BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Kromatografi merupakan salah satu metode analisis yang digunakan untuk memisahkan
atau menganalisis campuran kompleks suatu senyawa. Komponen yang akan dipisahkan
akan terdistribusi ke dalam dua fase, yaitu fase diam (stationary phase) dan fase gerak
(mobile phase). Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh seorang ahli botani asal Rusia,
yaitu Mikhail Semyonovich Tsvet (1901-1903). Tsvet pertama kali menemukan teknik
kromatografi dalam penelitiannya untuk memisahkan klorofil dari pigmen-pigmen lain pada
ekstrak tanaman. Pada penelitiannya, Tsvet menggunakan sebuah kolom gelas yang diisi
dengan kalsium karbonat untuk memisahkan pigmen tanaman. Bubuk kalsium karbonat ini
berfungsi sebagai penyerap (adsorben), Kromatografi digunakan untuk memisahkan
campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi
bekerja berdasarkan prinsip yang sama.
Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang
didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase
diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponenkomponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula.

1.2 Tujuan
Tujuan pembuatan laporan ini adalah agar mahasiswa memahami dan mampu menjelaskan :
a. Sejarah dan definisi Kromatografi
b. Kromatografi planar, kromatografi cair, dan Supercrtitical cairan kromatografi
1.3 Manfaat
Agar laporan ini berguna dalam pembelajaran dan sebagai referensi bagi mahasiswa pada
khususnya dan bagi pembaca pada umumnya.

BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Sejarah Kromatografi

Kromatografi merupakan salah satu metode analisis yang digunakan untuk memisahkan atau
menganalisis campuran kompleks suatu senyawa. Komponen yang akan dipisahkan akan
terdistribusi ke dalam dua fase, yaitu fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile
phase). Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh seorang ahli botani asal Rusia, yaitu
Mikhail Semyonovich Tsvet (1901-1903). Tsvet pertama kali menemukan teknik
kromatografi dalam penelitiannya untuk memisahkan klorofil dari pigmen-pigmen lain pada
ekstrak tanaman. Pada penelitiannya, Tsvet menggunakan sebuah kolom gelas yang diisi
dengan kalsium karbonat untuk memisahkan pigmen tanaman. Bubuk kalsium karbonat ini
berfungsi sebagai penyerap (adsorben), sehingga kolom tersebut dikenal dengan istilah
kolom adsorben. Metode ini kemudian diuraikan dalam sebuah pertemuan yaitu XI Congress
of Naturalists and Doctors di St. Petersburg pada tanggal 30 Desember 1901, sedangkan
cetakan pertama yang berisi tentang deskripsi metode ini dipublikasikan di dalam
Proceedings of the Warsaw Society of Naturalists, section of biology tahun 1903. Tsvet
pertama kali menggunakan istilah kromatografi dalam 2 papernya tentang klorofil dalam
jurnal botanical German, Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft pada tahun 1906.
Pada awal perkembangannya selama dua puluh tahun pertama, metoda kromatografi
berkembang sangat lambat. Pada tahun 1948, A. Tiselius dari Swedia mendapatkan hadiah
nobel dalam bidang kromatografi yaitu analisis dengan elektroforesis dan adsorpsi. Setelah
diperkenalkan metoda kromatografi partisi pada tahun 1952, metoda kromatografi menjadi
suatu metoda yang sangat universal. Metoda kromatografi banyak digunakan dalam bidang
biokimia, kimia organik maupun kimia anorganik, kimia analisa, kimia bakan pangan dan
bidang lainnya.
Pada perkembangan selanjutnya, kromatografi telah melibatkan alat bantu seperti
komputer dan alat bantu lain sehingga memperluas pemanfaatannya dalam berbagai disiplin
ilmu yang lain. Hal ini terbukti dengan lahirnya berbagai jenis kromatografi antara lain
2

kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS), kromatografi cair tekanan tinggi (HPLC)

serta kromatografi ion.
2.1.2 Definisi Kromatografi
Definisi kromatografi secara lengkap dikemukakan oleh Keulmans pada tahun 1959,
yang menyatakan bahwa kromatografi adalah salah satu metode analisis pemisahan secara
fisika, dimana komponen yang akan dipisahkan, didistribusikan diantara dua fasa yaitu fasa
diam dan fasa gerak.
Definisi kromatografi menurut IUPAC (International Union of Pure and Applied
Chemistry), kromatografi adalah metode yang digunakan terutama untuk memisahkan
komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fase yaitu
fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa padatan atau cairan yang dilapiskan pada
padatan atau gel.
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi
dari komponen-komponen campuran diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan
fase gerak (cair atau gas). Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah
kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka
teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition chromatography).
Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi
komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang
sama.
Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang
didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase
diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponenkomponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula.
2.1.3 Prinsip Dasar Kromatografi
Prinsip dasar kromatografi yaitu jumlah zat terlarut yang berbeda saat kesetimbangan
antara fase diam dan fase geraknya. Pemisahan dengan metode kromatografi dapat terjadi
apabila suatu molekul maupun senyawa memiliki beberapa sifat yang berbeda, antara lain:
a. Mempunyai kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut.

b. Mempunyai sifat kelarutan maupun sifat untuk berikatan yang berbeda satu sama lain
dengan fase diamnya.
c.

Memiliki sifat mudah menguap (volatil) pada temperatur yang berbeda.

Pemisahan secara kromatografi, menempatkan senyawa-senyawa yang akan dipisahkan

pada fasa geraknya yang kemudian mengalir melalui suatu sistem stationer (fase diam),
dimana selama proses pengaliran tersebut akan terjadi interaksi antara komponen
senyawa dengan fase diamnya. Selama berinteraksi akan terjadi proses pelarutan,
adsorpsi maupun penguapan dari komponen senyawa yang akan dipisahkan. Sifat-sifat
dari komponen penyusun senyawa tersebut akan menentukan apakah komponenkomponen tersebut mampu bergerak atau tidak dalam fase diamnya. Bila semua
komponen-komponen yang ada tidak dapat bergerak dalam fase diam, maka proses
pemisahan tidak mungkin dapat berlangsung. Apabila dapat bergerak, sejauh mana
kecepatan bergerak di antara komponen-komponen tersebut maupun perbedaan
kecepatannya dengan kecepatan fasa gerak yang dipakai pada sistem tersebut. Oleh
karena itu pada metoda kromatografi perlu dilakukan pemilihan fase gerak sedemikian
rupa sehingga semua komponen dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda
sehingga proses pemisahan dapat terjadi. Secara umum dapat dikatakan bahwa
kromatografi adalah proses migrasi diferensial dimana komponen-komponen sampel
ditahan secara selektif oleh fase diam.
2.2 Kromatografi Planar (Kromatografi Lapis Tipis)
Kromatografi planar adalah salah satu metoda kromatografi yang sangat sederhana namun
luas penggunaannya diantara berbagai teknik kromatografi lainnya. Kromatografi kertas,
seperti halnya kromatografi lapisan tipis, adalah contoh dari teknik kromatografi planar yang
banyak digunakan. Untuk melakukan pemisahan, hanya diperlukan sebuah bejana tertutup
berisi pelarut serta kertas atau pelat kromatografi sebagai media dimana akan terjadi proses
pemisahan. Optimasi yang baik dari teknik dan bahan yang digunakan mampu memberikan
pemisahan yang sangat efisien dan kuantifikasi yang cermat dan akurat. Teknik kromatografi
seperti ini dapat pula digunakan untuk keperluan pemisahan berskala preparatif.

Pada kromatografi planar, sejumlah tertentu larutan contoh, ditempatkan dengan cara
menotolkannya didekat salah satu sisi dari kertas/pelat kromatografi. Selanjutnya dilakukan
pengelusian dengan menempatkan kertas/pelat kromatografi tersebut di dalam suatu bejana
tertutup (bejana pengembang) yang telah dijenuhkan dengan uap pelarut yang akan digunakan
sebagai eluen. Keberadaan gaya kapiler akan mengakibatkan pelarut akan bergerak ke atas
sepanjang kertas/pelat dengan membawa serta komponen-komponen terlarut dari contoh yang
telah ditotolkan, jika terdapat perbedaan interaksi dari masing-masing komponen yang akan
dipisahkan dengan pelarut serta kertas/pelat kromatografi yang digunakan, maka komponenkomponen tersebut akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda-beda pula. Perbedaan
kecepatan migrasi inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan. Dari letak noda diatas
kertas/pelat, dapat diukur jarak migrasi dari masing-masing komponen yang telah terpisah.
Perbandingan jarak migrasi komponen ini dengan jarak migrasi eluen didefinisikan sebagai
faktor retensi (Rf). Nilai faktor retensi inilah yang dapat digunakan sebagai salah satu besaran
dalam identifikasi komponen-komponen yang dipisahkan.
Rf =

Jarak migrasi suatu komponen

Jarak migrasi eluen

Dalam kromatografi kertas, kemampuan penahanan komponen (retensi) oleh fasa diam
dinyatakan dengan besaran Rf (Rate of Flow). Harga Rf khas untuk setiap komponen pada
kondisi tertentu. Rf (= factor retardasi atau faktor retensi), yaitu perbandingan jarak yang
ditempuh oleh komponen dengan jarak yang ditempuh eluen. Harga Rf dipengaruhi oleh: suhu,
jenis kertas, tebal kertas, dan jenis eluen.
Menurut Rohman (2007), Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff
dan Schraiber pada tahun 1983. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi
kertas dan elektroforesis. Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang
seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat
aluminium, atau pelat plastik.
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam
karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh
gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Rohman,2007).

Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaanya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan
dengan kromatografi kolom. Demikian juga dengan peralatan yang digunakan, dalam
kromatografi ini peralatan yang digunakan lebih sederhana.
Keuntungan kromatografi planar adalah:
1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau
dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet
3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara
elusi 2 dimensi
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan
merupakan bercak yang tidak bergerak.
Teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan suatu adsorben yang disalutkan
pada suatu lempeng kaca sebagai fase stasionernya dan pengembangan kromatogram terjadi
ketika fase mobil tertapis melewati adsorben itu. Seperti dikenal baik, kromatografi lapis tipis
mempunyai kelebihan yang nyata dibandingkan kromatografi kertas karena nyaman dan
cepatnya, ketajaman pemisahan yang lebih besar dan kepekaannya tinggi (Pudjaatmaka, 1994).
2.2.1 Fase Diam KLT
Lapisan dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk KLT yang dihasilkan
oleh berbagai perusahaan. Panjang lapisan 200 mm dengan lebar 200 atau 100 mm. Untuk
analisis totalnya 0,1-0,3 mm, biasanya 0,2 mm. Sebelu digunakan, lapisan disimpan dalam
lingkunga yang baik lembab dan bebas dari uap laboratorium (Stahl, 1985).
Penjerap yang umum ialah silica gel, aluminium oksida, kieselgur, selulosa dan
turunannya, poliamida, dan lain-lain. Dapat dipastikan silica gel paling banyak digunakan.
Silica gel ini menghasilkan perbedaan dalam efek pemisahan yang terganyung kepada cara
pembuatannya sehingga silica gel G Merck, menurut spesifikasi Stahl, yang diperkenalkan
tahun 1958, telah diterima sebagai bahan standar. Selain itu harus diingat bahwa penjerap
seperti aluminium oksida dan silica gel mempunyai kadar air yang berpengaruh nyata terhadap
daya pemisahnya (Stahl, 1985).

2.2.2 Fase Gerak KLT

Menurut Rohman (2007), Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih
sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. System yang
paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organic karena daya elusi campuran kedua pelarut
ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.
Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:
1.

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan
teknik yang sensitive

2.

Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara
0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan

3.

Untuk pemisahan denga menggunakan fase diam polar seperti silica gel, polaritas fase
gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan nialai
Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut
non polar seperti metal benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan

4.

Solute-solut ionic dan solute-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut
sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan
tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan
meningkatkan solute-solut yang bersifat basa dan asam.

Gambar Kromatografi Kertas

Klip Kromatografi Kertas

2.3 Kromatografi cair

Pemisahan dengan kromatografi cair didasarkan pada distribusi zat terlarut antara fase
liquid mobile dan fase stasioner. Di HPLC (high-performance liquid chromatography),
partikel berdiameter kecil yang digunakan sebagai penunjang fase stasioner. Karena
tekanan penurunan terkait dengan kuadrat diameter partikel, tekanan relatif tinggi
diperlukan untuk memompa cairan melalui kolom HPLC efisien. Akibatnya, teknik ini juga
telah disebut tekanan tinggi kromatografi cair. di laboratorium klinis, HPLC adalah bentuk
yang paling banyak digunakan dari LC. Itu adalah teknik yang sangat serbaguna karena
berbagai macam mekanisme pemisahan, fase diam, pelarut, dan detektor yang telah
digunakan.
2.3.1

Instrument
Komponen dari liquid chromatograph diilustrasikan sebagai berikut

2.3.2

Reservoir pelarut
Pelarut yang digunakan sebagai fase gerak yang terkandung dalam pelarutwaduk.
Dalam bentuk yang paling sederhana, waduk kacabotol atau termos ke mana "feed
garis" untuk pompa yangdimasukkan. Untuk menghilangkan partikel dari pelarut, filter
inline adalahditempatkan pada sisi masuk dari garis pakan. Kebanyakan juga memiliki
saranasolusi sparging dengan gas seperti helium untuk menghapusoksigen terlarut
yang akan mengganggu respon dari beberapadetektor. Penghapusan gelembung gas
dan oksigen atau "degassing"juga telah dicapai dengan menerapkan vakum untuk
reservoiratau gas perangkat pertukaran ditempatkan di jalur aliran dari waduk.

2.3.3

Pengiriman Sistem Pelarut

Sistem pengiriman pelarut termasuk :
1. Katup
2. gradien pencampuran
3. sensor tekanan,
4. pulsa peredam, dan
5. pompa untuk memberikan aliran dikontrol dan pengiriman campuran pelarut yang
benar.
9

Beberapa jenis pompa telah digunakan dalam kromatografi cair. Misalnya, peristaltik
dan tipe diafragma pompa telah digunakan, tetapi mereka hanya cocok untuk
kromatografi tekanan rendah. Piston-jenis atau jarum suntik-jenis pompa yang
digunakan untuk mencapai tekanan yang lebih tinggi. Reciprocating pompa piston
biasanya digunakan untuk HPLC, dan tindakan reciprocating pompa menghasilkan
denyut yang diminimalkan dengan kontrol pompa dan pulsa peredam elektronik di
jalur aliran. Denyut aliran tidak diinginkan karena kenaikan kebisingan baseline
banyak detektor.
Sampai saat ini, batas tekanan atas sebagian besar aplikasi HPLC adalah sekitar 400
bar (6000 psi), tetapi beberapa sistem yang lebih baru yang dirancang untuk operasi
hingga setinggi 1.000 bar (15.000 psi) .15,21,32A, 67A, 73 seperti sistem yang disebut
UHPLC (untuk kinerja ultra-tinggi atau tekanan ultra-tinggi kromatografi cair).
Operasi pada batas tekanan yang lebih tinggi tidak hanya membutuhkan pompa
dirancang secara tepat, tetapi juga menempatkan beberapa kendala pada tabung,
sambungan, dan kolom.
Sistem untuk HPLC memiliki sensor tekanan untuk mendeteksi halangan mengalir
dan biasanya mematikan sistem di atas batas tekanan didefinisikan untuk mencegah
kerusakan komponen. Pada tekanan yang sangat tinggi, beberapa pelarut menjadi
sedikit kompresibel dan beberapa kompensasi untuk kompresi pelarut perlu dilakukan
untuk mencapai rates.21 aliran konstan ekstrim lain dari operasi terlihat pada tingkat
aliran yang sangat rendah untuk sangat kecil-menanggung mikofluida dan kolom
kapiler. Adaptasi tingkat aliran rendah (<10 uL / min) mungkin memerlukan sistem
pemompaan yang dirancang khusus atau pemisahan aliran output dari sistem pompa
standar. Penggunaan laju alir di nL kisaran / min telah disebut sebagaikromatografi
nanoflow dan telah digabungkan ke spektrometri massa oleh interface nanospray, yang
menawarkan efisiensi ionisasi yang sangat tinggi.
Berbagai teknik telah digunakan untuk beragam komposisi pelarut,
termasukpenggunaan beralih katup yang mengubah pelarut yang berbeda pada waktu
yang ditentukan,atau pencampuran dua atau lebih pelarut untuk membentuk gradien
pelarut. Gradien dapat dihasilkan oleh katup proporsi terkait dengan dua atau lebih
10

pelarut waduk sebelum inlet kepompa tunggal, atau dengan dua atau lebih pompa
terkait dengan pelarut yang berbeda. Output dari dua pompa melewati ke dalam ruang
pencampuran untuk benar-benar campuran pelarut, dan komposisi disesuaikan dengan
memvariasikan laju aliran dari dua pompa. mixer statis mengandalkan turbulensi aliran
yang dihasilkan, sedangkan mixer dinamis menggunakan pengaduk magnetik.
miscibility pelarut dan viskositas mempengaruhi pencampuran karakteristik; tidak
memadai pencampuran dapat mengakibatkan kinerja kromatografi jelek.
2.3.4

Sampel Injektor
Langkah pertama dari pemisahan LC adalah pengenalan aliquot dari sampel ke
dalam kolom melalui injector. Jenis yang paling banyak digunakan dari injector adalah
injektor tetap loop yang beralih ke dalam atau keluar dari jalur aliran melalui suntikan
manual atau otomatis. Dalam modus menyuntikkan, loop beralih ke jalur aliran, dan
sampel dilakukan hilir dan ke dalam kolom. loop terus sebagai bagian dari jalur aliran
sampai diaktifkan kembali ke posisi mengisi. karakteristik pentingsistem injeksi yang
mereka :
1. reproduktifitas,
2. jumlah akumulasi, dan
3. berbagai volume disuntikkan.
Beberapa injector otomatis memiliki kemampuan menyuntikkan beberapa
aliquot atau pencampuran sampel dan reagen untuk reaksi derivatisasi sebelum
injeksi. Pendinginan spesimen mungkin merupakan karakteristik penting yang
dibutuhkan untuk analisis spesimen dengan stabilitas yang terbatas, terutama
ketika batch besar spesimen akan dianalisis.

2.3.5

Pemanas kolom / Pendingin

Kontrol suhu kolom merupakan faktor dalam reproduksi dan efisiensi pemisahan
LC. Namun, tidak seperti pemisahan GC, di mana gradien suhu yang digunakan, di
pemisahan

LC,

suhu

kolom

konstan

dipertahankan.

Hal ini dicapai dengan menggunakan berbagai teknik seperti

1. kolom ruang,
2. jaket air,
3. temperature controlled selimut, atau
4. blok pemanasan / pendinginan.

11

Selain itu, operasi pada tingkat aliran tinggi mungkin memerlukan pemanas /
penukar, biasanya kumparan tabung dengan sifat pertukaran panas yang baik,
ditempatkan sebelum inlet kolom. Dalam operasi, suhu kolom stabil diperlukan untuk
menghasilkan direproduksi kali retensi. Selain itu, suhu kolom meningkat
1. menurunkan viskositas pelarut,
2. meningkatkan
laju
perpindahan

massa

antara

ponsel

dan

fasa diam, dan

3. memungkinkan penggunaan laju alir yang lebih tinggi dan waktu analisis
maka dipersingkat.
Stabilitas termal sampel, bagaimanapun, memberlakukan batas atas suhu. Juga,
dalam beberapa kasus, stabilitas sampel mungkin memerlukan pemisahan akan
dilakukan pada suhu berkurang. pekerjaan persiapan untuk protein kadang-kadang
dilakukan di kamar dingin atau lemari pendingin untuk mengurangi tingkat
denaturasi dan degradasi proteolitik. Beberapa sistem untuk kontrol suhu memiliki
kemampuan untuk beroperasi pada suhu di bawah suhu kamar melalui aksi
pendingin Peltier atau sistem pendingin lainnya. karakteristik penting dari kolom
pemanas / pendingin meliputi rentang suhu, keteguhan suhu, dan jumlah dan
panjang kolom yang mereka mengakomodasi.
2.3.6

Columns
Berbagai pilihan kolom yang tersedia untuk kromatografi cair berdasarkan
kombinasi dari bahan kemasan dan tubing diameter yang berbeda dan panjang. Kolom
sering termasuk filter inlet untuk menghapus partikulat; penjaga kolom pendek dengan
kemasan yang sama dapat digunakan untuk melindungi kolom pemisahan lebih mahal.
Penjaga kolom relatif murah diganti secara berkala dan memperpanjang umur dapat
digunakan kolom.
Ukuran kolom yang digunakan tergantung pada aplikasinya. Ukuran terbuka atau
tekanan rendah kolom, digunakan untuk aplikasi seperti desalting atau afinitas atau
pemurnian pertukaran ion, biasanya terkait dengan kapasitas yang diperlukan untuk
pemisahan. kolom gel filtrasi, seperti kolom centrifuge kecil yang digunakan untuk
desalting, dapat menampung spesimen sampai sekitar 10% dari volume kolom.

12

Ukuran kolom afinitas tergantung pada jumlah senyawa yang perlu dipisahkan dan
kapasitas bahan kemasan.

Dimensi kolom. kolom teknologi modern telah menghasilkan kolom dalam

dimensi yang berbeda dengan kecenderungan volume internal yang lebih kecil yang
berlaku untuk teknik analisis, terutama ditulis dgn tanda penghubung, (lihat Bab 14).
Untuk penggunaan di laboratorium klinis, kebanyakan kolom HPLC analitis yang dibuat
dari tabung yang terbuat dari stainless steel 316 yang memiliki diameter internal (ID)
mulai dari 0,3 mm sampai 5 mm dan panjang dari 50 mm sampai 250 mm (Tabel 13-1).
Kolom akhir fitting, yang memiliki volume nol mati dan frits untuk mempertahankan
partikel dukungan, digunakan untuk menghubungkan kolom ke injector di ujung inlet dan
detektor di ujung stopkontak. Umumnya, batas deteksi yang lebih rendah yang dicapai
dengan kolom memiliki ID lebih kecil. Ini kolom ID kecil yang diproduksi dari sempitbore (sekitar 2,1 mm ID) dan microbore (sekitar 1,0 mm ID) tubes.2,34 Selain
memberikan peningkatan efisiensi, kolom dengan menggunakan ID lebih kecil
mengalami penurunan volume fase gerak. Misalnya, 2-mm-ID kolom membutuhkan jauh
lebih sedikit pelarut dari-mm-ID 4.6 kolom(Lihat Tabel 13-1).

13

Kolom kapiler digunakan di LC dibangun dengan melapisi dinding dalam tabung silika
menyatu dengan film tipis fasa cair. Kolom ini bervariasi 0,1-0,5 mm ID dan 10 sampai
50 cm panjangnya.
Kolom Fase stasioner. Jenis fase diam dalam kolom adalah penentu utama selektivitas
dan resolusi pemisahan. Bentuk fisik yang khas dari fase diam biasanya adalah tempat
tidur

dikemas

partikel

kecil

atau

batang

berpori

monolitik.

Kemasan partikulat Kolom. Berbagai terlihat dalam partikel yang digunakan

untuk membentuk tempat tidur dikemas, dengan diameter partikel yang bervariasi 1,8-10
um. Seperti disebutkan sebelumnya, backpressure yang dihasilkan oleh tempat tidur
dikemas bervariasi sekitar terbalik dengan kuadrat diameter partikel. Dengan demikian,
penurunan dua kali lipat dalam hasil ukuran partikel di sekitar peningkatan empat kali
lipat di backpressure. pemisahan tekanan rendah, dengan bahan kemasan seperti dekstran
cross-linked dan agarosa, biasanya menggunakan partikel 50 sampai 200 m dengan
diameter.
Secara historis, pemisahan dengan HPLC di laboratorium klinik umum digunakan
partikel dari sekitar 5 m dengan diameter, tapi ada kecenderungan penggunaan partikel
semakin kecil memanjang sampai diameter <partikel 2 m.73 kecil menawarkan efisiensi
pemisahan yang lebih tinggi dengan tradeoff dari resistensi yang lebih tinggi pelarut
aliran dan kebutuhan untuk beroperasi pada tekanan yang lebih tinggi. Penggunaan
kolom dengan partikel berdiameter kecil telah menyebabkan generasi baru sistem HPLC
dengan batas tekanan hingga sekitar 1000 bar (15.000 psi), yang sekitar dua kali lipat
sampai tiga kali lipat lebih tinggi daripada kebanyakan sebelumnya HPLC systems.73
tekanan tinggi dapat memperkenalkan beberapa perubahan lain yang terkait dengan
kompresibilitas pelarut, pemanasan kompresi, dan diubah retensi times.
Jenis kemasan partikulat termasuk (1) terikat, (2) polimer, (3) kiral, dan bahan akses (4)
dibatasi.
Berikat Tahap kemasan. Dalam jenis kemasan, fase diam terikat secara kimia pada
permukaan partikel silika melalui ester silika atau silikon polimer linkage. kemasan fase
terikat
1. secara mekanik dan kimiawi stabil,
2. memiliki daya tahan lama, dan
3. memberikan yang sangat baik

14

kinerja kromatografi. Mereka tersedia untuk pertukaran ion dan baik normal-fase
dan kromatografi fase terbalik. Dalam fase-normal HPLC, kelompok fungsional dari
fase diam relatif polar dengan mereka yang fase gerak, yang biasanya terdiri dari
pelarut nonpolar, seperti heksana. Contoh kelompok fungsional polar untuk normalfase kemasan HPLC adalah kelompok silanol, amino, dan nitrile. Fase terbalik HPLC
membutuhkan fase diam nonpolar. Yang paling populer kemasan fase terbalik adalah
jenis C18,di mana molekul Octadecylsilane terikat untuk silikapartikel. Kolom
dengan oktadesil kemasan sering disebutkolom ODS [oktadesil silika (ODS)]. Fase
terbalik kolom retensi dan selektivitas karakteristik yang diubah melalui attachment
dari kelompok lain, seperti oktil, fenil, atau sianopropil, untuk silika
Polimer kemasan. Graphitized karbon atau kopolimer campuran digunakan sebagai
kemasan polimer (misalnya, polystyrene-divinylbenzene) atau lebih diderivatisasi
dengan pertukaran ion atau C4, C8, atau C18 kelompok fungsional. Kinerja kolom
diisi dengan kemasan ini sebanding dengan kolom berbasis silika dan stabil dari pH
2-13.
Kiral kemasan. kemasan kiral digunakan untuk enantiomer terpisah, yang
merupakan bentuk cermin-gambar dari senyawa yang sama. Di laboratorium klinis,
jenis kemasan yang digunakan untuk memisahkan dan mengukur enansiomer obat.
Pembatasan kemasan Access. Dengan jenis kemasan, permukaan luar dari partikel
dukungan dilindungi oleh jaringan hidrofilik. zat terlarut lebih kecil, seperti obat,
melewati jaringan ke dalam pori-pori, yang dilapisi dengan fase diam hidrofobik.
molekul protein besar ditolak akses ke inti dan melewati kolom. Kolom diisi dengan
akses packing terbatas memungkinkan injeksi langsung dari sampel biologis dengan
konsentrasi protein tinggi; ini melewati persiapan sampel dan meningkatkan akurasi
analisis.
Kolom monolitik. Sebagai lawan kolom dikemas dengan partikel diskrit, kolom
monolitik adalah silinder dari batang monolitik silica- atau polimer berbasis. kolom
tersebut memiliki struktur bimodal pori dengan pori-pori besar (sekitar diameter 2um) yang menciptakan kepadatan pori tinggi, dan yang lebih kecil (sekitar diameter
13-nm) yang menciptakan area permukaan internal yang besar. Mereka telah
ditemukan mampu pemisahan cepat efisien, karena memberikan tingkat aliran tinggi

15

dari kolom partikulat di backpressures wajar. Selain itu, mereka mampu perpindahan
massa yang cepat dan memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi. Punggung bawah
tekanan memberikan karakteristik kolom sangat direproduksi karena banyak faktor
yang menurunkan kolom partikulat dieliminasi (misalnya, kemasan bawah dan
penyaluran).

Batang

monolitik

yang

terbungkus

dalam

lembam

polytetrafluoroethylene (PTFE) tubing dan bertempat di tabung stainless steel. Pipa

lembam menghilangkan volume kekosongan di tabung stainless steel / monolitik
antarmuka batang, sehingga meningkatkan resolusi. Dua keuntungan tambahan dari
kolom ini adalah bahwa mereka dapat digunakan dengan aliran gradien fase gerak
(misalnya, meningkatkan laju alir pada akhir pemisahan), dan beberapa kolom dapat
digabungkan dalam seri untuk meningkatkan resolusi dengan sedikit peningkatan
aliran

tekanan

balik.

kolom

monolit

kapiler

juga

tersedia.

Kepentingan klinis, kolom monolitik yang digunakanuntuk melakukan pemisahan

fase terbalik peptida dan protein
2.3.7

Detectors
Berbagai jenis detektor telah digunakan sebagai monitor di chromatographs cair
(Tabel 13-2). Sebuah komponen kunci dan integral dari detektor tersebut adalah aliran
sel melalui mana eluat dari kolom kromatografi berlalu. analit terlarut dideteksi dan
sinyal elektronik yang dihasilkan.
Secara operasional, detektor digunakan secara individual atau terhubung dalam seri.
Selain itu, reaktor postcolumn telah sela antara kolom dan detektor untuk melakukan
reaksi kimia seperti reaksi ninhidrin dengan asam amino untuk menghasilkan produk
dengan sinyal yang lebih kuat dan lebih spesifik.
Fotometer dan spektrofotometer. UV dan fotometer terlihat mengukur energi radiasi
yang diserap oleh senyawa karena mereka mengelusi dari kolom kromatografi (lihat
Bab 10). detektor ini beroperasi di daerah energi radiasi dari 190-400 nm dan 400-700
nm, masing-masing. Perangkat yang serbaguna dan mendeteksi banyak zat terlarut
karena senyawa yang paling aromatik yang terdeteksi di daerah ultraviolet 250-300
nm, dan banyak senyawa lainnya yang terdeteksi di daerah ultraviolet 190-220 nm, di
mana amida, asam karboksilat, dan banyak kelompok lain memiliki absorbansi
substansial.

16

Fotometer dapat beroperasi sebagai fixed-panjang gelombang atau variabel-panjang

gelombang

detektor.

Kebanyakan

tetap-panjang

gelombang

UV

fotometer

menggunakan garis resonansi 254-nm intens yang dihasilkan oleh lampu merkuri
busur. Jenis detektor sangat sensitif dan mampu beroperasi di 0.005 Unit absorbansi
skala penuh (AUFS). Untuk memberikan detektor tetap-panjang gelombang dengan
fleksibilitas yang lebih besar, garis resonansi kurang intens lain dari lampu merkuri
digunakan. Atau, fosfor ditempatkan di antara lampu dan aliran sel, dan fluoresensi
dipancarkanyang dihasilkan dari eksitasi 254 nm digunakan sebagai cahaya
sumber. Pendekatan terakhir ini digunakan dalam dual-panjang gelombangfotometer
yang beroperasi pada dua panjang gelombang tetap (misalnya,254 nm dan 280 nm).
Intens 214-nm atau 229 nm resonansibaris dari seng atau kadmium lampu busur,
masing-masing, mungkin digunakan untuk deteksi pada panjang gelombang yang
lebih rendah, senyawa di mana lebih memiliki absorbansi yang kuat.

Tipe kedua fotometer adalah variabel-panjang gelombangdetektor. Ini beroperasi pada

panjang gelombang yang dipilih dari yang diberikanrentang panjang gelombang.
Sehingga detektor "disetel" untuk beroperasi padaabsorbansi maksimum untuk analit
tertentu atau mengatur analit;ini sangat meningkatkan penerapan dan selektivitasdetektor.
17

Keuntungan lain dari detektor ini adalah kemampuannyauntuk beroperasi pada panjang
gelombang yang lebih rendah (misalnya, 190 nm). karena lebihsenyawa (misalnya,
kolesterol) menyerap pada panjang gelombang yang lebih rendah,kemampuan ini
meningkatkan fleksibilitas dari detektor. Dipanjang gelombang yang lebih rendah,
namun, banyak pelarut menyerap sinar UVdan tidak dapat digunakan sebagai fase
mobile. Untungnya, asetonitrildan metanol, dua pelarut yang digunakan secara luas di
fase

terbalikkromatografi,

memiliki

serapan

UV

rendah

pada

200

nm.

array dioda juga digunakan sebagai detektor HPLC karena merekacepat menghasilkan
data spektral atas seluruh rentang panjang gelombangdari 190-600 nm di sekitar 10 ms.37
Selama operasi,array dioda detektor melewati cahaya polikromatik melaluialiran sel
detektor. cahaya yang ditransmisikan tersebar oleh difraksikisi dan kemudian diarahkan
ke array dioda, di mana intensitas cahaya di beberapa panjang gelombang dispektrum
diukur. detektor tersebut telah membantu dalamidentifikasi obat dalam urin dan serum.
Dalam prakteknya, perlu untuk menggunakan pelarut, pasangan ionagen, dan buffer
dengan absorbansi rendah pada panjang gelombangbunga untuk mempertahankan sinyal
latar belakang yang rendah. Air, asetonitril,metanol, isopropanol, dan heksana adalah
pelarut yang memungkinkan deteksi ultraviolet ke panjang gelombang 200 nm,seperti
buffer fosfat. Banyak pelarut lain dan buffer memiliki absorbansi substansial dalam
daerah ultraviolet yang mungkin membatasi deteksi ultraviolet. Juga, aliran sel volume
rendah

digunakan

dalam

HPLC

untuk

menghindari

pelebaran

pita.

Masalah dengan operasi detektor fotometri adalahyang outgassing yang terjadi

dalam pelarut saat keluar daritekanan tinggi kolom dan ke aliran-tekanan rendahsel
detektor. Karena detektor ini sangat sensitif,mereka mendeteksi gelembung ini sebagai
kebisingan yang mendegradasi signalto- yangrasio kebisingan detektor. degassing efektif
pelarut dan pemeliharaan beberapa tekanan balik di detektormembantu untuk
meminimalkan pembentukan gelembung.
Fluorometers. Seperti dibahas dalam Bab 10, fluoresensiterjadi ketika molekul
menyerap cahaya pada satu panjang gelombang danreemits cahaya pada panjang
gelombang yang lebih panjang. fluorometers onlinedigunakan dalam kromatograf cair
untuk mendeteksi senyawa fluorescingkarena mereka mengelusi dari kolom. detektor
fluoresensiumumnya lebih sensitif daripada yang fotometri. Sebagai tambahan,precolumn
18

atau postcolumn reaktor telah digunakan untukkimia tag senyawa dengan label
fluorescent untuk selanjutnyadeteksi. Misalnya, asam amino dan lainnyaamina primer
sering diberi label dengan dansil atau fluorescaminetag, diikuti oleh pemisahan HPLC
dan fluorometricdeteksi. Kebanyakan fluorometers digunakan dengan kromatograf
cairrelatif sederhana dalam desain dan sangat selektif dan sensitif untuk senyawa
fluoresens dalam rentang panjang gelombang operasi thedetector ini. Deuterium atau
xenon lampu busur atau laser telah digunakan sebagai sumber cahaya di detektor
tersebut.
Detektor elektrokimia. Dalam detektor elektrokimia amperometrik (lihat Bab 11
dan 30), suatuanalit electroactive memasuki aliran sel, di mana ia dapat teroksidasi atau
dikurangi padapermukaan elektroda bawah potential.70 Gunakan konstan beberapa
elektroda dan perubahan siklik dalam tegangan memungkinkan deteksi beberapa
komponen di berbagai potensi dan pembersihan siklik dari elektroda. senyawa
elektroaktif kepentingan klinis mudah dianalisis dengan HPLC dengan deteksi
elektrokimia termasuk katekolamin urin (lihat Bab 30), senyawa tiol yang mengandung
seperti homosistein, dan asam askorbat. Selain itu, tag elektrokimia aktif (misalnya,
bromin) ditambahkan untuk senyawa seperti asam lemak tak jenuh atauprostaglandin.
Detektor kuolometri juga digunakan. Ketika ditempatkan dalam seri, detektor
tersebut digunakan untuk mendeteksi dan mengukur senyawa coeluting yang berbeda
dalam potensi setengah-gelombang mereka (potensi di babak sinyal maksimum) oleh
setidaknya 60 mV.Detektor ini sangat selektif dan sensitif, dengan rentang respon linear
cukup lebar. Mereka digunakan di laboratorium klinis untuk analisis metanephrines, asam
vanillylmandelic, asamhomovanillic, dan asam asetat 5-hydroxyindole dalam urin
manusia tanpa persiapan sampel yang luas.
Low-sensitivitas detektor konduktivitas juga telah digunakan untuk memantau
gradienkomposisi garam bervariasi dalam kromatografi pertukaran ion. Aplikasi lain dari
detektorkonduktivitas adalah penggunaannya dalam ion chromatography.24 Elusi ion
dipisahkan oleh anion- atau kromatografi pertukaran-kation dapat dideteksi dengan
sensitivitas yang tinggi. Konduktivitas dari ion tertentu terkait dengan konsentrasi, biaya,
dan mobilitasnya. Teknik ini paling cocok untuk analisis ion anorganik dan organik kecil
yang memiliki mobilitas tinggi. Ini telah diterapkan untuk mengukur komponen seperti
sulfat dalam cairan biologis, tapi aplikasi utama dari teknik ini telah nonclinical.
19

Detektor Indeks bias. detektor ini merasakan perubahan dalam pembiasan cahaya
sebagai zat terlarut melewati sel alirannya. Mereka menawarkan cara zat mendeteksi,
seperti alkohol, polietilen glikol, garam, dan gula yang memiliki absorbansi rendah pada
panjang gelombang yang biasa digunakan untuk detection.35,60 spektrofotometri
Spektrometri massa. Seperti disebutkan sebelumnya, ketika gas atau cairan
kromatografi terhubung ke spektrometer massa (lihat Bab 14), gabungan atau "ditulis dgn
tanda penghubung" teknik yang disebut sebagai gas kromatografi-mass spectrometry
(GC-MS) dan kromatografi cair-spektrometri massa ( LC-MS) .23,59A, 69,69A teknik
yang sangat sensitif dan spesifik ini telah meningkatkan aplikasi di laboratorium klinis
dan penelitian dan di bidang muncul dari proteomics.4,18,27,43-45 Untuk banyak
aplikasi, kekhususan tinggi spektrometer massa tandem memungkinkan sangat singkat
HPLC berjalan untuk digunakan, karena sebagian besar senyawa tidak perlu benar-benar
terpisah.
Sebuah elemen penting dalam menghubungkan GC atau HPLC pada spektrometer
massa adalah antarmuka antara mereka. Sebagai contoh,antarmuka antara kromatografi
cair dan spektrometer massa memiliki tugas yang menantang menghilangkan molekul
pelarut dan mentransfer komponen dari larutan cair ke dalam bentuk biaya dalam vakum
untuk analisis oleh spektrometer massa. Oleh karena itu, semua buffer digunakan untuk
kromatografi harus stabil untuk menghindari kelebihan dan mencemari antarmuka. Untuk
alasan yang sama, katup beralih sering digunakan untuk mengalihkan garam dan
komponen unretained lainnya eluting di awal pemisahan HPLC untuk limbah. Katup
beralih kemudian mengarahkan bagian selanjutnya dari HPLC lari ke spektrometer
massa. Beberapa teknik ionisasi yang berbeda, termasuk electrospray, ionisasi kimia, dan
photoionization.
Detektor lainnya. Sejumlah jenis lain dari detektor telah digunakan dengan
chromatographs cair,tapi terutamauntuk aplikasi penelitian. Dinamis hamburan cahaya
detektor mengukurhamburan cahaya yang terkait dengan ukuran molekul dan telah
ditemukan berguna dalam menggambarkan ukuran molekul besar dan complexes.49
resonansi magnetik nuklir telah dilakukan pada spesimen melewati sel aliran dan
mungkin berguna untuk aplikasi seperti analisis lipoprotein, metabolomik, dan
karakterisasi metabolit obat. Telah ada minat pada detektor yang lebih sensitif daripada
20

indeks detektor bias untuk senyawa denganabsorbansi spektrofotometri rendah.

Jenis baru dari detektor juga telah dikembangkan yang menyediakan deteksi
hampir universal senyawa yang nonvolatile.35,60 Misalnya, dengan detektor hamburan
cahaya menguapkan pelarut diuapkan oleh nebulizing efluen kromatografi dengan aliran
gas. zat terlarut tidak mudah menguap tetap sebagai partikel dalam aliran gas, dan
partikel yang terdeteksi dengan mengukur hamburan cahaya pada sudut dari cahaya
insiden. hamburan cahaya sebanding dengan massa zat nonvolatile. Batas deteksi sekitar
1 ng untuk senyawa seperti glukosa telah dicapai. Potensi aplikasi termasuk analisis lipid,
gula, dan senyawa lain sulit untuk dideteksi photometrically. Tipe kedua dari detektor
menguapkan, detektor aerosol yang dikenakan, mengionisasi zat terlarut dengan debit
korona dan mengukur ion arus daripada hamburan cahaya. Pendekatan ini sangat sensitif
bagi sebagian besar senyawa. Kelemahan dari detektor menguapkan tersebut adalah
bahwa mereka menghancurkan spesimen sehingga komponen tidak dapat dikumpulkan
untuk analisis lebih lanjut atau digabungkan untuk analisis selanjutnya oleh detektor lain.
2.3.8

Sistem Controller dan Data System

Dengan menggunakan bentuk sederhana dari instrumentasi untuk kromatografi cair,
adalah mungkin untuk melakukan suntikan dan pompa penyesuaian manual dan
merekam hasil pada perekam grafik Strip. Ini mungkin cocok untuk pemisahan
preparatif jarang, tapi untuk aplikasi volume tinggi di laboratorium klinis, biasanya
ada suatu kepentingan mengotomatisasi suntikan dan berjalan kromatografi dengan
hardware dan software untuk sistem kontrol. Pengendali sistem mengelola
1. suntikan sampel;
2. pengiriman pelarut;
3. kontrol suhu
4. dan detektor;
5. memberikan catatan auditableanalis, metode, kalibrasi, kontrol, dan spesimen.
Sistem data mengambil ribuan titik data dari individumenjalankan dan
mengidentifikasi serangkaian puncak dengan parameter seperti retensikali, daerah
puncak, ketinggian puncak, dan lebar puncak. Perbandinganparameter ini dengan
orang-orang yang dihasilkan daribahan referensi menghasilkan identifikasi puncak dan
kuantitatifnilai-nilai. Software untuk analisis data menjadi lebih kritissebagai data
stream menjadi lebih besar, seperti dari dioda array dandeteksi spektrometri massa,
21

dan beberapa komponen yangdianalisis dalam menjalankan tunggal; perpustakaan

spektrum atau database laindicari untuk identifikasi senyawa, peptida, atausekuens
asam nukleat.
2.3.9

Keamanan
Tindakan pencegahan laboratorium yang normal harus dilakukan selamaoperasi
HPLC. Kebanyakan pelarut organik yang mudah terbakar. Itukolom limbah harus
dikumpulkan dalam sebuah wadah yang sesuaidan disimpan dengan benar sebelum
dibuang. Rilis peledaktekanan dalam sistem HPLC tidak bahaya besar; cairankompres
hanya sedikit dan karena itu menumpuk sedikit energi.

2.4 Supercritical Chromatography Fluid (SFC)

Di bawahtekanan, karbondioksida terjadi sebagai cairan yang memiliki beberapasifat yang
menguntungkan sebagai pelarut untuk chromatography.Ini memiliki viskositas rendah dan
koefisien difusi tinggi dan melarutkan banyak senyawa hidrofobik.Akibatnya, SFC
memiliki karakteristik kinerja agak menengah antara cair dan gas chromatography. Berbaga
ipengubah

organic

telahdicampurdengankarbondioksidauntukberfungsisebagaipelarut.

Kolom yang dikemas dengan berbagai fase stasioner yang samadengan yang digunakan
untuk kromatografi cair. Teknik ini telah digunakan untuk analisis lipid dan lainnya
komponen hidrofobik lainnya yang larut dalam karbondioksida cair. SFC telah diterapkan
untuk penelitian farmasi dan analisis produk alami tetapi, karena kebutuhan untuk peralatan
khusus, telah ditemukan penggunaan yang terbatas dalam laboratorium klinis .
2.4.1

Pengertian Supercritical Chromatography Fluid ( SFC )

Supercritical Chromatography Fluid adalah keadaan materi yang menengah antara gas
dan cair dalam sifat-sifatnya. Negara ini terbentuk ketika gas atau cairan pelarut
mengalami suhu dan kondisi tekanan melebihi titik kritistertentu. Suhu dan tekanan di
mana pint ini terjadi dikenal sebagai temperatur kritis dan tekanan kritis dan Karakteristik
pelarut. Di luar titik ini, pelaruttidak bersifat gas atau cairan, tetapi akan memiliki sifat
dari kedua fase. apakah Supercritical Chromatography Fluid bertindak lebih seperti gas
atau cairan akan tergantung pada tekanan dan temperatur .
Penggunaan fase gerak fluida superkritis di kromatografi adalah pertama kali diusulkan
pada tahun 1958 oleh J. Lovelock. Pertama penggunaan laporan aktual ini dalam sistem

22

kromatografi adalah pada tahun 1962 oleh Klesper et al, yang menggunakannya untuk
memisahkan porfirin termal-labil.
SFC sangat penting karena memungkinkan pemisahan dan penentuan kelompok
senyawa yang tidak mudah ditangani dengan baik GC atau LC. Senyawa ini (1) yang
baik nonvolatile atau termal labil sehingga GC adalah di-berlaku, dan (2)

tidak

mengandung kelompok fungsional yang membuat deteksi mungkin oleh spektroskopi

atau teknik elektrokimia bekerja di LC.
2.4.2

Teori Supercritical Chromatography Fluid

Sejak cairan superkritis memiliki sifat antara gasdan cair, penggunaannya sebagai fase
gerak menawarkan beberapa keunggulan. sifat fisik yang khas dari cairan, gas dan cairan
superkritis adalah sebagai berikut:
- Salah satu keuntungan adalah bahwa fluida superkritis memiliki kerapatandan
viskositas yang lebih rendah dari cairan. Hal ini menyebabka koefisien difusi yang
lebih besar untuk zat terlarut adalah SFCdari LC. Hal ini menyebabkan efisiensi yang
lebih baikdan Kecepatan yang linear optimum yang lebih tinggidi SFC dari LC .
Sistem diberikan oleh persamaan van Deemter.
H = A + B / u + Cu
- SFS memiliki kepadatan lebih tinggi dari gas, sehingga fase gerak memiliki lebih
besarkesempatan berinteraksi dengan zat terlarut di GC (yaitu, gas carrier).Hal ini
membuat fase gerak penting dalam menentukan retensizat terlarut pada sistem dan
memberikan lebih banyak fleksibilitas dalam mengoptimalkanpemisahan. Misalnya,
retensi zat terlarut dalam SFC dapat diubah denganmenggunakan kolom yang berbeda
(yaitu fase stasioner yang berbeda) seperti pada GC, atau denganmengubah kekuatan
-

fase mobile di LC.

Salah satu keuntungan utama dari SFC adalah kemampuannya untuk menggunakan
detektor tersedia untukbaik GC atau LC, seperti FID, UV-Vis, dan detektor
Fluoresensi. Inimemberikan berbagai baik deteksi universal dan selektif untuk

digunakan dalambaik analitis atau preparatif skala pekerjaan.

Tergantung pada fluida superkritis digunakan, itu juga

memungkinkan

untukmenggunakan SFC di T lebih rendah dari GC. Hal ini membuat lebih berguna
-

dalampemisahan senyawa yang tidak stabil secara termal.

Fase stasioner digunakan di SFC bisa sama dengan yang di LC seperti GC. Baik
dikemas atau kolom tabung-terbuka dapat digunakan.

23

Karena keunggulan ini, SFC umumnya dipandang sebagai suatu teknik yang
melengkapi kedua LC dan GC.
2.4.3

Instrumentasi
- Instrumentasi untuk SFC dapatndiperoleh secara komersial atauSistem beradaptasi
-

yang digunakan untukLC dan GC .

Perbedaan utama SFC dari LC atau GC sistem adalahperlu untuk mengontrol suhu
dan tekanan fase gerak. Hal ini harus dilakukanuntuk menjaga fase gerak sebagai
fluida superkritis pengendaliantekanan (density) darifluida superkritis juga dapat
digunakan untuk beragam kekuatan fase gerakselama elusi gradien di SFC.

2.4.4

Aplikasi
Sekarang, SFC telah diterapkan untuk berbagai macam bahan, termasuk produk alami,
obat, makanan, pestisida dan herbisida, surfaktanpolimer, dan aditif polimer, bahan bakar
fosil, dan bahan peledak danPropelan

24

BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Kromatografi merupakan salah satu metode analisis yang digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis campuran kompleks suatu senyawa. Prinsip dasar
kromatografi yaitu jumlah zat terlarut yang berbeda saat kesetimbangan antara fase
diam dan fase geraknya. Pemisahan dengan metode kromatografi dapat terjadi apabila
suatu molekul maupun senyawa memiliki beberapa sifat yang berbeda, antara lain
yaitu mempunyai kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut, mempunyai sifat
kelarutan maupun sifat untuk berikatan yang berbeda satu sama lain dengan fase
diamnya.
Kromatografi planar adalah salah satu metoda kromatografi yang sangat sederhana
namun luas penggunaannya diantara berbagai teknik kromatografi lainnya.
Kromatografi kertas, seperti halnya kromatografi lapisan tipis, adalah contoh dari
teknik kromatografi planar yang banyak digunakan.
Kromatografi cair adalah pemisahan dengan kromatografi cair didasarkan pada
distribusi zat terlarut antara fase liquid mobile dan fase stasioner. Di HPLC (highperformance liquid chromatography), partikel berdiameter kecil yang digunakan
sebagai penunjang fase stasioner. Karena tekanan penurunan terkait dengan kuadrat
diameter partikel, tekanan relatif tinggi diperlukan untuk memompa cairan melalui
kolom HPLC efisien.
Supercritical Chromatography Fluid adalah keadaan materi yang menengah antara
gas dan cair dalam sifat-sifatnya. Negara ini terbentuk ketika gas atau cairan pelarut
mengalami suhu dan kondisi tekanan melebihi titik kritistertentu. Suhu dan tekanan di
mana pint ini terjadi dikenal sebagai temperatur kritis dan tekanan kritis dan
Karakteristik pelarut.

3.2 Saran

25

Pembaca harus memahami bagaimana perkembangan kromatografi, sehingga dapat

berguna untuk lebih memahami dan memperdalam ilmu kedokteran dasar dan mohon
maaf apabila terdapat kekurangan dalam laporan ini.

DAFTAR PUSTAKA

Glen L. Hortin,Chromatography and Extraction.

file:///C:/Users/TOSHIBA/Downloads/Chromatography%20and%20extraksi.
26

https://cao.chem.ufl.edu/wp-content/uploads/sites/22/2015/01/Lecture28-2015.pdf?ecde33
Kristianingrum, Susila. 2011. Kromatografi Kertas. Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas
Brawijaya.

27