Pengantar

Kromatografi
Kelompok iv
 KELOMPOK IV

Julkarnain Adi Satrio M. Hisna Sayyidani Muhammad Fadhel Nadiva Maharani Putri
(2007110361) (2007113910) Maulana (2007134759)
(2007134757)

Natasya Falda Dani Salman Marzuki Sherina Septiyani

(2007110690) (2007110356) (1807113279)
 Pokok Bahasan
Pengertian, Tujuan dan Kegunaan
Kromatografi

Pengaplikasian serta kekurangan dan Kromatografi

kelebihan kromatografi

Bagian-bagian alat kromatografi dan

Prosedur kromatografi
kegunaannya
 01
Pengertian, Tujuan dan
Kegunaan Kromatografi
 PENGERTIAN
Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran
senyawa atas komponen-komponen berdasarkan
perbedaan kecepatan migrasi masing-masing
komponen diantara dua fasa yaitu fase diam dan fase
bergerak. Perbedaan kecepatan perpindahan tersebut
dapat disebabkan oleh perbedaan kemampuan
masing-masing komponen untuk diserap (adsorpsi)
atau perbedaan distribusi diantara dua fasa yang tidak
saling bercampur.
Jenis kromatografi berdasarkan teknik kerja yang digunakan

Kromatografi Kolom

Merupakan metode terbaik untuk melakukan pemisahan campuran dalam jumlah yang besar di mana fase gerak
nya dapat berupa zat cair dan fase diam nya dapat berupa zat padat.
Jenis kromatografi berdasarkan teknik kerja yang digunakan

Kromatografi Kertas

Merupakan teknik suatu pemisahan di mana fase diam nya berupa zat cair. Salah satu zat padat dapat digunakan
untuk menyokong fase diam yaitu contohnya bubuk selulosa. Kemudian dilakukan pemisah antara asam amino
dan peprida. Peprida yang merupakan hasil hidroksida protein dengan suatu cara di mana kolom yang berisi
bubuk diganti dengan lembaran-lembaran kertas dan kemudian diletakkan dalam bejana tertutup yang berisi
oleh uap penuh. Larutan ini adalah air yang di sokong oleh molekul selulosa dari kertas tersebut. Fase gerak ini
biasanya merupakan campuran dari satu atau dari lebih dari satu Pelarut atau beberapa organik dan air.
Jenis kromatografi berdasarkan teknik kerja yang digunakan

Kromatografi Gas

Merupakan metode kromatografi yang dinamis untuk memisahkan dan sebagai pendeteksi senyawa senyawa
yang mudah menguap dalam suatu campuran. Pemisahan pada kromatografi gas ini didasarkan pada.suatu
senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solute dengan fase diam yang terjadi
fase gerak pada kromatografi gas ini dapat berupa gas yang akan mengetahui solute dari ujung kolom lalu akan
menghantarkan kepada detektor yang ada.
Jenis kromatografi berdasarkan teknik kerja yang digunakan

Kromatografi Lapis Tipis

Merupakan suatu proses pemisahan yang di mana terdapat fase gerak yang dapat berupa zat cair, sedangkan fase
diam nya berupa zat padat. Pada Kromatografi lapis tipis ini, berfungsi untuk pemisahan secara kuantitatif yang
cepat dan sering digunakan dengan menggunakan mikroskop
 Tujuan Kromatografi
Kromatografi adalah sebuah teknik dalam penelitian yang digunakan untuk memisahkan komponen
campuran menjadi bagian-bagian partikel penyusun komponen tersebut. Hal ini dilakukan untuk
melakukan pemurnian terhadap sebuah komponen campuran dengan melihat karakteristiknya seperti
ukuran, massa, bentuk, dan lainnya.
Kegunaan kromatografi – dalam bidang sains

Analisis
Menguji suatu campuran,
komponen-komponennya dan
hubungan antar komponen.
pemurnian
Memisahkan pengotor atau
senyawa tertentu yang
dikehendaki.

identifikasi
Menentukan jati diri campuran
kualitatif
Menentukan jumlah atau
atau komponen-komponennya
konsentrasi campuran tertentu
menggunakan senyawa
komponen-komponennya.
standar.
Kegunaan kromatografi – dalam Kehidupan sehari-hari
BADAN LINGKUNGAN
Perusahaan FERMENTASI
Penentuan jumlah bahan aktif dalam produk HIDUP
Pengujian polutan, kualitas lingkungan, dll.
obat.

RUMAH SAKIT PABRIK KIMIA

Mendetteksi komponen-komponen dalam Pemurnian bahan untuk membuat produk.
darah pada tubuh pasien.

PENEGAKAN HUKUM
Menguji barang bukti khusus yang dijumpai
di TKP.
 02
kromatografi
kromatografi
Kromatografi adalah metoda untuk pemisahan
campuran senyawa dalam suatu sampel berdasarkan
perbedaan interaksi sampel dengan fasa diam dan fasa
gerak. Fasa diam dapat berupa padatan atau cairan yang
diletakkan pada permukaan fasa pendukung. Fasa gerak
dapat berupa gas atau cairan.
 Interaksi pada proses kromatografi

Interaksi Adsorpsi

Senyawa diserap oleh permukaan padatan dan terjadi kesetimbangan jumlah dalam fasa diam dan fasa gerak.
 Interaksi pada proses kromatografi

Interaksi Partisi

Lapisan cairan sebagai fasa diam yang diembankan pada suatu padatan akan mendistribusikan senyawa yang akan
dipisahkan dan membentuk keseimbangan dengan fasa gerak.
 Interaksi pada proses kromatografi

Interaksi Moleculer Ekslusi/Permease Gel/Gel Filtrasi

Teknik pemisahan berdasarkan ukuran molekul. Dalam keadan ideal, tidak ada keterikatan senyawa pada fasa
diam.
 Interaksi pada proses kromatografi

Interaksi Afinitas

Merupakan kromatografi yang menggunakan interaksi spesifik antara molekuljenis tertentu dengan molekul lain
yang terikat secara kovalen pada fasa diam
 Jenis – jenis kromatografi
Berdasarkan Teknik Kerja yang digunakan,
antara lain:
1. Kromatografi Kertas
2. Kromatografi Lapis Tipis
3. Kromatografi Kolom
4. Kromatografi Gas
5. Kromatografi Cair
1. Kromatografi kertas
 Kromatografi kertas termasuk kromatografi cair-cair dengan kertas sebagai zat pendukung
(fase diam) karena kertas atau serat-serat selulosa merupakan adsorben lemah yang
hidrofil, adsorbsi zat oleh kertas tidak terlalu kuat dan terdesak oleh air.
 Kromatografi kertas umumnya lebih bermanfaat untuk tujuan identifikasi, karena mudah
dan sederhana. Dalam kromatografi kertas, pembanding jarak rambat (diukur sampai titik
yang memberikan intensitas maksimum pada bercak) suatu senyawa tertentu terhadap jarak
rambat fase gerak, diukur dari titik penotolan.
Prinsip dasar dari kromatografi kertas adalah partisi
multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling
tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi dalam
pelarut yang bergertak lambat pada kertas, komponen-
komponen bergerak pada laju yang berbeda dan
campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak
warna.
2. Kromatografi lapis tipis
 Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari satu sampel yang ingin
dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran.
 Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah silika atau alumina yang seragam pada
sebuah lempeng gelas atau logam atau plastic yang keras.
 Metoda ini adalah metoda sederhana dan cepat untuk memisahkan campuran senyawa organik.
Teknik ini sering digunakan untuk menentukan pigmen dalam tanaman, menganalisis komposisi
pewarna serat, dan mengidentifikasi insektisida atau pestisida dalam makanan.
Prinsip kerja kromatografi lapis
tipis
 Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel,
alumina dan serbuk selulosa. Fasa gerak merupakan pelarut
atau campuran pelarut yang sesuai.
 Senyawa yang berbeda dalam campuran bergerak ke atas
kaca slide dengan kecepatan yang berbeda, meninggalkan
bintik-bintik di lokasi yang berbeda pada fase diam.
 Bintik-bintik yang terpisah ini kemudian divisualisasikan
dengan sinar ultraviolet.
3. Kromatografi kolom
 Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam campuran.
 Fasa diam yang digunakan adalah suatu adsorben padat (biasanya silica gel atau alumina).
Fasa gerak atau eluen berupa campuran cairan alami
 Metoda pada kromatografi
 kolom
Pada metoda kering, kolom diisi dengan fasa diam kering, diikuti dengan penambahan fasa
gerak yang disiramkan pada kolom sampai benar-benar basah.
 Pada metoda basah, bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada serbuk fasa
diam dan dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Larutan senyawa organic dipipet di bagian
atas fasa diam, kemudian eluen dituangkan pelan-pelan melewati kolom.
Prinsip dasar dari kromatografi kolom sendiri adalah
adsorpsi dan patisi. Adsorpsi adalah mekanisme berupa
komponen sample secara selektif diadsorpsi oleh
permukaan fasa diam. Partisi adalah mekanisme berupa
komponen sample secara selektif terpartisi antara eluen
dan lap. Cair tipis yang terikat pada padatan pendukung
inert.
4. Kromatografi gas
 Untuk zat yang tidak berbentuk gas harus dimodifikasi terlebih dahulu agar bisa menguap
menjadi gas baru bisa dipisahkan dan deteksi. Gas yang berfungsi membawa campuran
adalah gas inert seperti nitrogen atau helium.
 Kromatografi gas secara luas digunakan untuk berbagai industri dari makanan, minuman,
farmasi dan penelitian. Kromatografi gas biasanya dilengkapi dengan spektrofotometer
massa atau disebut GC-MS. Spektrometer massa digunakan untuk identifikasi komponen
kimia.
 Kromatografi gas berdasarkan fasa diamnya
1. Gas liquid chromatography 2. Gas Solid Chromatography
(gcl)diamnya berwujud cair. Cairan tersebut
Fasa (GSC)
Fasa diamnya berwujud padat. Padatan yang
merupakan cairan yang tidak mudah digunakan misalnya karbon, zeolit dan silika gel.
menguap yang melekat pada padatan Prinsip pemisahannya berdasarkan adsorpsi
pendukung yang inert berupa butiran halus. terhadap fasa diam.
Prinsip pemisahannya perbedaan partisi
komponen-komponen dari suatu sampel di
antara fasa diam dan fasa gerak.
5. Kromatografi cair
 Kromatografi cair adalah metode analisis yang digunakan untuk memisahkan molekul atau
ion yang terlarut dalam pelarut. Sering disebut sebagai kromatografi cair tekanan tinggi.
 Pelarut cair bertekanan (fase gerak) digunakan untuk melewatkan campuran sampel
melalui kolom yang berisi bahan penyerap padat.
 03
Bagian-bagian alat kromatografi
dan kegunaannya
 kromatografi hpcl
Bagian-bagian pada alat kromatografi HPLC pada
dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir),
pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat
injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan
fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau
perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair
dapat dilihat pada gambar disamping.
 Kromatografi hpcl

Fase Gerak (Reservoir)

Fase gerak atau reservoir terbuat dari gelas atau stainless steel. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak
antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas)
yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan
mengacaukan hasil analisis. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat
kecil, misalnya helium. Sistem yang lebih lengkap disertai penyaring debu. Debu dan partikulat yang terbawa
oleh solvent dapat menyumbat kolom. Degassing dapat juga dibuat sendiri dengan erlermeyer yang dilengkapi
dengan pengaduk magnet, pemanas dan pompa vacuum.
 Persyaratan fase gerak hpcl

01 sebagai pelarut
Zat cair harus bertindak 04
Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak
yang baik untuk cuplikan yang akan
mudah terbakar, dan tidak beracun.
dianalisis.

02 05
Zat cair harus murni sekali untuk Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan
menghindarkan masuknya kotoran yang dapat tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
mengganggu interpretasi kromatografi.

03 sekali untuk
Zat air harus jernih 06
Sesuai dengan detector.
menghindarkan penyumbatan pada
kolom
 Jenis hpcl berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak
01
HPLC fase normal: HPLC dengan
kombinasi antara fase diam polar dan fase
gerak non-polar. Fase diam yang
digunakan seperti silica, alumina, atau
trietilenaglikol yang dilapiskan pada
partikel silica. Sedangkan fase gerak yang
digunakan adalah heksana atau i-propileter.
02
HPLC fase terbalik: HPLC dengan
kombinasi antara fase diam non-polar
dan fase gerak polar. Fase gerak yang
digunakan seperti air, methanol, atau
asetinitril. Fase gerak yang baik
memberikan factor kapasitas k’ pada
rentang yang sesuai. Untuk cuplikan
dengan 2-3 komponen, sebaiknya
menggunakan fase gerak yang
memberikan k’ antara 2-5.
 Kromatografi hpcl

Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah
pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja
tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam kolom
dengan aliran yang konstan dan reproducible. Selain itu, Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran
fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan.
 Tiga jenis pompa yang digunakan dalam hpcl (bassett,1994)
Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan
kecil tempat pelarut yang
dipompa dengan cara gerakan
piston mundur-maju yang
dijalankan oleh motor. Piston
berupa gelas dan berkontak
langsung dengan pelarut.
Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat
suntik) terdiri dari tabung yang
dilengkapi pendorong yang
digerakkan oleh motor. Pompa ini
juga menghasilkan aliran yang
cenderung tidak bergantung pada
tekanan balik kolom dan viskositas
pelarut.
Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong
oleh gas bertekanan tinggi. Pompa
jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan
tetapi mempunya keterbatasan
kapasitas dan tekanan yang dihasilkan
(<2000 psi) serta kecepatan alir
bergantung pada viskositas pelarut dan
takanan balik kolom.
 Kromatografi hpcl

Tempat Injeksi

Bagian ini merupakan tempat dimana sampel

diinjeksikan untuk selanjutnya dibawa oleh fase gerak ke
dalam kolom. Sampel yang akan dimasukkan ke bagian
ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum
dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau
manual melalui injeksi.
Syarat injektor yang baik
 Dapat memasukkan sample kedalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin.
 Mudah digunakan.
 Keberulangan tinggi.
 Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik.
 Kromatografi hpcl

Kolom dan Fase Diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC
yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Ada 2 jenis kolom pada
KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
 Parameter Kolom Konversional Kolom mikrobor
Stainless steel Stainless steel
Panjang 3,10,15,20 dan 25 cm; Diameter luar 0,25 inci; Panjang 25 dan 50 cm; Diameter luar 0,25 inci; Diameter dalam 1 atau 2
Tabung kolom
Diameter dalam 4,6 cm mm
 
Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi
secara kimiawi (bonded phase), atau polimer-polimer (bonded phase), atau polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata
Fase diam stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau diameter partikel 3,5 atau 10µm dengan kisaran sempit.
10µm dengan kisaran sempit.

Tekanan operasional 500-3000 psi; (35-215) bar 1000-5000 psi; (70-350 bar)

Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk
normal. Untuk fase terbalik (reversed phase) digunakan fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau
metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir : bufer. Kecepatan alir 10-100µl/menit. Modifikasi instrumen Sistem
Fase gerak
1-3 ml/menit penghantaran pelarut yang mampu memberikan kontrol aliran di bawah
10µl/menit.Katup injeksi sampekl bervolume kecil;sel detektor bervolume
kecil.
Efisiensi meningkat dengan bekurannya ukuran partikel Sangat efisiensi dan sensitif, akan tetapi lambat,konsumsi fase gerak hanya
Kinerja fase diam, akan tetapi umur kolom dengan ukuran ¼ dari kolom konvensional.
partikel 3 µm lebih pendek
 Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang
tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan
sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi
dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan
gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil
atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil
dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang
tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya
kandungan air yang digunakan.
 Kromatografi hpcl

Detektor

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat
secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat
digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga
digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan
dengan detektor UV.
 karakteristik yang harus dimiliki detektor
01
Mempunyai respon terhadap solut
yang sepat dan reproduksibel.
02
mempunyai sensitifitas yang tinggi,
yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil
03
stabil dalam pengopersiannya;
04
mempunyai sel volume yang kecil sehingga
mampu meminimalkan pelebaran pita;
05
signal yang dihasilkan berbanding lurus
dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier);
06
tidak peka terhadap perubahan suhu dan
kecepatan alir fase gerak.
 Dasar Maksimum Peka terhadap Sensitivitas
Jenis
Pendeteksian sensitifitas kecepatan alir suhu

Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah

Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C

Spektometri massa Umum 10-10 Tidak Tidak ada

elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

Kromatografi gas
 A. Tangki gas pembawa
Gas bertindak sebagai fasa gerak disebut juga
gas pembawa (carierr gas). Gas-gas pembawa
yang biasa digunakan seperti helium, hidrogen
(pembakaran) dan nitrogen (udara tekan).
Helium digunakan bila detektornya TCD.
 B. Alat pengukur tekanan (regulator)
regulator digunakan unutk mengatur tekanan gas-gas yang
digunakan. Selain itu, ada pengatur laju aliran gas (soap bubble
flow rate meter). Bila karet ditekan akan muncul gelembung
sabun, kemudian akan didorong oleh gas pembawa, sehingga
gas pembawa dapat diukur kecepatan alirannya.

C. Injection port (tempat memasukkan

Adalah cabang unutk memasukkan cuplikan dengan cara
cuplikan) cuplikan waktunya harus
penyuntikkan. Pada saat memasukkan
sesingkat mungkin. Suhu injection port harus lebih tinggi dari titik
didih cuplikan (200c), kalau suhunya rendah dan memasukkan
cuplikan terlalu lambat maka pita elusinya lebar dan HETP besar.
Biasanya volume cuplikan berkisar 1- 20µl
 D. Kolom adalah tempat terjadinya proses pemisahan komponen-komponen
cuplikan. Kolom ini
ditempatkan di dalam oven bersuhu tinggi, sehingga komponen-komponen
cuplikan tetap berupa uap.
Kolom Kapiler Kolom isian
Jenis-jenis kolom sebagai berikut :
Permukaan dalamnya dilapisi dengan Biasanya mengandung zat padat
zat cair fase diam. Sifat- sifat zat cair pendukung (solid support).
(fase diam) yang diinginkan : Sifat-sifatnya zat padat
1. Sukar menguap ( titik didih pebdukung yang diinginkan.
2000c)
2. Mempunyai kestabilan panas
3. Inert secara kimia
4. Mempunyai sifat sebagai
pelarut
E. OVEN
Oven untuk memanaskan kolom pada suatu termostat. Suhu optimum yang digunakan tergantung
pada :
• Titik didih cuplikan
• Tingkat pemisahan yang diinginkan, suhu kolom yang terlalu tinggi kurang baik karena jarak
antar kurva elusi komponen yang satu dengan yang lainnya terlalu dekat sebaliknya bila suhu
terlalu rendah jaraknya terlalu jauh.
F. DETEKTOR
Detektor adalah bagian unutk mendeteksi komponen-komponen yang keluar dari kolom. Detektor
ini akan mengirimkan isyarat listrik ke alat pencatat (rekorder).
 Jenis Detektor pada alat kromatografi gas
FID ( Flame Ionisasion Detector )
Secara ringkas prinsip kerja FID adalah mula-mula dialirkan udara dan hidrogen maka akan timbul
pembakaran yang menimbulakan energi. Energi akan mengionisasi komponen-komponen yang
nantinya akan keluar dari kolom. Molekul-molekul kolom tersebut berubah menjadi ion. Ion-ion
positif akan tertarik ke elektroda negatif sehingga arus bertambah. Arus mengalir melalui tahanan
dan menimbulkan selisih tegangan. Penurunan tegangan yang terjadi disalurkan melalui amplifier
dan masuk ke dalam suatu rekorder (integrator). Bila suatu saat kromatografi gas menggunakan
FID sebaiknya digunakan N2 sebagai gas pembawa.
 Jenis Detektor pada alat kromatografi gas
TCD
Detektor ini bekerja berdasarkan pada prinsip bahwa benda panas akan kehilangan laju yang
bergantung pada susunan gas di sekitarnya. TCD biasanya terdiri atas suatu blok logam. Di dalam
blok logam tersebut ditempatkan kawat hantar tipis yang berfungsi sebagai tahanan listrik dan
merupakan dua tangan dari rangakaian jembetan weatstone (R1 dan R2). Bila ada komponen dari
keluar dari kolom dan melalui kawat tahanan, maka suhu R1 dan R2 akan berubah, begitu pula
tahanannya.

Hal ini menyebabkan jembatan wheatstone menjadi tidak seimbang dan menimbulkan isyarat
listrik. Isyarat listrik tersebut akan diteruskan ke rekorder. Rekorder akan mencatat isyarat ini
dalam bentuk kromatogram. Bila suatu alat kromatografi gas menggunakan TCD sebagai detector,
sebaiknya digunakan He sebagai gas pembawa.
 04
Prosedur kromatografi
Kromatografi kertas (Kemendikbud, 2018)
• Gelas atau bejana yang telah disiapkan diisi fase gerak
air kurang lebih 2,5 cm dari permukaan bawah bejana.
• Tandai berupa garis pada bagian bawah kertas. Kira-
kira 1,5 cm dari permukaan bawah. Tandai dengan
pensil.
• Totolkan spidol pada garis di bagian bawah kertas.
• Penjepit kertas digunakan untuk menjepit kertas dan
dimasukkan ke dalam gelas.
• Ditunggu selama kurang lebih 5 menit.
• Angkat kertas saring dari bejana dan hitung jarak
tempu pelarut dan fase gerak.
• Diamkan selama beberapa menit sampai kering.
• Identifikasi warna apa saja yang terpisah dan hitung
jarak pemisahannya.
• Hitung nilai Rf-nya.
Hasil pemisahan dianalisis berdasarkan harga atau nilai
faktor retardasi (Rf) pada masing-masing noda, bercak
atau spot yang dihasilkan pada pelarut yang sama.
Apabila diperoleh jarak noda yang sama dengan
sampel standar, berarti sampel yang dianalisis sama
dengan sampel standar. Perhitungan niali Rf dilakukan
dengan cara membagi jarak yang ditempuh zat terlarut
dengan jarak yang ditempuh pelarut.

Mengidentifikasi noda-noda dalam kertas menggunakan

harga Rf (Retordationfactor) yang didefinisikan
sebagai:
 Faktor yang menentukan harga rf
1. pelarut
Pelarut disebabkan pentingnya koefisien
partisi, maka perubahan- perubahan
yang sangat kecil dalam komposisi
pelarut dapat menyebabkan
perubahan-perubahan harga Rf.
2. suhu
Perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi
dan juga kecepatan aliran. Ukuran dari
bejanaVolume dari bejana mempengaruhi
homogenitas dari atmosfer, jadi mempengaruhi
kecepatan penguapan dari komponen-
komponen pelarut dari kertas. Jika bejana
besar yang digunakan, ada kecenderungan
perambatan lebih lama, seperti perubahan-
perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas,
maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua
faktor yaitu penguapan dan komposisi
mempengaruhi harga Rf.
 Faktor yang menentukan harga rf
3. kertas
Pengaruh utama yaitu kertas pada harga-
harga Rf yang terjadi dari perubahan
ion dan serapan yang berbeda untuk
macam-macam kertas. Kertas
mempengaruhi kecepatan aliran dan
akan mempengaruhi pada
kesetimbangan partisi.
4. Sifat dan campuran
Berbagai senyawa mengalami partisi di antara volume yang
sama dari fasa tetap dan bergerak, sehingga akan
mempengaruhi karakteristik dari kelarutan yang satu
terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf. Untuk
mengukur Rf perlu melokalisir permukaan pelarut.
Harga Rf biasanya dinyatakan sebagai fraksi/bagian.
Perbedaan dalam harga- harga Rf untuk dua senyawa
yang dipisahkan tergantung pada besarnya noda-noda
dan panjangnya aliran terlarut. Cara yang paling mudah
dalam pengukuran Rf adalah dengan menggunakan
penggaris. Ujung nol ditempatkan pada titik mula-mula
dan ujung yang lain direntangkan ke arah permukaan
pelarut dan harga Rf langsung dapat dibaca pada titik di
mana angka penggaris tepat pada noda. Dalam
penentuan Rf perlu mengukur dari pusat pita atau noda.
Kromatografi gas (Adnan, 1997)
• Gas pembawa dialirkan dari tangki bertekanan tinggi
melalui alat pengatur tekanan yang dapat menentukan
kecepatan aliran gas pembawa yang akan mengalir ke
komponen yang lain.
• Sampel dimasukkan dalam injektor yang dipanaskan agar
sampel berubah menjadi gas dan mengalir ke dalam kolom.
• Pada kolom campuran zat penyusun mengalami pemisahan
proses partisi pada fase cair melalui detektor yang
mengirimkan signal ke recorder setelah mengalami
amplifikasi.
• Bila sampel berupa cairan dapat dimasukkan dengan
syringe, bila berupa gas dimasukkan melalui katup.
• Sampel masuk ke dalam injektor mengalir dengan gas
pembawa masuk ke dalam kolom.
• Tunggu hingga proses selesai dan menampilkan hasil pada
layar komputer.
 Kromatografi lapis tipis (kemendikbud, 2018)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) sangat berguna untuk mengetahui jumlah komponen dalam
sampel. Peralatan yang diqunakan untuk KLT adalah chamber (wadah untuk proses KLT),
pinset, plat KLT, dan eluen.
Langkah-langkah mengoperasikan KLT yaitu sebagai berikut:
1. Potong plat KLT sesuai ukuran. Plat terbuat dari kaca, plat plastik, atau aluminium
foil dengan berbagai ukuran.
2. Biasanya, untuk satu spot menggunakan plat selebar 1 cm. Berarti jika menguji 3
sampel (3 spot) berarti menggunakan plat selebar 3 cm.
3. Buat garis dasar (base line) di bagian bawah, sekitar 0,5 cm dari ujung bawah plat,
dan garis akhir di bagian atas.
4. Menggunakan pipa kapiler, totolkan sampel cairan yang telah disiapkan sejajar,
tepat di atas base line. Jika sampel padat, larutkan pada pelarut tertentu. Keringkan
totolan.
 Kromatografi lapis tipis (kemendikbud, 2018)
5. Dengan pipet yang berbeda, masukkan masing-masing
eluen ke dalam chamber dan campurkan.
6. Tempatkan plat pada chamber berisi eluen. Base line
jangan sampai tercelup oleh ulen. Tutuplah chamber.
7. Tunggu eluen mengelusi sampel sampai mencapai garis
akhir, di sana pemisahan akan terlihat.
8. Setelah mencapai garis akhir, angkat plat dengan pinset,
keringkan dan ukur jarak spot. Jika spot tidak kelihatan,
amati pada lampu UV. Jika masih tak terlihat, semprot
dengan pewarna tertentu seperti kalium kromat atau
(Gambar Chamber Dan Plat ninhidrin.
Pada KLT)
 Kromatografi kolom (lenia, 2010)
Penentuan eluen dan fasa siam
dengan
Hal klt
pertama yang harus
dilakukan dan dipersiapkan pada
kromatografi kolom yaitu
pemilihan fasa diam dan fasa
gerak. Pemilihan fasa gerak dan
fasa diam didasarkan pada
kepolaran zat yang akan
dipisahkan. Dalam menjalankan
proses kromatografi yang baik,
dilakukan eluen dari yang
bersifat non polar ke polar, dan
sebaliknya polar dan non polar.
Pembuatan kolom kromatografi
Tahapan ini merupakan persiapan dari
tahapan kolom, dimana tahapan ini
digunakan untuk mempersiapkan kolom
dalam fasa diamnya. Tahapan packing kolom
terbagi dalam dua macam cara, yaitu cara
kering dan basah.
Packing kolom pertama dengan cara kering
dilakukan dendan memasukkan fasa diam
yang menyerupai pasir silika gel ke dalam
kolom langsung sampai penuh. Kemudian
diikuti dengan memaskukkan eluen sampai
menutupi fasa diam.
Sedangkan pada cara basah, pasir silika atau
fasa diam dicampurkan lebih dulu dengan
eluen pada wadah terpisah, kemudian
campuran tersebut dimasukkan ke dalam
kolom dengan cara bersamaan.
Pemisahan dengan kolom
Tahapan terakhir dari kromatografi kolom
kromatografi
dikenal dengan nama elusi. Proses ini
mengalirkan campuran melalui fasa diam
pada kolom menggunakan eluen atau fasa
gerak. Hasilnya adalah pemisahan
komponen campuran dari fasa diam.
Pemisahan komponen pada keseluruhan
proses kromatografi kolom seperti pada
prinsipnya didasarkan pada sifat
kepolaran, ukuran, dan berat molekul
yang dipisahkan. Hasil dari elusi akan
ditampung pada wadah terpisah pada
setiap fraksi. Elusi dapat dilihat dari
perbedaan warna yang dihasilkan oleh
setiap komponen.
 05
Pengaplikasian serta kekurangan
dan kelebihan kromatografi
 Pengaplikasian kromatografi

Komatografi Kertas

1. Penemuan senyawa-senyawa dalam tanaman.

2. Analisa logam-logam dalam tanah.
3. Pemisahan alkaloid (senyawa yang mengandung substansi dasar nitrogen basa, biasanya dalam
bentuk cincin heterosiklik, banyak terdapat pada tanaman).
4. Pemisahan asam lemak.
5. Analisa bahan tambahan makanan pada makanan dan AMDK.
6. Pengujian rutin urine dan cairan-cairan lainnya yang mengandung asam-asam amino dan gula
(untuk diagnosa suatu penyakit).
 Pengaplikasian kromatografi

Komatografi Gas

1. Pemurnian hasil reaksi sintesis kimia.

2. Isolasi senyawa aktif dalam bahan.
3. Analisis limbah lingkungan.
 Pengaplikasian kromatografi

Komatografi Kolom

1. Pemurnian dari hasil reaksi sistesis kimia.

2. Isolasi senyawa aktif dalam bahan alam.
3. Analisis limbah lingkungan.
 Kelebihan dan kekurangan kromatografi kolom
kelebihan
1. Proses kromatografi kolom termasuk
proses yang sederhana
2. Tidak membutuhkan alat-alat yang
kompleks dalam melakukan metode
kromatografi kolom
3. Biaya yang dikeluarkan untuk
metode kromatografi kolom cukup
murah jika dibandingkan dengan
metode kromatografi lainnya
kekurangan
1. Membutuhkan waktu yang lama untuk
menyelesaikan prosesnya
2. Perlu dilakukan elusi secara bertahap agar
semua fasa gerak yang digunakan akan
habis dan di tampung pada wadah yang
bebeda
 Kelebihan dan kekurangan kromatografi gas
kelebihan
1. Waktu analisis yang singkat dan ketajaman
pemisahan yang tinggi
2. Dapat menggunakan kolom lebih panjang untuk
menghasilkan efisiensi pemisahan yang tinggi
3. Gas mempunyai vikositas yang rendah
4. Kesetimbangan partisi antara gas dan cairan
berlangsung cepat sehingga analisis relatif cepat
dan sensitifitasnya tinggi
5. Pemakaian fase cair memungkinkan kita memilih
dari sejumlah fase diam yang sangat beragam yang
memisahkan hampir segala macam campuran.
kekurangan
1. Teknik kromatografi gas terbatas untuk zat yang
mudah menguap.
2. Kromatografi gas tidak mudah dipakai untuk
memisahkan campuran dalam jumlah besar.
Pemisahan pada tingkat (mg) mudah dilakukan,
pemisahan pada tingkat gram mungkin dilakukan,
tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton sukar
dilakukan kecuali jika ada metode lain.
3. Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak
bersifat reaktif terhadap fase diam dan zat terlarut.
 Kelebihan dan kekurangan kromatografi klt
kelebihan kekurangan
1. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis. 1. Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan
pereaksi warna, fluoresensi, atau dengan radiasi untuk mendapatkan bercak/noda yang
menggunakan sinar ultraviolet. diharapkan.
3. Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun
(descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
2. Butuh sistem trial and eror untuk
4. Ketepatan penentuan menentukan sistem eluen yang cocok.
5. Hanya membutuhkan sedikit pelarut. 3. Memerlukan waktu yang cukup lama jika
6. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
7. Jumlah perlengkapan sedikit. dilakukan secara tidak tekun
8. Preparasi sample yang mudah
9. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan
hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa (Gandjar
dan Rohman, 2007).
 Kelebihan dan kekurangan kromatografi kertas
kelebihan kekurangan
1. Tidak diperlukan peralatan yang teliti dan 1. Banyaknya permasalahan menyangkut cara
mahal pemasukan fasa gerak, perambatan fasa
2. Dapat diperoleh hasil yang baik walaupun gerak, dan penggumpalan
dengan peralatan dan materi yang 2. Membutuhkan waktu lama
sederhana 3. Keterbatasan parameter senyawa yang diuji
3. Senyawa yang terpisah dapat dideteksi
pada kertas dan diidentifikasi
 kesimpulan
• Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponen-
komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen
diantara dua fasa yaitu fase diam dan fase bergerak. Perbedaan kecepatan
perpindahan tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan kemampuan masing-
masing komponen untuk diserap (adsorpsi) atau perbedaan distribusi diantara dua
fasa yang tidak saling bercampur.
• Kromatografi dibedakan menjadi beberapa jenis berdasarkan pada teknik kerja
yang dapat digunakan, diantaranya adalah kromatografi kolom, kromatografi
kertas, kromatografi gas, dan kromatografi lapis tipis.
• Salah satu kegunaan Kromatografi adalah sebagai analisis, yaitu menguji suatu
campuran, komponen-komponennya dan hubungan antar komponen.
Terimakasih
ada pertanyaan?