1

OLEH :
PUJI ANDINI
XI ANALIS KESEHATAN



SMK KESDAM VI/DIPONEGORO
2014

2
PENDAHULUAN
1. LATAR BELAKANG
Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michel Tswett, seorang ahli dari Botani Rusia, yang
menggunakan kromatografi untuk memisahkan klorofil dari pigmen-pigmen lain pada
ekstrak tanaman. Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yang terdiri dari dua kata yaitu
chromos yang berarti warna dan graphos yang berarti menulis. Meskipun kromatografi
diturunkan dari kata warna dan tulis, warna senyawa-senyawa tersebut jelas hanya
kebetulan saja terjadi dalam proses pemisahan ini. Tswett sendiri mengantisipasi
penearapan pada beraneka ragam sistem kimia. Seandainya karyanya segera ditanggapi dan
diperluas, beberap bidang sains mungkin akan lebih cepat maju. Demikianlah kromatografi
tetap tersembunyi sampai sekitar tahun 1931, ketika pemisahan karotenatumbuhan
dilaporkan oleh ahli sains organik terkemuka yaitu Kuhn. Penelitian ini menarik lebih banyak
perhatian dan kromatografi adsorsi menjad meluas pemakaiannya dalam bidang kimia hasil
alam.
Dalam analisa kimia suatu bahan sering dihadapkan pada pekerjan-pekerjaan seperti
menghilangkan konstituen pengganggu atau mengisolasi atau memekatkan konstituen yang
dikehendaki sebelum dilakukan identifikasi maupun pengukuran jumlahnya. Kromatografi
merupakan salah satu cara pemisahan yang dewasa ini telah banyak digunakan secara rutin
yang dapat dilaksanakan dengan waktu yang sangat simgkat dengan peralatan yang relatif
sederhana dan murah. Walaupun cara kromatografi merupakan cara pemisahan, namun
banyak diantara cara ini yang digunakan untuk analisa secara kuantitatif.
Teknik kromatografi merupakan teknik pemisahan yang sangat sensitif. Selain dapat
memisahkan campuran zat warna, teknik juga dapat menunjukkan residu nikotin dalam
darah dari orang yang duduk dekat seorang perokok ketika naik bus kota. Selain itu
kromatografi juga dapat memisahkan campuran kompleks, seperti minyak bumi yang
merupakan campuran dari puluhan bahkan ratusan senyawa yang terkandung didalamnya,
dan masih banyak lagi keunggulan dari pemisahan dengan teknik kromatografi lainnya.
2. DEFINISI KROMATOGRAFI
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa
molekul) yang berada pada larutan. Kromatografi merupakan metode fisika untuk
pemisahan dimana komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan antara dua
fase, salah satunya merupakan lapisan stationer dengan permukaan yang luas dan fase yang
lain berupa zat cair (fluid) yang mengalir lambat (perkolasi) menembus atau sepanjang
lapisan stationer tersebut.

3
Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase
diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih
lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul
dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.
Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi
komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang
sama.Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang
didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase
diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-
komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula.Kita akan melihat
alasannya pada halaman selanjutnya.
Pada prinsipnya semua cara pemisahan kromatografi mengalami proses yang sama yaitu
adanya distribusi komponen-komponen dalam fasa diam dan fasa gerak dengan
memanfaatkan perbedaan-perbedaan sifat-sifat fisik komponen yang akan dipisahkan
(Mulja, 1995).
Perbedaaan sifat tersebut diantaranya :
Kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut
Sifat untuk bertaut (adsorpsi) yang berbeda satu sama lain dengan suatu serbuk
bahan padat
Sifat dapat menguap pada temperatur yang berbeda satu sama lain.
Kromatografi jenis ini memakai fase diam cair dan fasa gerak cair. Pemisahan komponen-
komponen akan sangat tergantung pada perbedaan Kd (Koefisien distribusi) molekul-
molekul yang dipisahkan. Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya
sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas
adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas
yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam
pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Bisa
menggunakan: air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan.
Berdasarkan asas terjadinya proses pemisahan maka kromatografi dibedakan menjadi 4
(Mulja, 1995), yaitu :
a) Kromatografi dengan asas adsorpsi.
Kromatografi jenis ini menggunakan fasa diam padat dan fasa gerak cair atau gas.
Pemisahan komponen-komponennya akan sangat bergantung pada perbedaan polaritas
molekul-molekul yang akan dipisahkan.
b) Kromatografi dengan asas partisi.

4
Kromatografi jenis ini memakai fasa diam cair dan fasa gerak cair. Pemisahan komponen-
komponen akan sangat tergantung pada perbedaan Kd (Koefisien distribusi) molekul-
molekul yang dipisahkan.
c) Kromatografi dengan asas filtrasi.
Kromatografi jenis ini memakai fasa padat yang mempunyai sifat filtrasi terhadap komponen
yang mempunyai massa molekul relatif (Mr) yang tinggi dan fasa padat tersebut dimiliki
oleh gel atau sejenisnya sedangkan fasa geraknya adalah cairan. Kromatografi dengan dasar
filtrasi ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk (struktur dan ukuran molekul).
d) Kromatografi dengan asas suhu kritik.
Pada dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi gas, sebagai fasa mobil dipakai
CO
2
dalam keadaan superkritik.Secara teori, pemisahan kromatografi yang paling baik akan
diperoleh jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya sehingga terjadi
keseimbangan yang baik antara fase gerak dan fase diam. Persyaratan kedua agar
pemisahan baik adalah fase gerak bergerak dengan cepat sehingga difusi yang terjadi
sekecil-kecilnya. Untuk memperoleh permukaan fase diam yang luas, maka penjerap atau
fase diam harus berupa serbuk halus. Sedangkan untuk memaksa fase gerak bergerak cepat
melalui fase diam yang berupa serbuk halus, harus digunakan tekanan tinggi. Persyaratan
tersebut menghasilkan teknik high pressure liquid chromatography, yang selanjutnya lebih
dikenal sebagai high performance liquid chromatography (HPLC) atau kromatografi cair
kinerja tinggi (Gritter et al., 1991).Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan
fasa mobil dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil
dan mekanisme pemisahannya, seperti ditunjukkan di Tabel dibawah ini.

Tabel Klasifikasi kromatografi
Kriteria Nama
Fasa mobil
Kromatografi cair, kromatografi gas
Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi
Mekanisme
Kromatografi pertukaran ion
kromatografi gel
Fasa
stationer
Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis,
kromatografi kertas

Ada beberapa cara dalam mengelompokkan teknik kromatografi. Kebanyakan berdasarkan
pada jenis fase yang digunakan (fase gerak dan fase diam) misalnya kromatografi gas dan
kromatografi cairan. Cara pengelompokkan lainnya berdasarkan teknik yang digunakan.

5
Disini metode kromatografi sebagian dikelompokkan berdasarkan macam fase yang
digunakan dan sebagian lainnya berdasarkan pada mekanisme pada distribusi fase.
1. Kromatografi cairan-padat atau kromatografi serapan.
Ditemukan oleh Tswett dan dikenalkan kembali oleh Kuhn dan Lederer pada tahun 1931,
telah digunakan secara luas untuk analisis organik dan biokimia. Pada umumnya sebagian isi
kolom adalah silika gel atau alumina yang mempunyai angka banding luas permukaan
terhadap volume sangat besar. Sayangnya hanya ada beberapa bahan penyerap, maka
pemilihannya sangat terbatas. Keterbatasan yang lebih nyata pada kenyataan bahwa
koefisien distribusi untuk serapan kerap kali tergantung pada kadar total. Hal ini akan
menyebabkan pemisahan tidak sempurna.
Contoh :
- Kromatografi orisinil Tswett dengan larutan eter petroleum dan kolom CaCO
3
.
- Kromatografi pertukaran ion.
2. Kromatografi cairan-cairan atau kromatografi partisi.
Dikenalkan ole Martin dan Synge pada tahun1941, dan kemudian mendapatkan hadiah
Nobel untuk hal itu. Fase diam terdiri dari lapisan tipis, cairan yang melapisi permukaan dari
padatan inert yan berpori-pori. Ada banyak jenis kombinasi cairan yang dapat digunakan
sehingga metode ini sangat berguna. Lebih lanjut koefisien distribusi sistem ini lebih tidak
bergantung pada kadar, memberikan pemisahan lebih tajam
Contoh :
- Kromatografi partisi pada kolom gel silika
- Kromatografi kertas
3. Kromatografi gas-padat
Digunakan sebelum tahun 1800 untuk memurnikan gas. Pada waktu dulu teknik tidak
berkembang karena keterbatasannya sama seperti halnya kromatografi cairan-padat, tetapi
penelitian lebih lanjut dengan macam fase padat baru memperluas panggunaan teknik ini.
4. Kromatografi gas-cairan
Merupakan metode pemisahan yang sangat efisien dan serba guna. Teknik lebih
menyebabkan revousi dalam kimia organik, sejak dikenalkan pertama kali oleh James dan
Marthin pada tahun 1052. hambatan yang paling utama ialah bahan cuplikan harus
mempunyai tekanan uap paling tidak beberapa liter pada suhu kolom, sistem ini sangat baik

6
sehingga dapat dikatakan sebagai metode pilihan dalam kromatografi karena daat
memisahkan dengan cepat dan peka.
5. Kromatografi penukar ion
Merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya sistem ini khusus
digunakan untuk spesies ion. Penemu resin sintetik dengan sifat penukaran ion sebelum
perang dunia II telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah dan asam amino.
6. Penyaringan gel
Penyaringan gel merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi
dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat
menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-
molekul berdasarkan ukurannya. Molekul-molekul dengan berat molekul antara 100 sampai
beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan
bentuk serupa yang menggunakan polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.
7. Elektroforesis
Elektoforesis merupakan kromatografi yang diberi medan lstrik disisinya dan tegak lurus
aliran fase gerak. Senyawa bermuatan positif akanmenuju ke katoda dan anion menuju ke
anoda,sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan.
8. Kromatografi kertas
Pada kromatografi kertas senyawa-senyawa yang dapat dipisahkan dapat diambil dari kertas
dengan jalan memotong noda (spot) yang kemudian melarutkan secara terpisah.
Setetes dari larutan cupikan yan gmengandung sejumlah komponen yang dipisahkan dengan
cara diteteskan pada daerah yang diberi tanda diatas sepotong kertas saring dimana ia akan
meluas membentuk noda yang dibuat. Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam
bejana tertutup yang telah berisi pelarut sebagai fase gerak dimana ujung yang dengan
dengan cuplikan tercelup (noda harus tidak tercelup, sedikit diatas permukaan pelarut).
Pelarut bergerak melalui serta-serta dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan
komponen-kpmponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran
pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau
setelah waktu yang telah ditentukan, maka kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari
permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-
senyawa tidak berwarna maka harus dideteksi dengan metode kimia atau fisika. Cara yang
biasa adalah menggunsksn suatu pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap
beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Sering juga menggunakan cara deteksi dengan
sinar ultra violet atau teknik radiokimia.

7
Beberapa contoh kromatografi yang sering digunakan di laboratorium diberikan di bawah
ini.
a. Kromatografi partisi
Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan
pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi
partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut
didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus
pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang
antar partikel yang ter adsorbs.Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom
yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik
(Gambar 12.3). Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau
pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel
kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben.
Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom.
Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang
teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan
mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk
masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat
terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan. Akhirnya,
masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen
murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut.
R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).
b. Kromatografi kertas
Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme
pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni
selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung
dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar
wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran
zat-zat ini dapat digunakan.Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam
amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-
asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi),
pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad
19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi
mereka.
Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama
yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat
campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena

8
kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada
selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses
dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R,
masing-masing asam amino diidentifikasi.
Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil,
dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.
c. Kromatografi gas
Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa
padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair). Umumnya, untuk
kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina
teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang
panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon
dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon
monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.
Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di
permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa
diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur
dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara
fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut
dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis
senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak
mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik
ini.Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya.
Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa.
Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya,
akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah
tujuannya analisik atau preparatif.

3. PRINSIP KROMATOGRAFI
Pemisahan yang terjadi dalam kromatografi dilaksanakan sedemikian rupa dengan
memanipulasi sifat-sifat fisik umum dar suat senyawa atau molekul yaitu :
Kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam cairan (kelarutan)
Kecenderungan suatu molekul untuk bertaut dengan suatu serbuk bahan padat
(absorbsi)
Kecenderungan suatu molekul untuk menguap (volatilitas)

9
Dalam kromatografi, senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan pada situasi
dinamik (bergerak) yaitu dengan melakukan pengaliran dan selama itu akan terjadi peristiwa
pelarutan, absorbsi atau penguapan.
Untuk menerangkan suatu proses pemisahan diambil suatu contoh yang berada dala situasi
statik (diam). Jika suatu senyawa ditaruh dalam corong pemisah yang berisi dua macam
pelarut yang sukar bercampur (misalnya air dan eter) , maka senyawa tersebut akan
terdistribusi (partisi) diantara kedua pelarut tersebut. Dalam hal ini sifat kelarutan sangat
berperan dalam proses pemisahan. Bila suatu senyawa dimasukkan kedalam cairan yang
berisi serbuk absorben (misalnya arang), maka senyawa tersebut akan terdistribusi diantara
cairan dan absorben. Maka dalm hal ini sifat kelarutan dan absorbsi berperan dalam proses
pemisahan tersebut. Demikian pula bila suatu senyawa yang mudah menguap (volatil)
dilarutkan dalam cairan yang non volatil yang biasanya berwujud suatu lapisan film, maka
senyawa tersebut akan terdistribusi diantara lapisan film cairan dan gas yang kontak dengan
lapisan film tersebut. Dalm hal ini sifat kelarutan dan volatilitas berperan dalam proses
pemisahan tersebut.

METODOLOGI PERCOBAAN
1. Alat dan Bahan
alat-alat :
Gelas kimia 100 mL
Gunting
Penggaris








Bahan :
Aseton
Tinta Biru
Alkohol
Tinta Merah
Ekstrak Pandan
Sari bunga rosela
Akuades
Kertas saring

10