantuan dari teman-teman sekalian dan tak luput dari berkat dan
rahmat Allah SWT.
Oleh karena itu, penyusun mengucapkan banyak terima kasih kepada dosen mata
kuliah yang telah menugaskan kepada kami untuk memaparkan materi mengenai
Kromatografi Kolom (Cair-Padat) sehingga melalui makalah ini penulis dapat memperoleh
ilmu pengetahuan baru khususnya pada Kromatografi Kolom (Cair-Padat).Akhir kata semoga
makalah ini dapat bermanfaat bagi kita semua.
Penyusun
2
DAFTAR ISI
3
BAB I
PENDAHULUAN
1.3 Tujuan
4
BAB II
PEMBAHASAN
Dalam pemurnian antosianin yang diperoleh dari ekstrak kasar yang telah
dipekatkan dapat menggunakan fasa diam silika gel atau dengan menggunakan resin
sefadeks LH-20. Untuk memperoleh pemisahan yang sempurna, dapat menggunakan
sefadeks LH-20 sebagai fasa diamnya dengan menggunakan eluen metanol (Lee, 2013).
Pada kromatografi ini sampel sebagai lapisan terpisah diletakkan diatas fase
diam. Biasanya sampel dihomogenkan dengan fase diam sehingga merupakan serbuk
kering, diatas lapisan ini dapat diletakkan pasir untuk menjaga tidak terjadinya kerusakan
waktu ditambahkan fase gerak diatas lapisan sampel. Fase diam dan sampel ini berada di
dalam kolom yang biasanya dibuat dari gelas, logam ataupun plastik. Selama elusi fase
gerak dialirkan dari atas, mengalir karena gaya gravitasi atau ditekan dan juga disedot
dari arah bawa. Komponen sampel akan terpisah selama bergerak dibawa fase gerak
didalam kolom (fase diam). Komponen yang paling tidak tertahan oleh fase diam akan
keluar lebih dahulu dan diikuti oleh komponen lain. Semuanya ditampung sebagai fraksi,
volume tiap fraksi tergantung besarnya sampel (kolom).
Untuk mengoptimalkan hasil pemisahan dapat pula menggunakan kolom yang
dilengkapi dengan aliran tekanan udara yang berasal dari aerator. Dalam hal ini kolom
sedikit diberi modifikasi yakni, ujung kolom dibagian atas diberi penutup dan lubang
saluran udara melalui pipa atau selang aerator. Tekanan udara akan mempercepat proses
5
elusi dalam kolom. Tekanan ini lebih menguntungkan karena memisahkan dengan baik,
tidak memakan waktu yang cukup lama, elusi berjalan dengan baik jika dibandingkan
dengan tanpa menggunakan tekanan udara (Hostettmanne,1995).
Persyaratan kolom
Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di sembarang tempat
suddah tentu sedapat mungkin harus sama. Keseragaman ini dapat dicapai dengan memilih
adsorben yang ukuran butir butirnya sama ( diayak ) dan dengan cara penyaratan yang baik.
Makin kecil ukuran butir adsorben, makin cepat keseimbangan adsorpsi akan tercapai, dan
makin besar pula kecepatan elusi yang boleh dipergunakan. Tetapi dilain pihak, makin kecil
butir adsorben, makin besar hambatan bagi cairan yang harus mengalir melalui kolom.
Apabila kecepatan lintas bagi cairan elutor terlalu kecil, dapat dipergunakan pompa vakum
yang menimbulkan tekanan rendah dalam ruang di bawah kolom sehingga cairan dapat
mengalir lebih cepat melalui kolom. Cara yang lain ialah menambahkan tekanan dalam ruang
di atas kolom dengan menggunakan pompa pneumatic.
Bentuk kolom
Penempatan adsorben dalam kolom secara uniform betul sangat sukar dilaksanakan.
Sebagai akibatnya, zona zona komponen yang dipisahkan menjadi kurang teratur
bentuknya. Bagi kolom yang lebar hal ini dapat menyebabkan pembauran. Tetapi bagi kolom
kecil bahaya ini seberapa besar. Namun di lain pihak, kolom yang lebar dan pendek itu lebih
memudahkan dalam pemakaiannya. Oleh karena itu, tinggi kebanyakan kolom ialah 20 kali
diameternya. Di bawah tabung yang umumnya terbuat dari gelas terdapat lempengan meduk
yang terbuat dari porselen atau dari serbuk gelas yang dipanaskan hingga melengket jadi satu.
Lempengan yang berbentuk cakram ini bergawai sebagai penahan fasa yang stasioner. Di
bagian tabung yang paling bawah terdapat kapiler penyulur dilengkapi dengan pancur.
6
Kapiler beserta pancur dirakitkan dengan kolom memakai suku asah sehingga mudah
dilepaskan guna membersihkan kolom dan untuk meniup kolom sehingga menjadi bersih dari
cairan. Ruang antara pancur dan cakram penyaring harus sekecil mungkin supaya tidak
terjadi pembauran antara cairan cairan yang keluar dari kolom.
Kecepatan arus
Semakin rendah kecepatan arus cairan, semakin baik akibatnya bagi tercapainya
keseimbangan adsorpsi dan akan semakin baik pula pemisahannya. Bentuk zona pun menjadi
lebih teratur. Tetapi kecepatan arus yang terlalu rendah dapat menimbulkan efek difusi axial
dalam fasa mobil yang harus dihindarkan sejauh mungkin. Jadi dapat dikatakan bahwa
pemisahan yang terbaik dapat dicapai dengan mempergunakan kolom yang panjang dan
sempit, diisi dengan adsorben yang berbutir halus, dan arus yang lambat. Elusi dapat dimulai
apabila campuran yang harus dipisahkan sudah dimasukan dalam kolom. Elusi ini dilakukan
dengan memasukan cairan elutor berenyai renyai melalui kolom dan harus dijaga supaya
arusnya tidak berhenti. Komponen komponen yang telah diadsorpsikan oleh adsorben akan
bergerak dalam bentuk gelang gelang atau zona dengan kecepatan yang berbeda beda
melalui kolom dan ditampung di bawah kolom secara terpisah memakai beberapa tabung
yang dibubuhi tanda tanda. Tabung tabung ini ditempatkan dalam sebuah fraksikolektor.
Setelah itu fraksi fraksi yang diperoleh mulai dapat diselidiki.
Perolehan data
Suatu integrator, jika berdasarkan mikroprosesor atau perakat lunak pc, hanya
mengukur jumlah total arus yang mengalir melewati lebar puncak suatu kromatografi. Untuk
melakukan hal ini , integrator mengukur laju peningkatan tegangan lebih kurang 30 kali
melintasi lebar puncak tersebut. Parameter yang menunjukan waktu pengukuran harus di
mulai adalah ambang batas puncak tersebut, yang menentukan tingkat ketika tegangan sinyal
tersebut harus di naikkan sebelum akumulasi sinyal terjadi. Untuk mencegah penyimpanan
aliran garis dasar, kemiringan kenaikan harus memiliki ketajaman tertentu sebelum di anggap
suatu puncak.
Semakin lebar suatu puncak kromatografi yang sebanding dengan waktu retensinya,
semakin kurang efesien kolom pengelusinya.
7
2.3 Fase diam
Ukuran partikel fase diam bisanya lebih besar dari ukuran partikel fase dian untuk
KLT, ukuran yang digunakan antara 63-250|iim. Ukuran partikel lebih kecil 63 jam fase
gerak akan mengalir lebih lambat, sehingga perlu ditekan atau dihubungkan dengan pipa
hisap. Silika gel (SiOi) adalah fase diam yang serba guna, banyak digunakan. Pada
pembuatannya silika gel perlu diaktifkan panaskan pada 150-160C selama 3-4 jam. Fase
diam lain adalah alumina.
1. Penelusuran literature/pustaka.
2. Mencoba dengan KLT. Cara ini dikerjakan dengan memilih fase diam KLT sejenis
dengan fase diam kolom yang akan digunakan. Biasanya dicoba dikembangfcan dengan
fase gerak non polar kemudian diikuti dengan fase gerak yang lebih polar.
Cara basah
8
Kedalam ujung kolom kromatografi (tempat keluarnya fase diam) diatas keran
diletakkan gelas wool, tidak perlu ditekan kuat. Diatasnya ditaburkan pasir sehingga
membentuk lapisan tebal + 1 cm. Selanjutnya dimasukkan petroleum eter sambil
mencoba kecepatan menetes fase gerak dengan memutar keran. Di dalam beker gelas
dibuat bubur fase diam dengan petroleum eter. Dengan bantuan batang pengaduk bubur
dimasukkan kedalam kolom berisi petroleum eter. Sambil diketuk-ketuk butir-butir fase
diam akan turun dan tersusun rapi didalam kolom. Bila kolom penuh dengan petroleum
eter keran dibuka untuk menurunkan permukaannya dan petroleum eter yang keluar
dapat digunakan lagi untuk membuat bubur fase diam. Packing dihentikan sampai
panjang kolom yang dikehendaki. Selapis pasir diletakkan pada packing kolom untuk
melindungi kolom. Kolom dijaga untuk tidak kering, maka diatas lapisan pasir haras
selalu ada selapis fase gerak. Pada proses packing ini dinding luar kolom gelas
disemprot dengan aseton. Penyemprotan dimaksudkan untuk mendinginkan kolom
sehingga menghambat terbentuknya gelembung udara. Adapun untuk kolom yang
diameternya kecil fase diam kering dapat ditaburkan sedikit demi sedikit kedalam
kolom yang berisi petroleum eter. Kolom ini digunakan setelah disimpan semalam.
Cara kering
Selapis pasir diletakkan didasar kolom, kemudian fase gerak dimasukkan lapis
demi lapis sampil ditekan dengan karet atau alat penekan lain. Selain ditekan dapat juga
dibantu dengan dihisap, sehingga dihasilkan packing fase diam yang mampat. Diatas
fase diam diletakkan kertas saring dan diatasnya lagi sdapis pasir. Pada posisi keran
terbuka fase gerak dituangkan dan dibiarkan mengalir keluar. Packing kolom disimpan
dengan mempertahankan selapis fase gerak berada diatas lapisan pasir.
Penyiapan Sampel
9
namun akan dikumpulkan banyak fraksi. Untuk 10 gram sampel biasanya
dikumpulkan fraksi dengan volume a 150 ml.
Cara meletakkan sampel pada kolom yang lebih baik adalah dengan
mencampur dengan fase diam. Satu bagian sampel dilarutkan dalam pelarut yang
sesuai, biasanya pelarut yang digunakan adalah pelarut yang digunakan untuk
pembuatan ekstrak. Larutan ekstrak ini kemudian dicampur dengan 2,0-3.0 bagian
fase diam, dengan hati-hati campuran ini dikeringkan didalam rotary evaporator
hingga diperoleh serbuk ekstrak kering. Serbuk ini ditaburkan diatas packing kolom
dan ditutup dengan selapis pasir. Selanjutnya sampel siap dielusi.
Elusi (pengembangan)
10
Gambar 1. Diagram pemisahan dua komponen pada kromatografi kolom
11
Gambar 2. Ilustrasi Pemisahan Menggunakan Metode Kromatografi Kolom.
Pada gambar diatas, sampel berada dalam fasa gerak (eluen) dan dimasukkan
dalam kolom kromatografi. Komponen dalam sampel akan terpisah saat berada dalam
kolom, setelah berinteraksi dengan fase diamnya, kemudian eluen yang mengandung
komponen senyawa akan keluar dari kolom melalui detektor untuk analisis kuantitatif.
12
diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat,
lemak, vitamin dan molekul penting lainnya. Dengan data-data yang didapatkan dengan
menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan
mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat
pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.
Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam
menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat
mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat
diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui
konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan
fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu
penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat. Sekarang ini, deteksi
senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidney
stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau
lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk
mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.
13
BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
1. Kromatografi kolom merupakan jenis kromatografi padat cair berdasarkan serapan
yang dilakukan di dalam kolom (fasa diam), metode ini merupakan metode yang
paling banyak digunakan dan terbaik dalam pemisahan campuran dalam jumlah
besar.
2. Prinsip Kerja Kromatografi Kolom, sampel berada dalam fasa gerak (eluen) dan
dimasukkan dalam kolom kromatografi. Komponen dalam sampel akan terpisah
saat berada dalam kolom, setelah berinteraksi dengan fase diamnya, kemudian
eluen yang mengandung komponen senyawa akan keluar dari kolom melalui
detektor untuk analisis kuantitatif.
3. Kromatrografi kolom dapat dimanfatkan dalam pemisahan molekul-molekul
penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting
lainnya.
3.2 Saran
Demikian makalah ini di susun, tentunya banyak kekurangan baik dalam segi isi atau
penyampaiannya.Oleh karena itu, saya mengharap kritik dan saran demi kesempurnaan
makalah kami.Semoga makalah ini bermanfaat bagi pembaca.
Penulis juga berharap kromatografi cair-padat (ardsorbsi) yang telah disajikan dalam
bab pembahasan dapat dijadikan referensi ataupun tambahan wawasan bagi pembaca
sehingga dapat membedakannya dan dapat menerapkannya secara tepat.
14
DAFTAR PUSTAKA
Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern.
Bandung:PT Remaja Rosdakarya Offset.