TUGAS MAKALAH KIMIA ANALITIK

PENGANTAR KROMATOGRAFI
OLEH
KELOMPOK 4

Anggota Kelompok:
1. Julkarnain Adi Satrio 2007110361
2. M. Hisna Sayyidhani 2007113910
3. Muhammad Fadhel Maulana 2007134757
4. Nadiva Maharani Putri 2007134759
5. Natasya Falda Dani 2007110690
6. Salman Marzuki 2007110356
7. Sherina Septiyani 1807113279

PROGRAM STUDI SARJANA TEKNIK KIMIA

FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS RIAU
PEKANBARU
TAHUN2022
 KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena dengan rahmat
dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas makalah yang berjudul Titrasi
Kompleksometri tepat pada waktunya.
Adapun tujuan dari penulisan dari makalah ini adalah untuk memenuhi tugas pada
bidang mata kuliah Kimia Analitik. Selain itu, makalah ini juga bertujuan untuk menambah
wawasan bagi para pembaca dan juga bagi penulis. Penulis mengucapkan terima kasih kepada
Ibu Dra. Wisrayetti, M.Si, selaku dosen mata kuliah Kimia Analitik yang telah memberikan
tugas ini sehingga dapat menambah pengetahuan dan wawasan sesuai dengan bidang studi
yang penulis tekuni.
Penulis menyadari, makalah yang ditulis ini masih jauh dari kata sempurna. Oleh
karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran dari semua pembaca. Semoga
makalah ini bermanfaat bagi pembaca dan penulis.

Pekanbaru, 23 Maret 2022

Penulis

i
 DAFTAR ISI

Contents
KATA PENGANTAR ........................................................................................................... i
DAFTAR ISI......................................................................................................................... ii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................................... iii
DAFTAR TABEL................................................................................................................ iv
BAB I PENDAHULUAN ............................................................................................. 1
1.1 Latar Belakang .................................................................................................. 1
1.2 Rumusan Masalah ............................................................................................. 1
1.3 Tujuan................................................................................................................ 2
BAB II PEMBAHASAN ............................................................................................... 3
2.1 Pengertian, Tujuan, dan Kegunaannya .............................................................. 3
2.2 Jenis-jenis Kormatografi ................................................................................... 5
2.3 Bagian-bagian Alat dan Keggunaanya ............................................................ 14
2.3.1 Kromatografi HPLC........................................................................................ 14
2.3.2 Kromatografi Gas ............................................................................................ 21
2.4 Prosedur-prosedur Kromatografi ..................................................................... 24
2.4.1 Kromatografi Kertas ....................................................................................... 24
2.4.2 Kromatografi Gas (Adnan, 1997) ................................................................... 25
2.4.3 Kromatografi Lapis Tipis ................................................................................ 26
2.4.4 Kromatografi Kolom ....................................................................................... 27
2.5 Pengaplikasian, Kelebihan , dan Kekurangan Kromatografi .......................... 28
2.5.1 Kromatografi Gas ............................................................................................ 28
2.5.2 Kromatografi Kolom ....................................................................................... 28
2.5.3 Kromatografi Lapis Tapis ............................................................................... 29
2.5.4 Kromatografi Kertas ....................................................................................... 30
BAB III KESIMPULAN............................................................................................... 32
3.1 Kesimpulan...................................................................................................... 32
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................................... 33

ii
 DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Prinsip Adsorpsi .............................................................................................. 6
Gambar 2.2 Prinsip Partisi................................................................................................... 6
Gambar 2.3 Prinsip Eksklusi Molekuler ............................................................................. 7
Gambar 2.4 Prinsip Afinitas ................................................................................................ 7
Gambar 2.5 Kromatografi Kertas ........................................................................................ 8
Gambar 2.6 kromatografi Lapis Tipis ................................................................................. 9
Gambar 2.7 Kromatografi Kolom .......................................................................................... 11
Gambar 2.8 Kromatografi Gas ............................................................................................... 12
Gambar 2.9 Kromatografi Cair ............................................................................................... 13
Gambar 2.10 Bagian komponen dari kromatografi HPLC ................................................... 15
Gambar 2.11 Injeksi .............................................................................................................. 17
Gambar 2.12 Bagian-bagian dari Kromatografi Gas .............................................................. 22
Gambar 2.13 Proses sebelum dan hasil dari Kromatografi Kertas ......................................... 24
Gambar 2.14 Chamber dan plat pada KLT ............................................................................. 27

iii
 DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Jenis-jenis kromatografi .........................................................................................13
Tabel 2.2 Perbandingan Kolom Konversial dengan Mikrobor ..............................................18
Tabel 2.3 Jenis Detektor .........................................................................................................21

iv
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa ini telah banyak
digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya seperti detilasi, kristalisasi,
pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih
sederhana, penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan yang tinggi
serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi, Metode ini digunakan, jika dengan
metode lain tidak dapat di lakukan misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit atau
campurannya kompleks.
Meskipun dasar kromatografi adalah suatu proses pemisahan namun banyak diantara
cara ini dapat digunakan untuk analisi kuatitatif. Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat
dalam analisi kualitatif dan analisis kuantitatif adalah kromatografi kertas, kromatigrafi lapis
tipis (KLT), kromatografi kolom, kromatografi gas, dan kromatografi cair kinerja tinggi.
Kromatografi kertas dan KLT pada umunya lebih bermanfaat untuk tujuan indentifikasi, karena
lebih mudah dan sederhana.
Kromatografi kolom memberikan pemilihan fase diam yang lebih luas dan berguna
untuk pemisahan campuran secara kuantitatif. Dalam indutri metode inibanyak dipakaiuntuk
menghilangkan zat-zat yang tidak diinginkandalam hasil, misalnya pada pemurnian minyak
tanah atau minyak goring dan pemurnian hidroksidayang dihasilkan dari proses elektrolisis.
Teknik pemisahan kromatografi dilakukan untuk mendapatkan pemisahan campuran
diantara dua fase. Fase tersebut adalah fase diam dan fase gerak.Fase diam dapat berupa zat
cair dan zat padat, sedangkan fase gerak dapat berupa zat cair atau gas.
1.2 Rumusan Masalah
1. Apa pengertian, tujuan, dan kegunaan kromatografi
2. Apa saja jenis-jenis kromatografi
3. Apa saja bagian-bagian dari berbagai jenis kromatografi
4. Bagaimana prosedur dari masing-masing kromatografi
5. Apa saja pengaplikasian, kelebihan , dan kekurangan dari kromatografi

1
1.3 Tujuan
1. Mengetahui pengertian, tujuan dan kegunaan dari kromatografi
2. Mengetahui jenis-jenis kromatografi
3. Mengetahui bagian-bagian dari masing-masing kromatografi
4. Mengetahui prosedur dari masing-masing kromatografi
5. Mengetahui pengaplikasian, kelebihan , dan kekurangan dari kromatografi

2
 BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Pengertian, Tujuan, dan Kegunaannya
2.1.1 Pengertian Kromatografi
Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponen-komponen
berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen diantara dua fasa yaitu
fase diam dan fase bergerak. Perbedaan kecepatan perpindahan tersebut dapat disebabkan oleh
perbedaan kemampuan masing-masing komponen untuk diserap (adsorpsi) atau perbedaan
distribusi diantara dua fasa yang tidak saling bercampur (Khophar, 1990).
Di tahun 1903 Tswest menemukan teknik kromatografi. Teknik ini bermanfaat sebagai
cara untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponen-komponen
terdistribusi dalam dua fasa. Salah satu fasanya adalah fase diam. Transfer massa antara fase
bergerak dan fase diam terjadi apabila molekul-molekul campuran serap pada permukaan
partikel-partikel atauterserap didalam pori-pori partikel akan terbagi kedalam sejumlah cairan
yang terikat pada permukaan (Khophar, 1990).
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan
kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Istilah kromatografi berasal dari
gabungan kata “chroma” (warna) dan “graphein” (menuliskan). Dengan beberapa persyaratan
utama kromatografi yakni:
1. Ada fase diam dan fase gerak. Fase diam tidak boleh bereaksi dengan fase gerak.
2. Komponen sampel (contoh) harus terlarut dalam fase gerak dan berinteraksi
dengan fase diam.
3. Fase gerak harus bisa mengalir melewati fase diam, sedangkan fase diam harus terikat
kuat diposisinya (Day dan Underwood, 2001).
Meskipun makna istilah itu umumnya dipahami oleh para ahli kimia, sukarlah
merumuskan definisi kromatografi dengan baik. Istilah itu merupakan istilah terakhir yang
diterapkan pada metode-metode yang tampaknya beraneka dalam segi-segi tertentu, namun
sama-sama memiliki segi-segi sudut tertentu (Day dan Underwood, 2001).
Kromatografi sendiri juga bisa dibedakan menjadi beberapa jenis didasarkan pada
teknik kerja yang dapat digunakan, diantaranya adalah sebagai berikut:

3
 1.) Kromatografi kolom merupakan metode terbaik untuk melakukan pemisahan
campuran dalam jumlah yang besar di mana fase gerak nya dapat berupa zat cair dan
fase diam nya dapat berupa zat padat.
2.) Kromatografi kertas adalah kromatografi yang merupakan teknik suatu pemisahan di
mana fase diam nya berupa zat cair. Salah satu zat padat dapat digunakan untuk
menyokong fase diam yaitu contohnya bubuk selulosa.
Kemudian dilakukan
pemisah antara asam amino dan peprida. Peprida yang merupakan hasil hidroksida
protein dengan suatu cara di mana kolom yang berisi bubuk diganti dengan lembaran-
lembaran kertas dan kemudian diletakkan dalam bejana tertutup yang berisi oleh uap
penuh. Larutan ini adalah air yang di sokong oleh molekul selulosa dari kertas tersebut.
Fase gerak ini biasanya merupakan campuran dari satu atau dari lebih dari satu Pelarut
atau beberapa organik dan air.
3.) Kromatografi gas merupakan metode kromatografi yang dinamis untuk memisahkan
dan sebagai pendeteksi senyawa senyawa yang mudah menguap dalam suatu
campuran. Pemisahan pada kromatografi gas ini didasarkan pada.suatu senyawa
dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solute dengan fase diam
yang terjadi fase gerak pada kromatografi gas ini dapat berupa gas yang akan
mengetahui solute dari ujung kolom lalu akan menghantarkan kepada detektor yang
ada.
4.) Kromatografi lapis tipis merupakan suatu proses pemisahan yang di mana terdapat fase
gerak yang dapat berupa zat cair, sedangkan fase diam nya berupa zat padat. Pada
Kromatografi lapis tipis ini, berfungsi untuk pemisahan secara kuantitatif yang cepat
dan sering digunakan dengan menggunakan mikroskop (Khopkar, 2008).
Kromatografi adalah sebuah teknik dalam penelitian yang digunakan untuk
memisahkan komponen campuran menjadi bagian-bagian partikel penyusun komponen
tersebut. Hal ini dilakukan untuk melakukan pemurnian terhadap sebuah komponen campuran
dengan melihat karakteristiknya seperti ukuran, massa, bentuk, dan lainnya.
2.1.2 Kegunaan Kromatografi
Menurut Rubiyanto (2013) Kromatografi memiliki berbagai kegunaan dalam bidang
yang berbeda, diantaranya:

4
 Dalam Bidang Sains:
1.) Analisis - Menguji suatu campuran, komponen-komponennya dan hubungan antar
komponen.
2.) Identifikasi - Menentukan jati diri campuran atau komponen-komponennya
menggunakan senyawa standar.
3.) Pemurnia - Memisahkan pengotor atau senyawa tertentu yang dikehendaki untuk studi.
4.) Kualitatif - Menentukan jumlah atau konsentrasi campuran tertentu komponen-
komponennya.
Dalam Kehidupan Sehari-Hari :
1.) Perusahaan Fermentasi – Penentuan jumlah bahan aktif dalam produk obat.
2.) Rumah Sakit – Mendetteksi komponen-komponen dalam darah pada tubuh pasien.
3.) Penegakan Hukum – Menguji barang bukti khusus yang dijumpai di TKP.
4.) Badan Lingkungan Hidup – Pengujian polutan, kualitas lingkungan, dll.
5.) Pabrik Kimia – Pemurnian bahan untuk membuat produk.
2.2 Jenis-jenis Kormatografi
Kromatografi adalah metoda untuk pemisahan campuran senyawa dalam suatu sampel
berdasarkan perbedaan interaksi sampel dengan fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dapat
berupa padatan atau cairan yang diletakkan pada permukaan fasa pendukung. Fasa gerak dapat
berupa gas atau cairan. Jenis interaksi yang ada dalam proses kromatografi sangalah
bermacam-macam tergantung pada kombinasi fasa diam dan fasa geraknya. Ada banyak
interaksi yang mungkin terjadi antara sampel dengan fasa-fasa yang ada akibat adanya beragam
gaya yang mungkin timul dalam kromatografi seperti gaya/ikatan Van der Waals, ikatan
hydrogen, gaya elektrostatik seperti interaksi ion-dipol, dipol-dipol, interaksi hidrofilik-
hidrofobik dan sebagainya.
Adapun gambaran skematis interaksi yang mungkin terjadi selama proses pemisahan
dengan teknik kromatografi sebagai berikut:
 Interaksi adsorbs
Senyawa diserap oleh permukaan padatan dan terjadi keseimbangan jumlah solute
dalam fasa diam dan fasa gerak

5
 Gambar 2.1 Prinsip Adsorpsi
 Interaksi paratisi
Lapisan cairan sebagai fasa diam yang diembankan pada suatu padatan akan
mendistribusikan senyawa yang akan dipisahkan dan membentuk keseimbangan dengan
fasa gerak

Gambar 2.2 Prinsip Partisi

 Interaksi molecular ekslusi/permease gel/gel filtrasi
Teknik pemisahan berdasarkan ukuran molekul. Dalam keadan ideal, tidak ada
keterikatan senyawa pada fasa diam

6
 Gambar 2.3 Prinsip Eksklusi Molekuler
 Interaksi afinitas
Merupakan kromatografi yang menggunakan interaksi spesifik antara molekuljenis
tertentu dengan molekul lain yang terikat secara kovalen pada fasa diam.

Gambar 2.4 Prinsip Afinitas

Kromatografi dapat diklasifikasikan berdasarkan teknik kerja yang digunakan,
diantaranya adalah sebagai berikut:
 Kromatografi kertas
Kromatografi kertas termasuk kromatografi cair-cair dengan kertas sebagai zat
pendukung (fase diam) karena kertas atau serat-serat selulosa merupakan adsorben
lemah yang hidrofil, adsorbs zat oleh kertas tidak terlalu kuat dan terdesak oleh air. Air
atau bagian yang lebih polar dari cairan yang dipakai sebagai eluen (fase gerak) akan
berlaku sebagai fase stasioner jadi kromatografi kertas dapat digolongkan sebagai jenis
kromatografi cair-cair dan mekanisme pemisahan yang dominan adalah partisi.
Eluen (pelarut, cairan pengelusi) pada kromatografi kertas biasanya merupakan
campuran 2 komponen atau lebih, yang berlaku sebagai fase gerak selanjutnya adalah

7
 bagian campuran yang kurang polar. Kromatografi kertas umumnya lebih bermanfaat
untuk tujuan identifikasi, karena mudah dan sederhana. Dalam kromatografi kertas,
pembanding jarak rambat (diukur sampai titik yang memberikan intensitas maksimum
pada bercak) suatu senyawa tertentu terhadap jarak rambat fase gerak, diukur dari titik
penotolan.
Prinsip dasar dari kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu
senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa
terjadi dalam pelarut yang bergertak lambat pada kertas, komponen-komponen
bergerak pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan pada
perbedaan bercak warna.

Gambar 2.5 Kromatografi Kertas

 Kromatografi lapis tipis
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari satu
sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel
berdasarkan perbedaan kepolaran. Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan
sebuah seilika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau
plastic yang keras. Fasa diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali mengandung
substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultraviolet.
Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan
serbuk selulosa. Senyawa yang berbeda dalam campuran bergerak ke atas kaca slide
dengan kecepatan yang berbeda, meninggalkan bintik-bintik di lokasi yang berbeda
pada fase diam. Bintik-bintik yang terpisah ini kemudian divisualisasikan dengan sinar
ultraviolet. Prinsip dasar dari kromatografi lapis tipis adalah dengan memisahkan
sampel berdasarkan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan.

8
 Metoda ini adalah metoda sederhana dan cepat untuk memisahkan campuran
senyawa organik. Teknik ini sering digunakan untuk menentukan pigmen dalam
tanaman, menganalisis komposisi pewarna serat, dan mengidentifikasi insektisida atau
pestisida dalam makanan. Dibandingkan dengan kromatografi kertas, teknik
kromatografi lapis tipis berjalan lebih cepat dan menghasilkan pemisahan yang lebih
baik.

Gambar 2.6 kromatografi Lapis Tipis

 Kromatografi kolom
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai
alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Kolom sendiri dibagi
menjadi dua kelompok :
1. Kolom analitik : garis tengah dalam 2 – 6 mm. Panjang bergantung pada jenis
kemasan, untuk kemasan pertikel biasanya Panjang kolom 50 – 100 cm. untuk
kemasan mikropartikel berpori biasanya 10 – 30 cm;
2. Kolom preparative: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan
Panjang kolom 25 – 100 cm.
Pembagian fase dalam kromatografi kolom:
1. Fasa diam
Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah suatu adsorben
padat. Biasanya berupa silika gel atau alumina. Dahulu juga sering digunakan
bubuk selulosa. Fasa diam berbentuk serbuk microporus untuk meningkatkan luas
permukaan.
2. Fasa gerak

9
 Fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan alami. Eluen dipilih sedemikian
rupa sehingga factor retensi senyawa berkisar antara 0,2 – 0,3 supaya
meminimalisir penggunaan waktu dan jumlah eluen melewati kolom. Jenis eluen
yang digunakan dapat dicoba terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis
tipis. Setelah dirasa cocok, eluen yang sama digunakan untuk mengelusi
komponen dalam kolom.
Metoda kromatografi kolom :
1. Metoda kering
Pada metoda ini, kolom diisi dengan fasa diam kering, diikuti dengan penambahan
fasa gerak yang disiramkan pada kolom sampai benar-benar basah.
2. Metoda basah
Pada metoda basah, bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada
serbuk fasa diam dan dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Dalam langkah ini
harus benar-benar hati-hati supaya tidak ada gelembung udara. Larutan senyawa
organic dipipet di bagian atas fasa diam, kemudian eluen dituangkan pelan-pelan
melewati kolom.
Pembagian kromatografi kolom
1. Fase normal
Kromatografi kolom dengan fasa diamnya bersifat polar, misalnya silika gel,
alumina, sedangkan fasa geraknya bersifat non polar seperti heksan.
2. Fase terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fasa diamnya bersifat non polar, yang banyak
dipakai adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8). Sedangkan
fasa geraknya bersifat polar seperti air, methanol dan asetonitril.
Prinsip dasar dari kromatografi kolom sendiri adalah adsorpsi dan
patisi. Adsorpsi adalah mekanisme berupa komponen sample secara selektif
diadsorpsi oleh permukaan fasa diam. Partisi adalah mekanisme berupa
komponen sample secara selektif terpartisi antara eluen dan lap. Cair tipis yang
terikat pada padatan pendukung inert.

10
 Gambar 2.7 Kromatografi Kolom
 Kromatografi gas
Kromatografi gas adalah teknik pemisahan kromatografi untuk memisahkan
komponen kimia dari sampel campuran dan mendeteksi jumlahnya. Untuk pemisahan
sampel tersebut diuapkan dan dibawa oleh gas yang dilewatkan pada fasa diam. Untuk
dapat dianalisis dengan kromatografi gas, sampel harus mudah menguap dan tahan
terhadap pemanasan sehingga tidak rusak selama analisis. Untuk zat yang tidak
berbentuk gas harus dimodifikasi terlebih dahulu agar bisa menguap menjadi gas baru
bisa dipisahkan dan deteksi. Gas yang berfungsi membawa campuran adalah gas inert
seperti nitrogen atau helium.
Berdasarkan fasa diamnya, kromatografi gas dibagi menjadi dua bagian yaitu :
1. Gas Liquid Chromatography (GLC), fasa diamnya berwujud cair. Cairan
tersebut merupakan cairan yang tidak mudah menguap yang melekat pada
padatan pendukung yang inert berupa butiran halus. Prinsip pemisahannya
perbedaan partisi komponen-komponen dari suatu sampel di antara fasa diam
dan fasa gerak.
2. Gas Solid Chromatography (GSC), fasa diamnya berwujud padat. Padatan yang
digunakan misalnya karbon, zeolit dan silika gel. Prinsip pemisahannya
berdasarkan adsorpsi terhadap fasa diam.
Kromatografi gas secara luas digunakan untuk berbagai industri dari makanan,
minuman, farmasi dan penelitian. Kromatografi gas biasanya dilengkapi dengan
spektrofotometer massa atau disebut GC-MS. Spektrometer massa digunakan untuk
identifikasi komponen kimia.

11
 Gambar 2.8 Kromatografi Gas

 Kromatografi cair
Kromatografi cair adalah metode analisis yang digunakan untuk memisahkan
molekul atau ion yang terlarut dalam pelarut. Ini sering disebut sebagai kromatografi
cair tekanan tinggi, yang menggunakan berbagai interaksi kimia antara kolom
kromatografi dan zat yang dianalisis. Dalam teknik ini, pelarut cair bertekanan (fase
gerak) digunakan untuk melewatkan campuran sampel melalui kolom yang berisi
bahan penyerap padat. Kolom biasanya struktur berbentuk tabung yang dikemas
dengan partikel kecil dengan kimia permukaan tertentu.
Karena setiap senyawa dalam campuran bereaksi berbeda dengan bahan
penyerap (karena perbedaan ukuran, adsorpsi, dan pertukaran ion), mereka mengalir
dengan kecepatan yang berbeda di dalam kolom. Laju aliran yang berbeda ini
membantu ahli kimia untuk memisahkan komponen campuran saat mereka mengalir
keluar dari kolom. Pilihan aditif dan pelarut tergantung pada sifat fase diam dan zat
yang dianalisis.

12
 Gambar 2.9 Kromatografi Cair
Berikut ringakasan dari empat jenis utama kromatografi
Tabel 2.1 Jenis-jenis kromatografi
Metoda Fasa bergerak Fasa diam Ringkasan
Kromatografi Cairan Padat (selulosa) Komponen individu
kertas terlihat langsung pada
kertas saring
Kromatografi Cairan Padat (alumina atau Komponen individu
lapis tipis silica) terlihat pada kaca
yang dilapisi dengan
lapisan tipis silica
Kromatografi gas Gas inert Padat atau pendukung Komponen dengan
cairan titik didih terendah
keluar dari kolom
terlebih dahulu, dan
komponen dengan
titik didih tertinggi
keluar terakhir.
Kromatografi cairan Padat (alumina atau Sampel dipaksa
cair silica) melalui kolom dengan
memompa pelarut
pada tekanan tinggi

13
 melalui tabung
panjang.
Faktor-faktor yang menjadi pertimbangan untuk menentukan jenis kromatografi antara
lain:
1. Mudah tidaknya teknik ini dilakukan, terutama untuk teknik kromatografi yang
konvensional seperti kromatografi kertas, kolom, ataupun lapis tipis mengingat ketiga
jenis kromatografi ini dapat kita lakukan sendiri tanpa bantuan instrumentasi yang
rumit.
2. Maksud dari pemisahan yang kita lakukan. Apakah untuk preparasi, analisis kuantitatif
atau kualitatif? Bila dirasa sulit dilakukan dengan teknik yang konvensional, maka
pemilihan jenis kromatografi yang instrumental perlu menjadi pertimbangan.
3. Bentuk senyawa yang akan dipisahkan. Setiap langkah penelitian tentunya harus
diawali dengan penentuan target senyawa yang dikehendaki. Sangat taidak mungkin
kita meneliti sesuatu tanpa kita tahu sama sekali tentang senyawa tersebut.
2.3 Bagian-bagian Alat dan Keggunaanya
Pada umunya, alat kromatografi ada dua macam, yaitu kromatografi HPLC (Hight
Perfomance Liquid Chromatography) dan Kromatografi Gas.
2.3.1 Kromatografi HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis farmasi
yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Yang paling
membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada KCKT digunakan tekanan
tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya,
dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan
teramati pada spektrum yang puncak- puncaknya terpisah.
Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan
berbagai komponen penyusun dalam suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya
ditentukan oleh ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan
produk kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak terlalu tinggi. Titik
beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil
pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang dapat
dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik

14
makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif
dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.
Bagian-bagian pada alat kromatografi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase
gerak (Reservoir), pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

Gambar 2.10 Bagian komponen dari kromatografi HPLC

1. Fase Gerak (Reservoir)
Fase gerak atau reservoir terbuat dari gelas atau stainless steel. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase
gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan
mengacaukan hasil analisis. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert dengan
kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium. Sistem yang lebih lengkap disertai
penyaring debu. Debu dan partikulat yang terbawa oleh solvent dapat menyumbat
kolom. Degassing dapat juga dibuat sendiri dengan erlermeyer yang dilengkapi dengan
pengaduk magnet, pemanas dan pompa vacuum. Fase gerak biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya
elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Ahmad, 2011).
Persyaratan fase gerak HPLC:
1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.

15
 2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector.
Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak (Putra, 2004):
a) HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan
fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau
trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak
yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.
b) HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan
fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau
asetinitril. Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang
yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan
fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan
batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai
5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk
tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit (Putra, 2004).
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa
dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan (Putra, 2004). Tiga jenis pompa yang
digunakan dalam HPLC (Bassett, 1994):
a) Pompa reciprocating

16
 Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa
dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston
berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur
maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston
maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada
di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang
dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga
menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik
kolom dan viskositas pelarut.
c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa
jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas
dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada
viskositas pelarut dan takanan balik kolom.
3. Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume
injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya
20 – 500 μL) (Bassett, 1994).

Gambar 2.11 Injeksi

17
 Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir.
Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.
Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan
penyumbatan.
c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume
lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan
adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada
posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE
difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom. Syarat- syarat injektor yang
baik :
a. Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
b. Mudah digunakan
c. Keberulangan tinggi
d. Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
4. Kolom dan Fase Diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya
proses pemisahan solut/analit. Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom
konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah
ini :
Tabel 2.2 Perbandingan Kolom Konversial dengan Mikrobor
Parameter Kolom Konversional Kolom mikrobor
Stainless steel Stainless steel
Panjang 3,10,15,20 dan 25 Panjang 25 dan 50 cm
Tabung kolom cm Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 atau 2
Diameter dalam 4,6 cm mm

18
 Porous, silika ukuran kecil,
silika yang dimodofikasi
secara kimiawi (bonded
phase), atau polimer-
Fase diam
polimer stiren/divinil
benzen.Rata-rata diameter
partikel 3,5 atau 10µm
dengan kisaran sempit.
500-3000 psi
Tekanan operasional
(35-215) bar
Hidrokarbon+pelarut
terklorinasi atau alkohol
untuk fase normal. Untuk
fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol
atau asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir : 1-3
ml/menit
Fase gerak
Efisiensi meningkat
dengan bekurannya ukuran
Kinerja partikel fase diam, akan
tetapi umur kolom dengan
Porous, silika ukuran kecil,
silika yang dimodofikasi
secara kimiawi (bonded
phase), atau polimer-
polimer stiren/divinil
benzen.Rata-rata diameter
partikel 3,5 atau 10µm
dengan kisaran sempit.
1000-5000 psi
(70-350 bar)
Hidrokarbon+pelarut
terklorinasi atau alkohol
untuk fase normal. Untuk
fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol
atau asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir 10-
100 µl/menit.Modifikasi
instrumen
Sistem penghantaran
pelarut yang mampu
memberikan kontrol aliran
di bawah 10µl/menit.Katup
injeksi sampekl bervolume
kecil;sel detektor
bervolume kecil.
Sangat efisiensi dan
sensitif, akan tetapi
lambat,konsumsi fase
gerak hanya ¼ dari kolom
konvensional.
19
 ukuran partikel 3 µm lebih
pendek
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan
kolom konvensional, yakni:
1) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
2) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
3) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus
silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan
reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih
sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih
cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi
akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan
air yang digunakan
5. Detektor
Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan terpisah-
pisah dan keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda. Komponen yang sudah
terpisah ini secara berturut-turut akan melewati suatu detektor dan akan dibaca
kadarnya. Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak

20
 bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan
golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
1) mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
2) mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil;
3) stabil dalam pengopersiannya;
4) mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita;
5) signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier);
6) tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm.
Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa
dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas,
terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika
dibandingkan dengan detektor UV.
Tabel 2.3 Jenis Detektor
Dasar Jenis Maksimum Peka terhadap Sensitivitas suhu
Pendeteksian sensitifitas kecepatan alir
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
-7
Indek bias Umum 1 x 10 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri Umum 10-10 Tidak Tidak ada
massa
elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C
2.3.2 Kromatografi Gas
Untuk bagian-bagian dari kromatografi gas, bias dilihat pada gambar dibawah ini:

21
 Gambar 2.12 Bagian-bagian dari Kromatografi Gas
Penjelasan Prinsip Kerja Gas Chromatography:
a) Tangki gas pembawa: Gas bertindak sebagai fasa gerak disebut juga gas pembawa
(carierr gas). Gas-gas pembawa yang biasa digunakan seperti helium, hidrogen
(pembakaran) dan nitrogen (udara tekan). Helium digunakan bila detektornya TCD.
b) Alat pengatur tekanan (regulator), regulator digunakan unutk mengatur tekanan gas-
gas yang digunakan. Selain itu, ada pengatur laju aliran gas (soap bubble flow rate
meter). Bila karet ditekan akan muncul gelembung sabun, kemudian akan didorong
oleh gas pembawa, sehingga gas pembawa dapat diukur kecepatan alirannya.
c) Injection port (tempat memasukkan cuplikan) adalah cabang unutk memasukkan
cuplikan dengan cara penyuntikkan. Pada saat memasukkan cuplikan waktunya harus
sesingkat mungkin. Suhu injection port harus lebih tinggi dari titik didih cuplikan
(200c), kalau suhunya rendah dan memasukkan cuplikan terlalu lambat maka pita
elusinya lebar dan HETP besar. Biasanya volume cuplikan berkisar 1- 20µl
d) Kolom adalah tempat terjadinya proses pemisahan komponen-komponen cuplikan.
Kolom ini ditempatkan di dalam oven bersuhu tinggi, sehingga komponen-komponen
cuplikan tetap berupa uap. Jenis-jenis kolom sebagai berikut :
 Kolom Kapiler, permukaan dalamnya dilapisi dengan zat cair fase diam. Sifat-
sifat zat cair (fase diam) yang diinginkan :
a. Sukar menguap ( titik didih 200ºC)
b. Mempunyai kestabilan panas
c. Inert secara kimia
d. Mempunyai sifat sebagai pelarut
 Kolom isian, biasanya mengandung zat padat pendukung (solid support). Sifat-
sifatnya zat padat pebdukung yang diinginkan.

22
e) Oven untuk memanaskan kolom pada suatu termostat. Suhu optimum yang digunakan
tergantung pada :
 Titik didih cuplikan
 Tingakt pemisahan yang diinginkan, suhu kolom yang terlalu tinggi kurang baik
karena jarak antara kurva elusi komponen yang satu dengan yang lainnya terlalu
dekat sebaliknya bila suhu terlalu rendah jaraknya terlalu jauh.
f) Detektor adalah bagian unutk mendeteksi komponen-komponen yang keluar dari
kolom. Detektor ini akan mengirimkan isyarat listrik ke alat pencatat (rekorder).
Detektor pada alat kromatografi gas ada beberapa macam, di antaranya adalah :
a. FID ( Flame Ionisasion Detector )
Secara ringkas prinsip kerja FID adalah mula-mula dialirkan udara dan
hidrogen maka akan timbul pembakaran yang menimbulakan energi. Energi akan
mengionisasi komponen-komponen yang nantinya akan keluar dari kolom. Molekul-
molekul kolom tersebut berubah menjadi ion. Ion-ion positif akan tertarik ke elektroda
negatif sehingga arus bertambah. Arus mengalir melalui tahanan dan menimbulkan
selisih tegangan. Penurunan tegangan yang terjadi disalurkan melalui amplifier dan
masuk ke dalam suatu rekorder (integrator). Bila suatu saat kromatografi gas
menggunakan FID sebaiknya digunakan N2 sebagai gas pembawa.
b. TCD
Detektor ini bekerja berdasarkan pada prinsip bahwa benda panas akan
kehilangan laju yang bergantung pada susunan gas di sekitarnya. TCD biasanya terdiri
atas suatu blok logam. Di dalam blok logam tersebut ditempatkan kawat hantar tipis
yang berfungsi sebagai tahanan listrik dan merupakan dua tangan dari rangakaian
jembetan weatstone (R1 dan R2). Bila ada komponen dari keluar dari kolom dan
melalui kawat tahanan, maka suhu R1 dan R2 akan berubah, begitu pula tahanannya.
Hal ini menyebabkan jembatan wheatstone menjadi tidak seimbang dan
menimbulkan isyarat listrik. Isyarat listrik tersebut akan diteruskan ke rekorder.
Rekorder akan mencatat isyarat ini dalam bentuk kromatogram. Bila suatu alat
kromatografi gas menggunakan TCD sebagai detector, sebaiknya digunakan He
sebagai gas pembawa.

23
2.4 Prosedur-prosedur Kromatografi
2.4.1 Kromatografi Kertas
Berikut prosedur-prosedur dari kromatografi kertas (Kemendikbud, 2018):

Gambar 2.13 Proses sebelum dan hasil dari Kromatografi Kertas

a. Gelas atau bejana yang telah disiapkan diisi fase gerak air kurang lebih 2,5 cm dari
permukaan bawah bejana.
b. Tandai berupa garis pada bagian bawah kertas. Kira-kira 1,5 cm dari permukaan
bawah. Tandai dengan pensil.
c. Totolkan spidol pada garis di bagian bawah kertas.
d. Penjepit kertas digunakan untuk menjepit kertas dan dimasukkan ke dalam gelas.
e. Ditunggu selama kurang lebih 5 menit.
f. Angkat kertas saring dari bejana dan hitung jarak tempu pelarut dan fase gerak.
g. Diamkan selama beberapa menit sampai kering.
h. Identifikasi warna apa saja yang terpisah dan hitung jarak pemisahannya.
i. Hitung nilai Rf-nya.
Hasil pemisahan dianalisis berdasarkan harga atau nilai faktor retardasi (Rf) pada
masing-masing noda, bercak atau spot yang dihasilkan pada pelarut yang sama. Apabila
diperoleh jarak noda yang sama dengan sampel standar, berarti sampel yang dianalisis sama
dengan sampel standar. Perhitungan niali Rf dilakukan dengan cara membagi jarak yang
ditempuh zat terlarut dengan jarak yang ditempuh pelarut.
Mengidentifikasi noda-noda dalam kertas menggunakan harga Rf (Retordationfactor)
yang didefinisikan sebagai:

Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu :

24
 a. Pelarut
Pelarut disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan- perubahan
yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan
harga Rf.
b. Suhu
Perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
Ukuran dari bejanaVolume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer, jadi
mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas.
Jika bejana besar yang digunakan, ada kecenderungan perambatan lebih lama, seperti
perubahan-perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan
berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan komposisi mempengaruhi harga Rf.
c. Kertas
Pengaruh utama yaitu kertas pada harga-harga Rf yang terjadi dari perubahan
ion dan serapan yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi
kecepatan aliran dan akan mempengaruhi pada kesetimbangan partisi.
d. Sifat dan Campuran
Berbagai senyawa mengalami partisi di antara volume yang sama dari fasa tetap
dan bergerak, sehingga akan mempengaruhi karakteristik dari kelarutan yang satu
terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf. Untuk mengukur Rf perlu melokalisir
permukaan pelarut. Harga Rf biasanya dinyatakan sebagai fraksi/bagian. Perbedaan
dalam harga- harga Rf untuk dua senyawa yang dipisahkan tergantung pada besarnya
noda-noda dan panjangnya aliran terlarut. Cara yang paling mudah dalam pengukuran
Rf adalah dengan menggunakan penggaris. Ujung nol ditempatkan pada titik mula-
mula dan ujung yang lain direntangkan ke arah permukaan pelarut dan harga Rf
langsung dapat dibaca pada titik di mana angka penggaris tepat pada noda. Dalam
penentuan Rf perlu mengukur dari pusat pita atau noda.
2.4.2 Kromatografi Gas (Adnan, 1997)
Berikut prosedur-prosedur dari kromatografi kertas (Adnan, 1997):
a) Gas pembawa dialirkan dari tangki bertekanan tinggi melalui alat pengatur tekanan
yang dapat menentukan kecepatan aliran gas pembawa yang akan mengalir ke
komponen yang lain.

25
 b) Sampel dimasukkan dalam injektor yang dipanaskan agar sampel berubah menjadi gas
dan mengalir ke dalam kolom.
c) Pada kolom campuran zat penyusun mengalami pemisahan proses partisi pada fase cair
melalui detektor yang mengirimkan signal ke recorder setelah mengalami amplifikasi.
d) Bila sampel berupa cairan dapat dimasukkan dengan syringe, bila berupa gas
dimasukkan melalui katup.
e) Sampel masuk ke dalam injektor mengalir dengan gas pembawa masuk ke dalam
kolom. Tunggu hingga proses selesai dan menampilkan hasil pada layar computer
2.4.3 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) sangat berguna untuk mengetahui jumlah komponen
dalam sampel. Peralatan yang diqunakan untuk KLT adalah chamber (wadah untuk proses
KLT), pinset, plat KLT, dan eluen. Berikut prosedur-prosedur dari kromatografi kertas
(Kemendikbud, 2018):
1) Potong plat KLT sesuai ukuran. Plat terbuat dari kaca, plat plastik, atau aluminium foil
dengan berbagai ukuran.
2) Biasanya, untuk satu spot menggunakan plat selebar 1 cm. Berarti jika menguji 3
sampel (3 spot) berarti menggunakan plat selebar 3 cm.
3) Buat garis dasar (base line) di bagian bawah, sekitar 0,5 cm dari ujung bawah plat, dan
garis akhir di bagian atas.
4) Menggunakan pipa kapiler, totolkan sampel cairan yang telah disiapkan sejajar, tepat
di atas base line. Jika sampel padat, larutkan pada pelarut tertentu. Keringkan totolan.
5) Dengan pipet yang berbeda, masukkan masing-masing eluen ke dalam chamber dan
campurkan.
6) Tempatkan plat pada chamber berisi eluen. Base line jangan sampai tercelup oleh ulen.
Tutuplah chamber.
7) Tunggu eluen mengelusi sampel sampai mencapai garis akhir, di sana pemisahan akan
terlihat.
8) Setelah mencapai garis akhir, angkat plat dengan pinset, keringkan dan ukur jarak spot.
Jika spot tidak kelihatan, amati pada lampu UV. Jika masih tak terlihat, semprot dengan
pewarna tertentu seperti kalium kromat atau ninhidrin.

26
 Gambar 2.14 Chamber dan plat pada KLT
2.4.4 Kromatografi Kolom
Berikut prosedur dari kromatografi kolom (Lenia,2010):
a. Penentuan Eluen dan Fasa Diam dengan KLT
Sejumlah adsorben yang akan digunakan untuk pelapis dibuat bubur dengan
sejumlah pelarut. Hal pertama yang harus dilakukan dan dipersiapkan pada
kromatografi kolom yaitu pemilihan fasa diam dan fasa gerak. Tahapan awal ini sangat
menentukan hasil akhir dari proses kromatografi kolom. Sebab pemiliihan fasa diam
dan fasa gerak sangat berpengaruh ketika pemisahan komponen.
Pemilihan fasa gerak dan fasa diam didasarkan pada kepolaran zat yang akan
dipisahkan. Biasanya fasa diam digunakan bersifat polar seperti halnya pasir silika gel.
Sementara itu, fasa gerak atau eluen umumnya dilakukan variasi kepolaran untuk
menghasilkan pemisahan yang paling optimal. Dalam menjalankan proses
kromatografi yang baik, dilakukan eluen dari yang bersifat non polar ke polar, dan
sebaliknya polar dan non polar.
b. Pembuatan Kolom Kromatografi
Tahapan ini merupakan persiapan dari tahapan kolom, dimana tahapan ini
digunakan untuk mempersiapkan kolom dalam fasa diamnya. Tahapan packing kolom
terbagi dalam dua macam cara, yaitu cara kering dan basah.
Packing kolom pertama dengan cara kering dilakukan dendan memasukkan
fasa diam yang menyerupai pasir silika gel ke dalam kolom langsung sampai penuh.
Kemudian diikuti dengan memaskukkan eluen sampai menutupi fasa diam. Sedangkan
pada cara basah, pasir silika atau fasa diam dicampurkan lebih dulu dengan eluen pada
wadah terpisah, kemudian campuran tersebut dimasukkan ke dalam kolom dengan cara
bersamaan.

27
 c. Pemisahan dengan Kolom Kromatografi
Tahapan terakhir dari kromatografi kolom dikenal dengan nama elusi. Proses
ini mengalirkan campuran melalui fasa diam pada kolom menggunakan eluen atau fasa
gerak. Hasilnya adalah pemisahan komponen campuran dari fasa diam.
Pemisahan komponen pada keseluruhan proses kromatografi kolom seperti
pada prinsipnya didasarkan pada sifat kepolaran, ukuran, dan berat molekul yang
dipisahkan. Hasil dari elusi akan ditampung pada wadah terpisah pada setiap fraksi.
Elusi dapat dilihat dari perbedaan warna yang dihasilkan oleh setiap komponen.
Misalnya senyawa A terpisah menghasilkan warna hijau, dan pada komponen B
menghasilkan warna merah.
2.5 Pengaplikasian, Kelebihan , dan Kekurangan Kromatografi
2.5.1 Kromatografi Gas
Kelebihan
1) Waktu analisis yang singkat dan ketajaman pemisahan yang tinggi.
2) Dapat menggunakan kolom lebih panjang untuk menghasilkan efisiensi
pemisahan yang tinggi.
3) Gas mempunyai vikositas yang rendah.
4) Kesetimbangan partisi antara gas dan cairan berlangsung cepat sehingga
analisis relatif cepat dan sensitifitasnya tinggi.
5) Pemakaian fase cair memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang
sangat beragam yang akan memisahkan hampir segala macam campuran.
Kekurangan
1) Teknik Kromatografi gas terbatas untuk zat yang mudah menguap.
2) Kromatografi gas tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam
jumlah besar. Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan, pemisahan pada
tingkat gram mungkin dilakukan, tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton
sukar dilakukan kecuali jika ada metode lain.
3) Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif terhadap
fase diam dan zat terlarut.
2.5.2 Kromatografi Kolom
Kekurangan kromatografi kolom
1. Membutuhkan waktu yang lama untuk menyelesaikan prosesnya

28
 2. Perlu dilakukan elusi secara bertahap agar semua fasa gerak yang digunakan akan
habis dan di tampung pada wadah yang bebeda
Kelebihan kromatografi kolom
1. Proses kromatografi kolom termasuk proses yang sederhana
2. Tidak membutuhkan alat-alat yang kompleks dalam melakukan metode kromatografi
kolom
3. Biaya yang dikeluarkan untuk metode kromatografi kolom cukup murah jika
dibandingkan dengan metode kromatografi lainnya
Contoh Panfaatan Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom menjadi metode yang dasar dalam bidang kimia. Sebagai metode
yang dasar, jenis kromatografi ini memiliki manfaat dan aplikasi yang luas, utamanya pada
bidang kimia organik. Beberapa contoh antara lain sebagai berikut;
1. Pemurnian dari hasil reaksi sintesis kimia
Dalam bidang kimia organik, dikenal reaksi sintesis yang mana memungkinkan
pembentukan produk yang berasal dari reaktan tertentu. Pada reaksi sintesis ini tidak
selalu menghasilkan produk yang bersifat murni atau hanya satu produk saja.
Namun memungkinkan produk lain juga dihasilkan, sebutan dari produk
tersebut adalah produk samping hasil reaksi.
2. Isolasi senyawa aktif dalam bahan alam
Kromatografi kolom juga dimanfaatkan pada isolasi senyawa aktif yang berasal
dari bahan alam. Bahan alam ini memiliki aktivitas farmakologis, misalnya antijamur,
antioksidan, antibakteri, dan lain-lain. Dalam mengisolasi senyawa bahan alam yang
murni seperti dedaunan, tentunya diperlukan metode pemisahan, yang paling
sederhana dan bisa digunakan yaitu kromatografi kolom.
3. Analisis limbah lingkungan
Manfaat lainnya dari kromatografi kolom yaitu sebagai analisis limbah yang
ada pada lingkungan. Misalnya untuk mengetahui tingkat pencemaran dari limbah cari.
Dilakukan pemurnian kandungan limbah agar dapat diketahui zat apa saja yang
terkandung pada limbah.
2.5.3 Kromatografi Lapis Tapis
Kelebihan KLT yaitu:
1. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.

29
 2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi,
atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
3. Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau dengan
cara elusi 2 dimensi.
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan
merupakan bercak yang tidak bergerak.
5. Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
6. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
7. Jumlah perlengkapan sedikit.
8. Preparasi sample yang mudah
9. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan
metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).
Kekurangan KLT yaitu:
1. Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang
diharapkan.
2. Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
3. Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun.
2.5.4 Kromatografi Kertas
Kelebihan kromatografi kertas
1. Tidak diperlukan peralatan yang teliti dan mahal
2. Dapat diperoleh hasil yang baik walaupun dengan peralatan dan materi yang sederhana
3. Senyawa yang terpisah dapat dideteksi pada kertas dan diidentifikasi
Kekurangan kromatografi kertas
1. Banyaknya permasalahan menyangkut cara pemasukan fasa gerak, perambatan fasa
gerak, dan penggumpalan
2. Membutuhkan waktu lama
3. Keterbatasan parameter senyawa yang diuji
Aplikasi kromatografi kertas
Kromatografi kertas banyak digunakan sebagai alat dalam penelitian dan analisa.
Beberapa penerapan dari kromatografi kertas adalah sebagai berikut:
1. Penemuan senyawa-senyawa dalam tanaman
2. Analisa logam-logam dalam tanah

30
3. Pemisahan alkaloid (senyawa yang mengandung substansi dasar nitrogen basa,
biasanya dalam bentuk cincin heterosiklik, banyak terdapat pada tanaman)
4. Pemisahan asam lemak
5. Analisa bahan tambahan makanan pada makanan dan AMDK
6. Pengujian rutin urine dan cairan-cairan lainnya yang mengandung asam-asam amino
dan gula (untuk diagnosa suatu penyakit)

31
 BAB III
KESIMPULAN
3.1 Kesimpulan
a. Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponen-komponen
berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen diantara dua fasa
yaitu fase diam dan fase bergerak. Perbedaan kecepatan perpindahan tersebut dapat
disebabkan oleh perbedaan kemampuan masing-masing komponen untuk diserap
(adsorpsi) atau perbedaan distribusi diantara dua fasa yang tidak saling bercampur.
b. Kromatografi dibedakan menjadi beberapa jenis berdasarkan pada teknik kerja yang
dapat digunakan, diantaranya adalah kromatografi kolom, kromatografi kertas,
kromatografi gas, dan kromatografi lapis tipis.
c. Salah satu kegunaan Kromatografi adalah sebagai analisis, yaitu menguji suatu
campuran, komponen-komponennya dan hubungan antar komponen.

32
 DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University
Press. Surabaya.
Adnan, Mochamad. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Yogyakarta:
Andi Offset.
Day, R.A. dan Underwood, A. L. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.
Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan. 2018. Melaksanakan Analisis Secara Kromatografi
Konvensional Mengikuti Prosedur. Jakarta: Pusat Pengembangan dan Pemberdayaan
Pendidik dan Tenaga Kependidikan Pertanian
Khopkar, S.M. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. ITP Press: Bandung.
Khopkar S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press.
Noviyanti, Lenia. 2010. Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom Untuk Pemisahan
Trigliserida Dari Ekstrak Buah Merah (Pandanus Conoideus Lamk.). Surakarta :
Universitas Sebelas Maret
Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan
Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :
Rubiyanto,D. 2013.Teknik Dasar Kromatografi. Yogyakarta:Deepublish

33