LAPORAN PRATIKUM BIOKIMIA TANAMAN

“Kromatografi”

Disusun oleh
Nama : Cindy Sahera
NIM : 205040200111237
Kelas :N
Asisten : Bagas Hadameon

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2021
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi
komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip
yang sama. Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau
cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran
bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang
berbeda pula. Kita akan melihat alasannya pada halaman selanjutnya. Dalam
kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak
adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. (Pusat Pengembangan Dan
Pemberdayaan Pendidik Dan Tenaga Kependidikan Pertanian, 2018)
Kertas kromatografi adalah salah satu bagian paling sederhana dari teknik
pemisahan kromatografi dan merupakan metode klasik. Dalam pemisahan
menggunakan, teknik pemisahan kromatografi kertas pada dasarnya didasarkanpada
prinsip adsorpsi fase diam ke fase gerak, dimana fase diam adalah kertasyang
mengandung serat selulosa, sedangkan fase gerak adalah eluen yangdigunakan untuk
setiap spesifikasi campuran untuk terpisah.
Meskipun dasar kromatografi adalah pemisahan, banyak dari metode ini dapat
digunakan untuk analisis kuantitatif dankualitatif untuk kromatografi kertas,
kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom,kromatografi gas, dan kromatografi cair
vakum.
1.2 Tujuan
Tujuan dari pratikum kromatografi untuk memahami defenisi kromatografi serta
macam-macam kromatografi, memahami pigmen warna pada tumbuhan selain itu
pratikum ini bertujuan untuk menerapkan kromatografi kertas pada pengamatan daun
bayam dan menganalisis nilai Rf pada hasil yang didapatkan.
1.3 Manfaat
Manfaat dari pratikum Kromatografi adalah mahasiswa dapat memahami
defenisi kromatografi serta macam-macam kromatografi, memahami pigmen warna
pada tumbuhan selain itu mahasiswa dapat menerapkan kromoatografi pada
percobaan daun bayam dan dapat menganalisis nilai Rf yang telah didapatkan
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Definisi Kromatografi
Kromatografi merupakan metode pemisahan campuran atau larutan senyawa
kimia dengan absorpsi memilih pada zat penyerap, zat cair dibiarkan mengalir
melalui kolom zat penyerap, misalnya kapur, alumina dan semacamnya sehingga
penyusunnya terpisah menurut tingkat kepolaran senyawa, pada sebagian senyawa
perbedaan tersebut dapat dicirikan oleh adanya perbedaan warna. (Pusat
Pengembangan Dan Pemberdayaan Pendidik Dan Tenaga Kependidikan Pertanian,
2018)
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan distribusi dari komponen-komponen dalam fasa gerak dan fasa diam. Fasa
gerak dapat berupa gas atau cairan, sedangkan fasa diam dapat berupa cairan atau
padatan. (Rizalina dkk, 2018)
Chromatography is a technique for separating a mixture of substances using
the mobile phase and the stationary phase, where the separation occurs due to
differences in adsorption, solubility, partition, mole size, ion size and vapor pressure
on the components carried by the mobile phase through the stationary phase.
Kromatografi adalah teknik pemisahan suatu campuran zat menggunakan fase gerak
dan fase diam, dimana pemisahan terjadi akibat adanya perbedaan daya adsorpsi,
kelaruutan, partisi, ukuran moleul, ukuran ion dan tekanan uap pada komponen yang
dibawa oleh fase gerak melaui fase diam (Dong, 2006 ; Grob dan Barry, 2004 ; Lux,
2004 dalam Aulia, 2014)
Chromatography is a physical separation technique of a mixture of chemical
substances (analytes) which is based on the difference in the migration / distribution
of each separate component of the mixture in the stationary phase under the influence
of the mobile phase, the mobile phase can be in the form of gas or the liquid and the
stationary phase can be either a liquid or a solid.
Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia (analit)
yang berdasarkan pada perbedaan migrasi/ distribusi masing-masing komponen
campuran yang terpisah pada fase diam (stationary phase) dibawah pengaruh fase
gerak (mobile phase), fase gerak dapat berupa gas atau zat cair dan fasa diam dapat
berupa zat cair atau zat padat. (rifhondex, 2002)
2.2 Macam-macam Kromatografi
Menurut (Pusat Pengembangan Dan Pemberdayaan Pendidik Dan Tenaga
Kependidikan Pertanian, 2018 macam-macam kromatografi sebagai berikut
1. kromatografi kertas
 Kromatografi kertas yaitu kertas mengadsorpsi air dari lingkungan sekitar. Air
tersedia dilingkungan dalam bentuk kelembaban dan bertindak sebagai salah satu
komponen dalam larutan pengelusi (fase gerak). Prinsip kromatografi kertas yaitu
metode pemisahan dari substansi menjadi komponen-komponennya yang bergantung
pada distribusi suatu senyawa pada dua fase yaitu fase diam dan fase gerak, pelarut
bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen bergerak pada laju yang berbeda
dan campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
2. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom terbagi dalam kromatografi kolom terbuka
(konvensional) dan kromatografi kolom tertutup. Ditinjau dari mekanismenya
kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau adsorpsi. Kromatografi
adsorpsi banyak digunakan dalam pemisahan senyawa-senyawa organik, senyawa-
senyawa nonpolar dan konsistuen-konstituen yang sulit untuk menguap Pemisahan
kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen
campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Keuntungan
pemisahan dengan metode kromatografi kolom adalah: a) Dapat digunakan untuk
sampel atau konstituen yang sangat kecil. b) Cukup selektif terutama untuk senyawa-
senyawa organik multi komponen. c) Proses pemisahan dalam dilakukan dalam
waktu yang relatif singkat. d) Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak
memerlukan alat yang mahal dan rumit
3. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan kromatografi planar, yang fase
diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang
didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik.
Kelebihan Metode Kromatografi Lapis Tipis adalah sebagai berikut :
 Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.
 Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,
fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
 Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau
dengan cara elusi 2 dimensi.
 Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang
dengan metode kertas tidak bisa
 Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
 Hanya membutuhkan sedikit pelarut dan lainnya.
4. Kromatografi gas
Kromatografi gas (KG) merupakan metode pemisahan suatu campuran
menjadi komponen-komponen berdasarkan interaksi fasa gerak dan fasa diam. Fase
gerak berupa gas yang stabil sedangkan fase diam bisa zat padat atau zat cair.
Cuplikan yang dapat dipisahkan dengan metode ini harus mudah menguap. Cuplikan
dalam bentuk uap dibawa oleh aliran gas ke dalam kolom pemisah, hasil pemisahan
dapat dianalisis dari kromatogram.
Terdapat beberapa jenis injektor kromatografi gas diantaranya.
 Wide Bore Injector (WBI), seluruh komponen sampel yang diinjeksikan
masuk ke dalam kolom
 Split Injector, digunakan untuk sampel yang memiliki konsentrasi tinggi.
Volume sampel yang masuk hanya yang dibutuhkan saja sedangkan sisanya
dibuang.
 Splitless Injector, digunakan untuk sampel yang berkonsentrasi rendah.
 On Coloumn Injector (OCI), digunakan untuk sampel yang mudah
terdekomposisi oleh pemanasan.
 Program Temperature Vaporizing Injector (PTV), digunakan untuk sampel
yang memiliki variasi titik didih
5. Kromatografi cair vakum
KCV bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa didalam ekstrak.
Sampel tersebut bermigrasi terhadap fasa diam dan fasa gerak dengan cepat karena
berada dalam suasana vakum (Oktaviani et al., 2015). Prinsip kerja KVC yaitu partisi
dan adsorpsi komponen senyawa yang pemisahannya dibantu dengan tekanan dari
alat vakum (Maro et al., 2015).
2.3 Prinsip Kerja Kromatografi Kertas
Menurut (Pusat Pengembangan Dan Pemberdayaan Pendidik Dan Tenaga
Kependidikan Pertanian, 2018) Prinsip kromatografi kertas yaitu metode pemisahan
dari substansi menjadi komponen-komponennya yang bergantung pada distribusi
suatu senyawa pada dua fase yaitu fase diam dan fase gerak, pelarut bergerak lambat
pada kertas, komponen-komponen bergerak pada laju yang berbeda dan campuran
dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna. Berbagai jenis pemisahan
dengan kromatografi kertas dilakukan yang dikenal sebagai "analisa kapiler".
2.4 Pigmen Warna Pada Tumbuhan
Menurut (Hernawati, 2012) Setiap daun merupakan suatu pabrik makanan kecil
yang dapat membuat kebutuhan energinya sendiri melalui konversi energi cahaya
menjadi energi kimia. Beragamnya warna daun pada tumbuhan, memperlihatkan
bahwa pada daun terdapat pula berbagai macam pigmen seperti klorofil, karoten,
xantofil dan warna-warna lainnya. Pigmenpigmen tersebut menduduki tempat yang
khusus pada organel suatu tumbuhan.

Pigmen pada tanaman sebagai berikut

 a. Klorofil
Tumbuhan memanfaatkan energi yang ditangkap oleh klorofil melalui
proses fotosintesis. Klorofil sendiri terdiri dari berbagai macam tipe, ada kolorofil a,
b, c. Tipe klorofil utama yang memegang peranan penting dalam proses fotosintesis
adalah klorofil a. Pada umumnya, tumbuhan mengandung klorofil a dan klorofil b.
Pigmen ini berwarna kehijauan dan pada struktur kimianya mengandung cincin
Porfirin.
b. Karotenoid
Pigmen karotenoid biasanya berwarna merah, orange atau kuning. Pigmen
yang termasuk dalam jenis karotenoid adalah karoten, yaitu zat warna yang
memberikan warna pada wortel. Karotenoid termasuk pigmen yang tidak larut air,
oleh karenanya pigmen ini terdapat pada membran di dalam sel, yaitu pada membran
kloroplas.
c. Antosianin
Berbeda dengan klorofil dan karotenoid, antosianin merupakan pigmen yang
larut dalam air. Pigmen ini diproduksi di dalam sitoplasma dan disimpan di dalam
vakuola. Pigmen ini berwarna merah-pink dan biasanya kita lihat pada daun bunga,
buah-buahan berwarna merah (seperti apel), dan daun-daun yang dijumpai pada
musim gugur.

2.5 Definisi Rf

Menurut (Pusat Pengembangan Dan Pemberdayaan Pendidik Dan Tenaga

Kependidikan Pertanian, 2018) harga Rf merupakan parameter karasteritik
kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran
kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan
merupakan besaran karasteristikdan reproduksibel. Harga Rf didefinisikan sebagai
perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal (b) dan jarak tepi muka pelarut dari
titik awal (a).

Seperti halnya pada kertas harga Rf didefinisikan sebagai berikut:

Harga Rf =
 BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
No. Alat Fungsi
1. Bejana Wadah pelarut
2. Mortal Wadah penghalus daun bayam
3. Pistil Penggiling/.penghalus daun bayam
4. Pipet tetes Pemindah larutan pengamatan ke kertas saring
5. Beakerglass Penampung larutan
6. Gelas ukur Mengukur larutan
7. Timbangan analitik Menimbang daun bayam
8. Kertas saringan Alat pengamatan
9. Pia film Wadah daun bayam
10. Penggaris dan pensil Pembuat batas tetes pada kertas saring
3.1.2 Bahan

No. Bahan Fungsi

1. Aceton Pengekstrak daun bayam
2. Larutan buffer Memepertahankan pH larutan
3. Bayam merah Bahan pengamatan
4. Bayam hijau Bahan pengamatan
3.2 Cara Kerja
Menyiapkan alat dan bahan

Menimbang bayam hijau dan bayam merah sebanyak 3 gram

Menghaluskan bayam hijau dan bayam merah

Memasukkan bayam yang sudah halus ke dalam fial film

Menambahkan 100 ml aceton hingga menjadi pasta

Mengocok pasta hingga homogen dan mendiamkan selama 5

menit

Meneteskan larutan bayam ke atas kertas saringan dan menunggu

hingga kering

Memasukkan kertas yang sudah ditetesi ke dalam bejana

kromatografi yang telah berisi 300 ml pelarut

Menunggu hingga 15 menit

Mengamati perubahan yang terjadi dan menghitung Rf-nay

3.3 Analisa Perlakuan
Untuk melakukan pengamatan kromatograf kertas pada daun bayam yang dapat
dilakukan dengan menyiapkan alat dan bahan berupa bejana, mortal, pistil, pipet
tetes, beakerglass, gelas ukur, timbangan analitik, kertas saringan, pia fil, dan
penggarida serta pensil, selain itu bahan yang digunakan berupa aceton, larutan buffer
dan daun yam hijau dan merah. Untuk melakukan pengamatan setelah bahan dan alat
disiapkan selanjutnya menimbang bayam hijau dan bayam merah sebanyak 300 gram
dengan timbangan analitik, selanjutnya menghaluskan bayam hijau dan bayam merah,
hal ini bertujuan untuk memudahkan pengamatan, setelah bahan halus lalu
menambahkan 100 ml aceton yang berfungsi sebagai pengestrak hingga bayam ini
menjadi pasta. Setelah menjadi pasta mengocok pasta hingga homogen dan
mendiamkan selama 5 menit, selanjutnya meneteskan larutan bayam ke atas kertas
saringan dan menunggu hingga kering hal ini bertujuan untuk melakukan pengamatan
dan mendapatkan hasil yang maksimal dan akurat, setelah itu dapat melakukan
Memasukkan kertas yang sudah ditetesi ke dalam bejana kromatografi yang telah
berisi 300 ml pelarut dan menunggunya hingga 15 menit. Selama waktu tersebut
melakukan pengamatan yang terjadi dan menhitung nilai Rfnya.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Tabel Hasil Pengamatan

Daun Klorofil A Klorofil B Jarak yang digerakkan

U1 U2 U1 U2 pelarut dari titik asal
Bayam 3,4 cm 3,2 cm 2,0 cm 2,9 cm 10 cm
hijau
Bayam 1,8 cm 3,6 cm 2,6 cm 2,4 cm 10cm
merah
4.2 Hasil Perhitungan
 Bayam hijau
a. Klorofil A
U1 = 3,4
U2 = 3,2
Rf =

Rf = = = 0,33 cm
b. Klorofil B
U1 = 2,0
U2 = 2,9
Rf =

Rf= = = 0,245 cm

 Bayam merah
a. Klorofil A ( Hijau Tua)
U1 = 1,8
U2 = 3,6
Rf =

Rf = = = = 0,27 cm
b. Klorofil B ( Hijau Muda)
U1 = 2,6
U2 = 2,4
Rf =

Rf = = = = 0,25 cm
4.3 Pembahasan Umum
4.3.1 Perbandingan nilai Rf bayam merah dan bayam hijau
Dari data yang telah didapatkan pada pengamatan kromatografi dengan metode
kromatografi kertas yang dilakukan pada bahan percobaan bayam hijau dan bayam
merah didapatkan hasil bahwa pada profil A nilai Rf pada bayam hijau lebih besar
dibandingkan nilai Rf pada bayam merah yaitu dengan nilai 0,33 cm sedangkan pada
bayam merah hanya 0,27. Namun pada klorofil B didapatkan hasil pengamatan
adalah pada nilai Rf pada bayam hijau dan bayam merah beda tipis yaitu dengan nilai
Rf bayam hijau 0,24cm sedangkan pada bayam merah adalah 0,25 cm.
4.3.2 Hubungan antara nilai Rf dengan identifikasi pigmen
Pengamatan nilai Rf merupakan parameter analisis kualitatif yang nantinya
digunakan untuk mengetahui ada tidaknnya analit dalam sampel. Kisaran nilai Rf
feofitin a (abu-abu) 0,25-0,78, klorofil a (hijau biru) 0,38-0,57; klorofil b (hijau
kuning) 0,12-0,53 (Aiso, 2019). Hasil pegamatan menunjukkan bahwa nilai Rf pada
profil A bayam hijau adalah 0,33cm dan pada bayam merah adalah 0,27 cm,
sedangkan klorofil a (hijau biru) 0,38-0,57 hal ini menunjukkan bahwa nilai klorofil
A tidak sesuai dengan nilai kisaran Rf klorofil maka tidak terdapat kesesuai dalam
warna pigmen dan harga Rf nya. Pada pengujian klorofil B didapatkan hasil bahwa
nilai Rf pada bayam hijau adalah 0,24 cm sedangkan pada bayam merah 0,25 cm,
sedangkan nilai kisaran Rf pada klorofil b (hijau kuning) 0,12-0,5 yang menunjukkan
bahwa nilai hasil pengamatan sesuai dengan nilai kisaran pada Rf.
Harga Rf adalah perbandingan jarak rambat suatu senyawa tertentu dengan
jarak perambatan baku pembanding. Jika zat uji yang diidentifikasidan baku
pembanding itu sama terdapat kesesuaian dalam warna dan harga Rf. Faktor-faktor
yang berpengaruh terhadap pembentukan klorofil antara lain gen, cahaya, dan unsur
N, Mg, Fe sebagai pembentuk dan katalis dalam sintesis klorofil. Semua tanaman
hijau mengandung klorofil a dan klorofil b. Klorofil a menyusun 75 % dari total
klorofil. Kandungan klorofil pada tanaman adalah sekitar 1% berat kering (Subandi,
2008 dalam Pratama dan Laily, 2015)
 BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Kromatografi merupakan metode pemisahan campuran atau larutan senyawa
kimia dengan absorpsi memilih pada zat penyerap, zat cair dibiarkan mengalir
melalui kolom zat penyerap, misalnya kapur, alumina dan semacamnya sehingga
penyusunnya terpisah menurut tingkat kepolaran senyawa, pada sebagian senyawa
perbedaan tersebut dapat dicirikan oleh adanya perbedaan warna.
Kromatograf terdiri dari kromatograf kertas, kromatograf kolom, kromatograf
lapis tipis, kromatograf gas dan kromatograf cair vakum. Sedangkan pigmen warna
pada tumbuhan terdiri dari klorofil a yang terdiri dari warna hijau tua, klorofil b yang
terdiri dari warna hijau muda, xantofil yang terdiri dari warna kuning, antosianin
bewarna merah ataupun ungu, dan karoten bewarna orange.
Dari hasil pengamatan yang telah dilakukan didapatkan data bahwa nilai Rf pada
klorofil a daun bayam merah maupun hijau tidak sesuai dengan interval profil a
melainkan lebih sesuai dengan interval klorofil b, namun pada hasil Rf klorofil b
sesuai dengan kisaran interval klorofil b. Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap
pembentukan klorofil antara lain gen, cahaya, dan unsur N, Mg, Fe sebagai
pembentuk dan katalis dalam sintesis klorofil.
5.2 Saran
Pratikum daring ini berjalan dengan baik namun materi tidak terlalu dapat difami
dikarenakan hanya menerima materi saja tanpa pratek lapang. Semoga pratikum
selanjutnya dapat berjalan dengan baik dan lancar serta ilmunya dapat dimengerti dan
dimanfaatkan dengan baik.
 Daftar Pustaka
Aisoi, Leonardo Elisa. 2019. Analisis Kandungan Klorofil Daun Jilat (Villebrune
rubescens, Bl.) Pada Tingkat Perkembangan Berbeda. Jurnal SIMBIOSA, 8 (1):
50-58
Aulia, S. Silma.,I. Sopyan dan Muchtaridi.2014. Penetapan Kadar Simvastatin
Menggunakan Kromatorafi Cair Kinerja Tinggi (Kckt) :Review. Jurnal Farmaka,
14 (4)
Pusat Pengembangan Dan Pemberdayaan Pendidik Dan Tenaga Kependidikan
Pertanian. 2018. Melaksanaka Analisis Secara Kromatografi Konvensional
Mengikuti Prosedur. Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan : Jakarta.
Rizalina, Hartias.,dkk. 2018. Optimasi Penentuan Kadar Metanol dalam Darah
Menggunakan Gas Chromatography. Indo. J. Chem. Sci. 7 (3)
Susanti, Meri dan Dachariyanus. 2005. Kromatografi Cair Kerja Tinggi. Universitas
Andalas : Padang