LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA TANAMAN

“KROMATOGRAFI”

Disusun oleh :

Nama : Maulana Rizal Santoso

NIM : 215040200111141

Kelas :N

Asisten : Haura Alammanda

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2022
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan

perbedaan pola pergerakan antara fasa gerak dan fasa diam untuk memisahkan
komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Fasa gerak dapat berupa
gas atau cairan, sedangkan fasa diam dapat berupa cairan atau padatan. Molekul
yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom cenderung akan bergerak lebih
lambat dibandingkan molekul yang berikatan lemah.

Didalam bagian tumbuhan terdapat banyak senyawa penting yang

bermanfaat bagi makhluk hidup lainnya, salah satunya ialah warna hijau daun
yang dihasilkan oleh pigmen warna yang disebut dengan klorofil antosianin
untuk warna ungu dan pigmen warna lainnya. Sehingga untuk mengetahui
kandungan warna yang terdapat pada tanaman digunakan teknik kromatografi.
Berdasarkan teknik kerjanya, kromatografi terbagi menjadi 4 macam, yaitu
kromatografi kertas, kromatografi kolom, kromatografi gas, kromatografi lapis
tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi.

1.2 Tujuan

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan distribusi atau pergerakan dari komponen-komponen melalui fasa
gerak dan fasa diam. Sehingga dengan dilaksanakannya praktikum biokimia
tanaman mengenai kromatografi memiliki tujuan yaitu untuk mengetahui jenis
pigmen serta proses pemisahan pigmen pada daun melalui teknik kromatografi,
yang pada tanaman biasanya digunakan kromatografi kertas.

1.3 Manfaat

Manfaat yang dapat diambil dari praktikum ini yaitu mahasiswa dapat
mengetahui pengertian dari kromatografi dan memahami teknik pemisahan
pigmen dengan metode kromatografi kertas.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi Kromatografi

 Metode kromatografi adalah metode pemisahan komponen dari suatu

campuran yang menggunakan dua fasa, yaitu fasa gerak (mobile phase)
dan fasa diam (stationary phase) (Lestari, 2010).
 Kromatografi berasal dari kata chromatography yang merupakan
penggabungan dari dua kata dari bahasa Yunani, yaitu chroma (bahasa
inggris: colour) yang berarti warna dan graphein (bahasa inggris: to write)
yang berarti menulis, sehingga pada awalnya kromatografi berarti menulis
dengan warna, dan dari badan International Union of Pure and Applied
Chemistry (IUPAC) mengartikan kromatografi berarti suatu metode yang
khususnya digunakan dalam pemisahan komponen-komponen dalam suatu
sampel yang terdistribusi dalam dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak.
 Menurut Sharma (2007), chromatography is a valuable technique for the
separation, purification and identification of the constituents of a mixture.
This technique was originally confined to the separation of coloured
substances such as plant pigments and dyestuffs. But the technique is now
well applied to colourless substances also. now chromatography has
become an advanced separation as well as purification technique that finds
application in almost all branches of science.
 Artinya :
kromatografi adalah teknik berharga yaitu pemisahan, pemurnian, dan
identifikasi unsur-unsur campuran. Teknik ini awalnya dilakukan secara
terbatas pada pemisahan zat berwarna seperti pigmen tanaman dan zat
warna. Namun untuk sekarang ini, teknik ini dapat diterapkan dengan baik
pada zat yang tidak berwarna. Sekarang kromatografi telah menjadi teknik
pemisahan dan pemurnian tingkat lanjut yang dapat diterapkan di hampir
semua cabang ilmu pengetahuan.
 Menurut Ahuja (2003), chromatography is essentially a physical method of
separation in which components to be separated are distributed between
 two phases, one of which does not move (appropriately called the
stationery phase) and the other that moves through it in a definite direction
(commonly described as the mobile phase).
 Artinya :
kromatografi pada dasarnya adalah metode fisik pemisahan di mana
komponen yang akan dipisahkan didistribusikan antara dua fase, salah
satunya tidak bergerak (secara tepat disebut fase stasioner) dan yang
lainnya bergerak melaluinya dalam arah tertentu (umumnya digambarkan
sebagai tahap).
 Chromatography is a general term applied to a wide variety of separation
techniques based on the partitioning or distribution of a sample (solute)
between a moving or mobile phase and a fixed or stationary phase.
Chromatography may be viewed as a series of equilibrating between the
mobile and stationary phase (Nielsen, 2010).
 Artinya :
Kromatografi adalah istilah umum yang diterapkan pada berbagai macam
teknik pemisahan berdasarkan pembagian atau distribusi sampel (zat
terlarut) antara fase bergerak atau bergerak dan fase tetap atau diam.
Kromatografi dapat dilihat sebagai rangkaian kesetimbangan antara fase
bergerak dan diam (Nielsen, 2010).

2.2 Macam – Macam Kromatografi

a) Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas merupakan contoh kromatografi partisi dalam
bentuk planar yang sudah sangat konvensional. Teknik ini umumnya
digunakan untuk menjelaskan teknik kromatografi secara mudah, karena
sistem kromatografinya yang sangat sederhana. Hanya butuh sepotong
kertas, tinta warna dan pelarut dalam suatu bejana saja. Teknik
kromatografi memiliki prinsip kerja yang sama seperti kromatografi
kolom, hanya sama konfigurasinya bukan kolom (column configuration)
tetapi datar/planar. Bila diamati secara sekilas, kertas seolah-olah berfungsi
sebagai fasa diam, padahal tidak. Kertas hanya sebagai penyokong saja.
 Pada prinsip kromatografi kertas mendasarkan proses pemisahan senyawa-
senyawa menurut interaksi partisi atau distribusi senyawa pada fasa diam
(Rubiyanto, 2016).
b) Kromatografi Gas
Kromatografi Gas (KG) atau Gas Chromatography (GC)
merupakan kromatografi dengan fasa geraknya adalah gas. Aplikasi
kromatografi gas (KG) untuk analisis laboratorium sampel gas dan uap
sangat luas. Jenis senyawa yang dapat dianalisis dengan kromatografi gas
umumnya memiliki karakteristik sebagai berikut: (1) digunakan untuk
senyawaan dengan titik uap tinggi (mudah menguap), (2) titik didih
rendah, (3) memiliki kestabilan termal sehingga dapat terlarut dalam fasa
gas. Komponen dasar yang umumnya terdapat pada kromatografi gas
adalah sistem fasa gerak (gas), alat penginjeksi sampel (sample injector),
kolom, detektor dan sistem pencatatan (recording system). Adapun jenis-
jenis detektor yang umumnya digunakan untuk kromatografi gas antara
lain adalah: Flame ionization detector (FID), Nitrogen-phosporous
detector (NPD), Flame photometric detector (FPD), Electron capture
detector (ECD), Thermal conductivity detector (TCD), Photoionization
detector (PID), dan GC/mass spectrometry (GC/MS) (Lestari, 2010).
c) Kromatografi Kolom
Senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi kolom memiliki
mekanisme yang sama dengan jenis kromatografi lain yaitu berkaitan
dengan perbedaan antara gaya-gaya antar molekul dalam sampel dengan
fasa gerak dan antara komponen dengan fasa diam. Tekniknya bergantung
pada kombinasi fasa diam dan fasa gerak yang dipilih, sehingga interaksi
yang timbul juga demikian. Kromatografi kolom (adsorbsi) merupakan
salah satu contoh kromatografi adsorbsi dengan karakternya yaitu:
Fasa diam : padat (misal: silika gel, alumina, karbon aktif, dan lain-lain)
Fasa gerak : cair (misal: aseton, etanol, dan lain-lain).
Sistem partisi juga dapat dibuat dengan memiliki fasa diam yang tepat
yang umumnya dapat diperoleh dengan memodifikasi adsorben agar tidak
aktif dan berfungsi sebagai penyokong (solid support) bagi fasa diam
sesungguhnya (Rubiyanto, 2016).
 d) Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance
Liquid Chromatography (HPLC), digunakan untuk senyawaan dengan
karakteristik yang memiliki titik didih yang tinggi dan tekanan uap yang
rendah (sulit menguap). Komponen dasar pada KCKT hampir sama
dengan kromatografi gas (KG), namun untuk KCKT fasa geraknya adalah
cairan. Komponen dasar KCKT antara lain adalah: (1) sistem fasa gerak
cairan, (2) alat penginjeksi sampel (sample injector), (3) kolom, (4)
detektor, (5) sistem pencatatan (recording system) (Lestari, 2010).
e) Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan teknik kromatografi
yang berdasar pada prinsip adsorbsi, bedanya dengan kromatografi kolom
yaitu konfigurasi KLT berbentuk planar (plate). Fasa diam berupa padatan
yang diaplikasikan berbentuk datar pada permukaan kaca atau aluminium
sebagai penyangganya, sedangkan pada fasa gerak berupa zat cair seperti
yang digunakan dalam kromatografi kolom dan kromatografi kertas
(Lestari, 2010).

2.3 Prinsip Kerja Kromatografi Kertas

Menurut Rubiyanto (2017), prinsip kerja kromatografi kertas dengan

menggunakan senyawa yang terlarut dalam fasa gerak akan melewati fasa diam
cair (pelarut lain) yang terletak pada suatu padatan pendukung. Peristiwa ini
mirip denfan ekstraksi cair-cair, tetapi dalam konfigurasi datar bukan kolom atau
tabung sehingga terjadi tendensi distribusi senyawa pada fasa gerak terhadap fasa
diam. Gerakan atau aliran senyawa terjadi karena adanya efek kapilaritas padatan
pendukungnya. Sepanjang padatan pendukung interaksi pun terjadi. Kecepatan
bergerak suatu komponen dalam campuran senyawa tergantung pada
kelarutannya dalam fasa diam. Senyawa-senyawa yang lebih ‘larut’ akan
bergerak lebih lambat daripada senyawa yang kurang ‘larut’. Adapun teknik
kromatografinya sebagai berikut :

a) Setetes cuplikan diletakkan pada daerah yang telah diberi tanda pada
permukaan kertas.
 b) Kertas yang telah ditotol dengan cuplikan diletakkan kedalam bejana
(chamber) yang telah diisi dengan sistem pelarut yang telah dipilih.
c) Pelarut akan bergerak melalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler dan
menggerakkan komponen-komponen dalam cuplikan dengan perbedaan
jaral tertentu menurut aliran pelarut. Perbedaan jarak ini disebabkan oleh
perbedaan interaksi senyawa dengan fasa-fasa yang ada.
d) Senyawa yang berwarna akan terlihat sebagai noda-noda yang terpisah.
Jika senyawa tersebut tidak membentuk warna, maka untuk mendeteksinya
digunakan pereaksi kimia atau penyinaran dengan lampu UV pada panjang
gelombang yang sesuai.

2.4 Pigmen Warna Pada Tumbuhan

Tumbuhan memiliki daun yang beragam warna, dimana beragamnya

warna daun pada tumbuhan memperlihatkan bahwa daun terdapat pula berbagai
pigmen seperti klorofil, karoten, xantofil dan warna-warna lainnya. Pigmen-
pigmen tersebut menduduki tempat yang khusus pada organel suatu tumbuhan.
Dengan menggukan kromatografi kertas dihasilkan beragam pigmen warna
diantaranya klorofil a, klorofil b, xantofil dan antosianin. Klorofil a berwarna hijau
kebiruan (hijau tua), klorofil b berwarna hijau kekuningan (hijau muda), xantofil
berwarna kuning dan antosianin berwarna merah/ungu ( Hernawati et al. , 2012).
Pada tumbuhan tingkat tinggi, klorofil a dan klorofil b merupakan pigmen utama
fotosintetik yang berperan menyerap cahaya violet, biru, merah dan memantulkan
cahaya hijau (Sumenda et al. , 2011). Antosianin merupakan kelompok pigmen
yang berwarna merah hingga biru yang tersebar luas pada tanaman. Antosianin
tergolong pigmen yang disebut sebagai flavonoid. Senyawa golongan flavonoid
termasuk senyawa polar dan dapat diekstraksi dengan pelarut yang bersifat polar.
Beberapa pelarut yang bersifat polar diantaranya etanol, air dan etil asetat
(Simanjuntak et al. , 2014).

2.5 Definisi Rf

Rf yang sering disebut dengan nilai faktor retensi, dimana nilai Rf adalah
rasio atau perbandingan dari jarak yang dipindahkan oleh suatu zat terlarut
terhadap jarak yang dipindahkan oleh garis depan pelarut selama waktu yang
sama. Nilai Rf yang identik untuk suatu senyawa yang diketahui dan yang tidak
diketahui dengan menggunakan beberapa sistem pelarut yang berbeda dengan
memberikan bukti yang kuat bahwa nilai untuk kedua senyawa tersebut adalah
identik, terutama jika senyawa tersebut dijalankan secara berdampingan di
sepanjang pita kertas yang sama (Day dan Underwood, 2002). Menurut
Rubiyanto (2016), senyawa-senyawa yang berbeda satu sama lain akan memiliki
perbandingan jarak tempuh senyawa terhadap jarak tempuh fasa gerak yang
berbeda dan nilai perbandingan tersebut dinamakan Rf (Retardation faktor). Nilai
Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fasa diam sehingga
nilai Rf sering juga disebut faktor retensi. Nilai Rf dapat dihitung dengan
menggunakan rumus berikut :

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak
bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi (Rinidar et al. , 2017).
 BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum kromatografi diantaranya ada kaca

arloji yang terbuat dari kaca bening yang biasanya digunakan untuk
menimbang dan menaruh bahan kimia atau untuk menaruh ekstrak bayam.
Spatula pada praktikum kromatografi digunakan untuk mengambil / membawa
ekstrak bayam. Selanjutnya ada penggaris / skala, penggaris / skala disini
digunakan untuk mengukur. Kertas filter biasanya digunakan untuk
memisahkan antara cairan dengan partikel suspensi. Gunting digunakan untuk
memotong bayam agar lebih kecil lagi. Pensil digunakan untuk membuat garis
horizontal pada kertas. Tabung kromatografi pada praktikum biasanya terbuat
dari kaca yang digunakan dalam proses kromatografi kertas. Mortar dan pestle
terbuat dari porselen, kaca atau batu granit yang dapat digunakan untuk
menghancurkan dan mencampurkan bayam yang sudah ada asetonnya.
Capillary tube / pipa kapiler digunakan untuk mengontrol (Anjasari, 2008)

Bahan yang digunakan untuk praktikum kromatografi antara lain daun

bayam yang digunakan sebagai spesimen dalam praktikum kromatografi.
Aseton 5 ml dan eter-aseton digunakan sebagai pelarut. Dan kertas sampel
digunakan untuk kertas sebagai sampel.

3.2 Cara Kerja

Menggunting daun bayam dan memasukkannya ke dalam mortar

Menambahkan aseton 5 ml

Menghaluskan daun bayam

↓
 Mengambil ekstrak bayam dengan spatula dan memindahkan ke gelas arloji

Menggambar garis horizontal pada kertas saring (2 cm dari ujung) menggunakan

pensil

Memindahkan 4-5 tetes ekstrak bayam ke kertas saring menggunakan tabung

kapiler

Memasukkan pelarut eter aseton ke biki kromatografi

Mencelupkan ujung kertas saring ke pelarut

Menunggu hingga mulai tampak perubahan warna

Mengambil kertas saring dan mengeringkannya

Mengamati hasil

3.3 Analisa Perlakuan

Pada praktikum biokimia tanaman mengenai “Kromatografi”, dilakukan

pengamatan untuk mengetahui pigmen warna serta nilai Rf (Faktor detensi)
pada daun bayam merah dan duan bayam hijau. Alat dan bahan yang digunakan
dalam pengamatan tersebut, diantaranya: bejana, mortal dan pistil, pipet tetes
dan beaker gelas, gelas ukur, timbangan analitik, kertas saringan, pial film,
pengaris dan pensil, aceton, larutan buffer, dan spesimen atau bahan yang
diamati yaitu daun bayam merah dan daun bayam hijau. Hal pertama yang
dilakukan dalam pengamatan adalah menyiapkan alat dan bahan, lalu
menimbang daun bayam merah dan bayam hijau yang masing-masing memiliki
berat sebanyak 3g. Haluskan daun bayam sampai halus dengan mortar dan
pistil. Setelah daun bayam halus, masukkan ke dalam fial film dan
menambahkan 10 ml aceton hingga menjadi pasta. Lalu pasta tersebut dikocok
hingga homogen dan kemudian didiamkan selama 5 menit. Setelah itu, teteskan
larutan bayam tersebut di atas kertas saringan dan tunggu hingga kering. Kertas
yang sudah ditetesi tadi dimasukkan dalam bejana kromatografi yg telah berisi
300 ml pelarut dan tunggu hingga 15 menit. Setelah pengamatan selesai, amati
perubahan yang terjadi dan hitung nilai Rf-nya.