Makalah Teknik Laboratorium Kimia Organik

KROMATOGRAFI KOLOM TEKAN

Oleh :

KELOMPOK II

Elsye Mesak H311 15 316

Wirda Asriani Hamja H311 15 507
Nariskawati H311 15 508
Arnita Sasghia H311 15 514

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar ....................................................................................................

Daftar Isi.............................................................................................................

BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang .............................................................................................
1.2. Rumusan Masalah ........................................................................................
1.3. Tujuan ..........................................................................................................
BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Penjelasan Awal Kromatografi Kolom .........................................................
2.2 Prinsip Kerja Kromatografi Kolom ...............................................................
2.3 Instrumen Kromatografi Kolom....................................................................
2.4 Prosedur Kromatografi Kolom ......................................................................
2.5 Aplikasi Kromatografi Kolom ......................................................................
2.6 Kromatografi Kolom Tekan .........................................................................
BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan ..................................................................................................
DAFTAR PUSTAKA
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah
memberikan rahmat dan karunia-Nya hingga terselesaikannya makalah ini.
Makalah ini menjelaskan tentang kromatografi kolom.

Penyusun mengucapkan terima kasih terutama kepada dosen pembimbing

yang telah mengarahkan dan membimbing penyusunan dalam menyelesaikan
makalah ini, serta terimakasih kepada teman-teman yang telah membantu.

Semoga makalah ini dapat menambah pengetahuan tentang kromatografi

kolom. Kami menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari sempurna. Maka dari
itu, kami mengharapkan saran-saran untuk penyempurnaan makalah ini.

Makassar, Agustus 2018

Penyusun
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di
laboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa,
dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya,
kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan , dan
kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari
campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik
langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah
: (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2)
Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi,
penjerapan), dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke
keadaan uap (keatsirian).
Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan
dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan
teknik tersebut. Salah satu jenis dari kromatografi adalah kromatografi kolom.
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak
digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa
dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben
yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Pada
bagian selanjutnya akan dibahas mengenai kromatografi kolom baik kolom
konvensional maupun kolom vakum.

1.2 Rumusan Masalah

a. Apa yang dimaksud kromatografi kolom dan prinsip kerja kromatografi kolom?
b. Bagaimana instrumen kromatografi kolom?
c. Bagaimana prosedur umum kromatografi kolom?
d. Bagaimana aplikasi kromatografi kolom?
e. Apa yang dimaksud kromatografi kolom tekan?
f. Bagaimana prinsip kerja, komponen dan penerapan kromatografi kolom tekan?
1.3 Tujuan
a. Untuk mengetahui pengertian dan prinsip kerja kromatografi kolom
b. Untuk mengetahui instrumen kromatografi kolom.
c. Untuk mengetahui prosedur umum kromatografi kolom
d. Untuk mengetahui aplikasi kromatografi kolom
e. Untuk mengetahui pengertian kromatografi kolom tekan
f. Untuk mengetahui prinsip kerja, komponen dan penerapan kromatografi kolom
tekan

.
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Penjelasan Awal Kromatografi Kolom

Kromatografi adalah teknik di mana senyawa yang akan dipisahkan
didistribusikan antara fase gerak dan fase diam. Dalam sistem seperti itu,
distribusi yang berbeda didasarkan adsorpsi selektif yang menimbulkan
pemisahan. Ada berbagai jenis kromatografi, seperti kertas, lapisan tipis, atau
kromatografi kolom, masing-masing memiliki kekuatan dan kelemahan tersendiri.
Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang paling berguna untuk
pemisahan dan pemurnian zat padat dan cairan saat melakukan percobaan skala
kecil. Pemisahannya bisa berupa cairan / padat (adsorpsi) atau cairan / cairan
(partisi) pada kromatografi kolom. Fase diam, adsorben padat, biasanya
ditempatkan di kolom kaca vertikal dan fasa gerak, ditambahkan dari atas dan
membiarkan mengalir turun melalui kolom dengan gravitasi atau tekanan
eksternal (gambar 1)

Gambar 1. Kromatografi kolom melibatkan fase gerak yang mengalir di atas fase
diam.

2.2 Prinsip Kerja Kromatografi Kolom

Setelah campuran dari fase diam dan sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke kolom, nantinya komponen dari campuran itu akan bergerak
dengan kecepatan yang berbeda-beda.
 Gambar 2. Kromatografi kolom

Komponen dengan tingkat afinitas dan adsorpsi yang rendah pada fase
diam akan bergerak lebih cepat dan terelusi keluar lebih dulu dibanding dengan
komponen yang memiliki tingkat afinitas dan adsorpsi lebih besar yang bergerak
lebih lambat dan terelusi keluar terakhir.

Molekul terlarut terserap ke kolom dengan cara yang reversibel. Laju

komponen diberikan sebagai berikut
jarak pergerakan komponen
𝑅=
jarak pergerakan fase gerak
Yaitu rasio jarak yang ditempuh dengan zat terlarut terhadap jarak yang ditempuh
oleh pelarut.

Karena komponen yang berbeda dalam campuran memiliki interaksi yang

berbeda dengan fase stasioner dan mobile, mereka akan dibawa bersamaan dengan
fase gerak ke berbagai tingkat dan pemisahan akan tercapai. Komponen individu,
atau elutan, dikumpulkan sebagai tetesan pelarut dari bagian bawah kolom.
Banyak senyawa tidak terlihat oleh mata saat dilarutkan dalam pelarut atau
teradsorbsi pada adsorben. Proses visualisasi membuat zat ini terlihat. Teknik
yang digunakan untuk tujuan ini meliputi lampu UV yang menyebabkan
fluoresensi atau pendar dan reaksi kimia yang memberikan senyawa berwarna.
Permukaan partikel padat biasanya lebih aktif daripada bagian dalamnya
yang umum dikatakan mempunyai aktivitas permukaan (surface activity). Bila
partikel tersebut dimasukkan dalam suatu larutan, permukaan partikel tadi
mempunyai daya tarik baik pada zat-zat yang terlarut maupun pada zat pelarutnya.
Daya tarik atau adsorpsi dapat berbagai bentuk, yaitu yang bersifat elektrostatik
(ionic), daya tarik antara dua dipole, antara dipole dan dipole induksi, dan yang
berupa kekuatan van der waals (London forces).

Partikel padat yang mempunyai aktivitas permukaan tadi dalam

kromatografi dinamakan adsorben. Adsorben harus mempunyai permukaan yang
luas dan mempunyai aktivitas kimia seperti disebutkan di atas. Untuk
menghasilkan data yang ada menfaatnya, kecepatan elusi harus dibuat konstan.
Kecepatan elusi tergantung dari besarnya/ukuran partikel bahan isian, dimensi
dari kolomnya, viskositas dan tekanan yang dipakai untuk mengalirkan zat
pelarut. Kecepatan linear eluan biasanya 1 cm per menit. Berbagai fraksi dapat
dikumpulkan secara terpisah dan dapat diteliti lebih lanjut dengan metode lain
seperti dengan spektrometri. Gambar skematik alat yang dipakai untuk kolom
kromatografi adsorpsi seperti pada gambar 1.

Gambar 3. Skematik alat kromatografi kolom adsorpsi

Metode pemisahan kromatografi kolom ini memerlukan bahan kimia yang

cukup banyak sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom
gelas. Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom
diperlukan waktu yang cukup lama, bisa berjam-jam hanya untuk memisahkan
satu campuran. Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang
sukar mendapatkan pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu
bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama
disebabkan laju alir fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi,
ukuran diameter partikel yang cukup besar membuat luas permukaan fasa diam
relative kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen
dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel diperkecil
supaya luas permukaan fasa diam bertambah menyebabkan semakin lambatnya
aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam
yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang
lain karena sukar meregenerasi fasa diam (Hendayana, 2006).
Untuk memisahkan campuran, kolom yang telah dipilih sesuai campuran
diisi dengan bahan penyerap seperti alumina dalam keadaan kering atau dibuat
seperti bubur dengan pelarut. Pengisian dilakukan dengan bantuan batang
pengaduk untuk memanfaatkan adsorben dan gelas wool pada dasar kolom.
Pengisian harus dilakukan secara hat-hati dan sepadat mungkin agar rata sehingga
terhindar dari gelembung-gelembung udara, untuk membantu homogenitas
biasanya kolom setelah diisi divibrasi diketok-ketok. Sejumlah cuplikan yang
dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui sebelah atas kolom dan
dibiarkan mengalir ke dalam adsorben. Komponen-komponen dalam campuran
diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit
pada permukaan atas kolom. Dengan penambahan pelarut secara terus-menerus,
masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan pada bagian
atas kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap, komponen
campuran dan eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap apabila suatu komponen
yang satu dengan yang lainnya bergerak ke bagian bawah kolom dengan waktu
atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan (Yazid, 2005).
2.3 Instrumen Kromatografi Kolom

 Kolom vertikal (sebaiknya kolom kaca) dengan kenop di ujung bawah.

Gambar 4. Instrumen Kromatografi Kolom

 Statif dan klep

 Wadah penampung hasil elusi (beaker, Erlenmeyer, tabung reaksi, dll)
 Fase diam atau adsorben biasanya ditambahkan pada kolom setelah
penambahan pasir halus. Partikel fase diam harus memiliki ukuran dan bentuk
yang seragam tanpa kontaminasi.
Alumina dan silika gel merupakan dua adsorben yang paling popular
dipakai. Di bawah ini dicantumkan adsorben dari yang mempunyai kemampuan
adsorbs besar ke yang kecil.

1. Alumina
2. Charcoal (arang)
3. Silika gel
4. Magnesia
5. Kalium karbonat
6. Sukrosa
7. Starch
8. Serbuk selulosa
 Aktivitas permukaan dari setiap adsorben berbeda pada sisi yang satu ke
sisi yang lain dan dari batch yang satu ke batch yang lain. Perlakuan pendahuluan
menurut cara-cara yang ditentukan dapat menghilangkan aktivitas tersebut. Daya
adsorpsi alumina dapat diatur dengan mengatur jumlah air yang dikandung.
Caranya ialah dengan mengeringkan alumina pada suhu 360°C selama 5 jam,
kemudian membiarkan alumina kering tersebut untuk menyerap air sampai jumlah
tertentu. Aktivitasnya tergantung dari kadar airnya dan dinyatakan dalam skala
Brockmann.

Luas permukaan alumina kira-kira 150 m3/g. Sekitar 5% kadar air sudah
cukup untuk melapisi alumina dengan lapisan air tunggal. Alumina yang berkadar
air 3% mempunyai aktivitas yang umum digunakan. Silika gel mempunyai luas
permukaan yang lebih besar, yaitu sekitar 500 m3/g, tetapi mempunyai aktivitas
kimia yang lebih kecil dan lebih disukai untuk pemisahan senyawa-senyawa
organik yang peka terhadap perubahan-perubahan karena aktivitas permukaan
yang mempunyai sifat katalitik.

Tabel 1. Hubungan skala Brockmann dan kadar air alumina

Skala Brockmann Kadar air (%)

I 1
II 3
III 6
IV 10
V 15

 Fasa gerak atau pelarut dari kromatografi dapat berupa pelarut tunggal atau
pelarut campuran yang diperlukan untuk pemisahan.
Zat pelarut mempunyai peranan yang penting dalam elusi, yang dapat
menentukan baik-buruknya pamisahan. Zat terlarut yang mampu menjalankan
elusi terlalu cepat tidak akan mampu mengadakan pemisahan yang sempurna.
Sebaliknya elusi yang terlalu lambat akan menyebabkan waktu retensi yang
terlalu lama.
 Urutan zat pelarut atas dasar kemampuan elusinya telah dikemukakan
terdahulu (seri eluotropik). Beberapa golongan solute dapat juga diurutkan dengan
dasar kenaikan adsorbilitasnya pada kolom alumina, seperti yang tertulis di bawah
ini.

1. Perfluorokarbon
2. Hidrokarbon jenuh
3. Hidrokarbon tidak jenuh
4. Haida dan eter
5. Aldehid dan eter
6. Alkohol dan thiol
7. Asam dan basa

 Wol kapas atau bantalan asbes digunakan untuk menahan fase diam dan
hanya membiarkan keluarnya pelarut dan sampel saja.

2.4 Prosedur Kromatografi Kolom

 Pengisian kolom
Mini kolom yang dipakai dibuat dari pipa kaca, panjang 150 mm dan
diameter 8 mm. Kolom tersebut diisi dengan bahan isial florisil (100-200 mesh)
setinggi 15 mm di bagian bawah dan 15 mm di bagian atas dengan alumina netral
(E. Merck) yang tidak mempunyai daya fluoresensi. Untuk menjaga agar bahan
isian tidak bergerak, bagian atas maupun bagian bawah dibatasi dengan wol kaca
atau pulp kertas.

Pengisian kolom harus dikerjakan dengan seragam. Setelah adsorben

dimasukkan dapat diseragamkan kepadatannya dalam kolom dengan
menggunakan vibrator atau dengan plunger. Selain itu dapat juga dikerjakan
dengan memasukkan adsorben dalam bentuk larutan (slurry) dan partikelnya
dibiarkan mengendap. Pengisian kolom yang tidak seragam akan menghasilkan
rongga-rongga di tengah-tengah kolom. Cara memecahkan masalah ini dapat
dikerjakan dengan mengadakan back flushing, sehingga terjadi pengadukan, yang
seterusnya dibiarkan lagi mengendap. Pada bagian bawah (dasar) dan atas dari
isian kolom diberi wol kaca (glass wool) atau sintered glass disc untuk
menyangga isian. Bila kolom telah berisi bahan isian, permukaan cairan tidak
boleh dibiarkan turun di bawah permukaan bahan isian bagian atas, karena akan
memberi peluang masuknya gelembung-gelembung udara masuk ke dalam kolom.

Cara pengisian kolom ada dua macam :

- Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi
kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.
- Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan
pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui
dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil
kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel
mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan
sampel dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh
kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam
kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran
dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang
keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.
 Fase gerak yang terelusi melalui seluruh fase diam (kolom campuran)
mencapai bagian bawah kolom. Kemudian hasil elusi dikumpulkan di gelas
kimia yang ditempatkan di bawah kolom.
 Ketika fase gerak mengalir, komponen dari sampel memiliki laju yang
berbeda ketika melalui gel silika. laju ini ditentukan oleh adsorpsi dan afinitas
molekul terhadap fase diam dan fase gerak.
 Komponen fraksional campuran dengan afinitas lebih besar ke fase gerak
bergerak cepat dan mencapai bagian bawah lebih dulu. Mereka yang memiliki
afinitas tinggi terhadap fase diam bersifat lambat dan terlambat mencapai
dasar.
 Pada akhirnya pita berwarna dari sampel terbentuk. Setiap warna adalah
indikator dari satu kumpulan senyawa tertentu dalam contoh campuran.
Kemudian melalui pergerakan fase gerak berbagai komponen diambil dari
kolom dengan aliran pelarut lebih lanjut. Elusi ini terjadi setetes demi setetes
yang dapat menghabiskan waktu dari beberapa jam hingga berhari-hari
 tergantung pada ukuran sampel, panjang kolom, fase gerak yang digunakan
dan material yang digunakan sebagai fase diam.
Hal-hal yang perlu diperhatikan:
1. Jaga kolom tetap bersih dan bebas dari debu
2. Jangan mengganggu kolom hingga pemisahan selesai
3. Hindari celah dalam kemasan fase diam

2.5 Aplikasi Kromatografi Kolom

 Kolom kromatografi paling cocok untuk memisahkan senyawa aktif dari

bahan tanaman. Karena tanaman mengandung banyak bahan seperti
alkaloid, resin, glikosida, tanin, flavonoid dan molekul bio lainnya,
masing-masing konstituen harus dipisahkan. Karena ekstrak tumbuhan
sangat banyak, metode ini paling baik untuk memisahkannya.
 Pemisahan senyawa setelah sintesis organik untuk mendapatkan molekul
yang diinginkan.
 Untuk memisahkan atau memurnikan campuran senyawa alami seperti
alkaloid, glikosida.

Kromatografi kolom lebih menguntungkan daripada kebanyakan teknik

kromatografi lainnya karena dapat digunakan baik dalam aplikasi analitik maupun
preparatif. Hal ini dapat digunakan untuk menentukan jumlah komponen
campuran dan juga pemisahan dan pemurnian komponen-komponen tersebut.
Kromatografi kolom mengisolasi senyawa yang diinginkan dari campuran
sedemikian rupa sehingga campuran dari atas kolom. Kolom biasanya berupa
kaca atau plastik dengan sinter frits untuk menahan pengepakan. Pelarut cair
(eluent) dilewatkan melalui kolom dengan gravitasi atau dengan tekanan udara.
Eluen, alih-alih naik dengan aksi kapiler ke lapisan tipis, mengalir ke bawah
melalui kolom yang diisi dengan adsorben. Keseimbangan terbentuk antara zat
terlarut yang teradsorpsi pada adsorben dan pelarut yang mengalir turun melalui
kolom. Fase stasioner hampir selalu merupakan adsorben. Adsorben adalah zat
yang menyebabkan molekul atau ion yang lewat menempel pada permukaan
partikelnya. Fase gerak adalah pelarut yang mengalir melewati fase diam,
melarutkan molekul senyawa untuk dipisahkan.

2.6 Kromatografi kolom tekan

Kromatografi kolom dibagi menjadi dua kategori berdasarkan bagaimana
pelarut mengalir melalui kolom. Jika pelarut dibiarkan mengalir turun melalui
kolom dengan gravitasi atau perkolasi, itu disebut dengan kromatografi kolom
gravitasi. Jika pelarut didorong ke kolom dengan tekanan udara positif, disebut
dengan kromatografi kolom tekan atau flash chromatography.
Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerak dengan cepat
karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara yang ditekan
mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan peruraian produk dari
ekstrak dan berubah saat pemisahan kromatografi.
Kromatografi kolom tekan adalah teknik yang digunakan untuk
memisahkan campuran molekul ke dalam konstituen individual, sering digunakan
dalam proses penemuan obat.
Kromatografi kolom tekan berbeda dari teknik konvensional dikarenakan:
1. Menggunakan partikel silika gel yang lebih kecil (250-400 mesh),
2. Aliran yang terbatas pelarut yang disebabkan partikel gel yg kecil, tekanan gas
(10-15 psi) digunakan untuk membawa pelarut melalui fase diam dari kolom.
Hasilnya adalah pemisahan yang cepat dan tinggi kromatografi.
a. Prinsip Kerja
Eluen secara cepat didorong (di bawah tekanan gas biasanya berupa
nitrogen atau udara yang dipompa) melalui kolom kaca pendek dengan diameter
dalam yang besar. Kolom kaca diisi dengan adsorben dari ukuran partikel yang
ditentukan. Fase diam yang sering digunakan adalah silika gel 40-63 μm.
Partikel yang lebih kecil dari 25 μm hanya boleh digunakan dengan fase
gerak yang viskositasnya rendah, jika tidak laju aliran akan sangat rendah.
Umumnya alas gel sekitar 15 cm bekerja dengan tekanan 1,5-2 bar. Hanya silika
yang tidak termodifikasi yang digunakan sebagai fase diam, jadi hanya
memungkinkan untuk kromatografi fase normal. Sama dengan HPLC, fase
terbalik juga sering digunakan pada kromatografi kolom tekan.
b. Komponen
Pemilihan sorben: Persyaratan dasar untuk keberhasilan pemisahan adalah
pemilihan absorben yang sesuai. Fase diam yang paling penting dalam
kromatografi kolom adalah silika. Silika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3) adalah
dua adsorben yang biasa digunakan oleh peneliti organik untuk kromatografi
kolom. Adsorben ini dijual dengan ukuran mesh berbeda, biasanya ditunjukkan
oleh angka pada label botol: “silica gel 60” atau “silica gel 230-400”. Bilangan ini
mengacu pada mesh dari pengayak yang digunakan. khusunya jumlah lubang
dalam mesh atau ayakan yang melalui campuran partikel silika yang dilewatkan
pada proses pembuatan.
Ukuran partikel adsorben mempengaruhi bagaimana pelarut mengalir
melalui kolom, Partikel lebih kecil (nilai mesh lebih besar) digunakan untuk
kromatografi kolom tekan; partikel lebih besar (nilai mesh lebih kecil) digunakan
untuk kromatografi kolom gravitasi. Contohnya silika gel 70-230 digunakan untuk
kolom gravitasi dan 230-400 mesh digunakan untuk kromatografi kolom tekan.
Jumlah silika gel bergantung pada perbedaan Rf dari senyawa yang
dipisahkan dan jumlah sampel. Dari n gram sampel, dharus digunakan 30-100 n
gram silika gel. Untuk pemisahan yang lebih mudah, perbandingan yang dekat
dengan 30:1 efektif, untuk pemisahan yang sulit, dibutuhkan lebih banyak silika
gel. Namun, dengan menggunakan silika gel lama waktu yang dibutuhkan
bertambah. Densitas silika gel bubuk sekitar 0,75 g/mL.
Adsorben yang biasa digunakan dalam kromatografi kolom tekan adalah
sebagai berikut:
1. Silika: medium yang sedikit asam. Baik untuk senyawa yang biasa,
menghasilkan pemisahan yang baik.
2. Florisil: medium netral. 200 mesh dapat efektif untuk pemisahan yang
mudah. Kurang dari 200 mesh baik untuk pemurnian dengan filtrasi.
Beberapa senyawa melengket pada florisil jadi harus diuji terlebih dahulu.
3. Alumina: Medium netral. Dapat efektiff untuk pemisahan yang mudah
dan pemurnian amina.
4. Silika fase terbalik: Senyawa yang paling polar terelusi lebih cepat,
yang nonpolar lebih lambat.
 Sistem pelarut: Kromatografi kolom tekan biasanya dilakukan dengan
campuran 2 pelarut yaitu komponen polar dan nonpolar. Sistem satu komponen
yang sesuai (ditulis dari yang paling sedikit poolar ke yang paling polar)
hanyalah:
1. Hidrokarbon: pentana, petroleum eter, heksana
2. Eter dan diklorometan (polaritas hampir sama)
3. Etil asetat
Sistem pelarut dua komponen yang umum (ditulis dari yang paling sedikit
polar ke yang paling polar) yaitu:
1. Eter/petroleum eter, eter/heksana dan eter/pentana
2. Etil asetat/heksana
3. Metanol/diklorometana
4. 10% amonia dalam larutan metanol/diklorometana
c. Pemilihan sistem pelarut
Senyawa yang akan dipisahkan harus memiliki Rf KLT 0,15-0,20 dalam
sistem pelarut yang dipilih. Sistem pelarut dua komponen dengan satu pelarut
memiliki polaritas yang lebih tinggi dibanding yang lain biasanya bagus karena
membiarkan penyesuaian kepolaran rata rata dari eluen. Perbandingan pelarut
menentukan polaritas sistem pelarut, juga laju elusi senyawa yang dipisahkan.
Semakin tinggi polaritas atau kepolaran pelarut, meningkatkan laju elusi semua
senyawa. Sistem pelarut dua komponen yang biasa digunakan untuk
meningkatkan polaritas adalah diklorometana/heksana, eter/heksana, heksana/etil
asetat dan diklorometana/etanol. Jika Rf = 0,2 dibutuhkan volume pelarut 5x
volume silika gel kering untuk menjalankan kolom.

d. Mengepak Kolom
Ambil kolom kaca dan pastikan memasukkan kapas ke dalam kolom di
atas keran pemutar untuk mencegah silika gel keluar dari kolom melalui keran
pemutar. Jika memasukkan terlalu banyak, aliran pelarut akan menjadi lambat
dengan tekanan udara di atas kolm. Selanjutnya, masukkan ½ inch lapisan pasir di
atas kapas. Gunakan secukupnya untuk mendapatkan permukaan yang rata, yang
sama dengan diameter badan kolom. Pastikan permukaannya rata. Kemudian
tuangkan silika gel menggunakan corong. Silika gel hampir sama dengan
asbestos, dan diketahui bersifat karsinogenik. Gunakan dengan hati-hati.
Kemudian, Selanjutnya, tekan sisi kolom dengan tabung karet untukmeratakan
silikagel. Tuangkan sejumlah pelarut elusi ke dalam kolom. Gunakan gas
bertekanan untuk mendorong pelarut melalui silika. Ketika mendorong, akan
terlihat bagian atas silika menjadi lebih homogen, ini akibat dorongan terhadap
udara yang terjebak di silika gel. Kemudian bilas dengan pelarut melalui silika gel
sampai silika lebih homogen. Jangan biarkan kolom beroperasi dengan kering,
jika tidak udara akan kembali ke atas silika.
e. Menerapkan Sampel
Biarkan pelarut yang tinggal di atas silika turun hingga terbilas dengan
permukaan silika. Jika permukaan atas silika tidak datar, tepuk pelan kolom.
Masukkan sampel dalam volume minimum pelarut elusi. Masukkan melalui
bagian atas kolom, hati-hati jangan menganggu bagian atas silika. Biarkan sampel
meresap ke dalam silika. Kemudian bilas sisi kolom dengan pelarut elusi. Biarkan
meresap ke dalam silika. Setelah itu, tambahkan pasir untuk melindungi
permukaan atas silika ketika menambahkan pelarut lebih banyak.
f. Mengelusi Sampel
Tambahkan pelarut elusi ke dalam kolom. Gunakan tekanan untuk
mendorong pelarut melalui kolom. Tekanan harus minimum jika perlu untuk
menjaga aliran yang tetap yang keluar dari kolom. Hati hati jika telah memilih
pelarut, akan mengambil sedikit waktu sebelum senyawa yang diinginkan mulai
berelusi. Maksudnya bahwa pelarut yang akan keluar terlebih dahulu dan tidak
mengandung senyawa yang kita inginkan dan dapat dibuang. Jika Rf senyawa
0,33 atau kurang, hati-hati dalam membuang sejumlah pelarut yang sama dengan
volume silika gel kering yang digunakan untuk kolom. Ketika mengumpulkan
pelarut sebanyak ini, mulai mengumpulkan pelarut elusi ke dalam tabung reaksi
pemisah (fraksi). Ketika pelarut telah digunakan seluruhnya, sampel seharunya
telah selesai dielusi ke dalam tabung reaksi yang dikumpulkan. Untuk
memaksimalkan efisiensi kromatografi, fraksi yang dikumpulkan harus tidak lebih
dari sekitar sepersepuluh dari volume kolom. Contohnya, jika menggunakan 25 g
silika gel, harus dikumpulkan fraksi sekitar 3 mL.
g. Menempatkan Sampel
Gunakan KLT untuk menentukan pada fraksi mana yang mengandung
senyawa yang diinginkan. Cara terbaik yaitu spot 10 fraksi pada satu
lempengkromatografi lapis tipis dan elusi 10 pelat jalur sekali, daripada
melakukan analisis individual untuk setiap fraksi. Kombinasikan fraksi yang
mengandung sampel pada rotavap (rotary evaporator).

h. Membersihkan Kolom
Semua pelarut yang tersisa dari kolomdialirkan dengan menggunakan gas
bertekanan. Bila semua pelarut cair telahdihilangkandarireservoir,hilangkansisa
pelarut terakhir dengan menggunakan vakum (dari aspirator) ke bagian bawah
kolom.Buang silika gel bekas dalam wadahkhususpembuangansilika gel.

Gambar 5. Kromatografi Kolom Tekan

i. Keuntungan:
- Metode yang cepat dan ekonomis untuk sintesis skala laboratorium
- Ideal untuk pemisahan senyawa hingga dalam jumlah gram
- Tidak ada peralatan mahal yang dibutuhkan
 - fase gerak dan fase diam tidak mahal dan cukup dibuang ketika
selesai digunakan sekali atau dapat digunakan lagi
j. Penerapan
- Pemurnian bahan sintetik
- Isolasi senyawa yang diinginkan dari bahan alam
- Penyederhanaan campuran hingga preparasi resolusi tinggi kromatografi cair
- Fraksinasi campuran kompleks menjadi kelompok sederhana untuk dianalisis
- Digunakan untuk pemurnian peptida
- Digunakan untuk pemisahan senyawa organik yang berhubungan dekat
- Sistem tekan berguna untuk pemuurnian senyawa runut dari campuran organik
- Alat untuk memonitor proses reaksi dan untuk mengisolasi dan
mengidentifikasi campuran senyawa
 BAB III
KESIMPULAN

1. Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang paling berguna untuk
pemisahan dan pemurnian zat padat dan cairan saat melakukan percobaan
skala kecil. Pemisahannya bisa berupa cairan / padat (adsorpsi) atau cairan /
cairan (partisi) pada kromatografi kolom.
2. Setelah campuran dari fase diam dan sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke kolom, nantinya komponen dari campuran itu akan bergerak
dengan kecepatan yang berbeda-beda.
3. Instrumen kromtografi kolom terdiri dari kolom vertical, statif dan klep,
wadah penampung hasil elusi dan fase diam
4. Beberapa aplikasi kromatografi kolom yaitu memisahkan senyawa aktif dari
bahan tanaman, Pemisahan senyawa setelah sintesis organik untuk
mendapatkan molekul yang diinginkan dan untuk memisahkan atau
memurnikan campuran senyawa alami seperti alkaloid, glikosida
5. Kromatografi kolom tekan sederhana di mana fase gerak bergerak dengan
cepat karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara yang
ditekan mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan peruraian
produk dari ekstrak dan berubah saat pemisahan kromatografi.
6. Prinsip kerja dari kromatografi kolom tekan yaitu eluen secara cepat didorong (di
bawah tekanan gas biasanya berupa nitrogen atau udara yang dipompa)
melalui kolom kaca pendek dengan diameter dalam yang besar.
 DAFTAR PUSTAKA

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi.

Penerbit ITB. Bandung.

K. Hostettmann, M. Hostettmann, A. Marston. 1995. Cara Kromatografi

Preparatif. Penerbit ITB. Bandung.

Hendayana, Sumar. Kimia Pemisahan. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya, 2006

Khopkar, S.M. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Erlangga, 2008

Yazid, Estien. Kimia Fisika Paramedis. Yogyakarta: Andi, 2005

Fitriya, Anwar, L. dan Sari, F., 2009, Identifikasi Flavonoid dari Buah Tumbuhan
Mempelas, Jurnal Penelitian Sains, 12(3), 1-5.

Swathi, G., Srividya, A., Ajitha, A. dan Rao, V. U. M., 2015, Review On: Flash
Chromatography, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, 4(8), 281-296.

Roge, A.B., Firke, S.N., Kawade, R.M., Sarje, S.K., dan Vadvalkar, S.M., 2011,
Review on Flash Chromatography, International Journal of
Phamarceutical Science and Research, 2(8): 1930-1937.

Still, W.C., Kahn, M., dan Mitra, A., 1978, Rapid Chromatograpic Technic for
Preparative Separations with Moderate Resolutions, Journal of Organic
Chemistry, 43(14), 2923-2925.