MAKALAH FISIKA KIMIA

KROMATOGRAFI

Tugas ini disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah Kimia Fisika

Dosen Pengampu : Dr. Masdianto, M.Si

Oleh :

Desi Maysarah
Dolyna Aritonang
Femi Hartanti
Melinda Setiarsih
Nur Safitri
Yotania

PROGRAM STUDI D III ANALIS KESEHATAN

FAKULTAS KESEHATAN
UNIVERSITAS MH THAMRIN
JAKARTA
2018
 Kata Pengantar

Puji syukur kami haturkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena
dengan karunia-Nya kami dapat menyelesaikan Makalah yang berjudul,
“Kromatografi”.

Pembuatan Makalah ini semata-mata ditujukan sebagai tugas mata kuliah

kimia dasar, adapun yang lainnya sebagai sarana menambah wawasan bagi
pembaca.

Tidak lupa ucapan terimakasih kami kepada Bapak Dr. Masdianto, Msi
selaku dosen pengampu. Kami juga mengucapkan terimakasih kepada pihak-
pihak yang sudah berkontribusi baik langsung maupun tidak langsung dalam
pembuatan Makalah ini.

Tentunya ada hal-hal yang ingin kami berikan kepada pembaca dari hasil
Makalah yang kami buat. Karena itu, kami berharap Makalah ini dapat
memberikan manfaat bagi pembaca

Kami menyadari bahwa dalam penyusunan Makalah ini masih jauh dari
kesempurnaan, untuk itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang
bersifat membangun guna kesempurnaan Makalah ini.

Jakarta, Februari 2019

Penulis

i
 Daftar Pustaka

Kata Pengantar.......................................................................................................i

Daftar Pustaka.......................................................................................................ii

BAB I.......................................................................................................................1

Latar Belakang.....................................................................................................1

Rumusan Masalah................................................................................................2

Tujuan...................................................................................................................2

Manfaat................................................................................................................3

BAB II.....................................................................................................................4

Sejarah Kromatografi...........................................................................................4

Dasar-Dasar Kromatograf....................................................................................5

Prinsip Kromatografi........................................................................................5

Klasifikasi Kromatografi..................................................................................6

Kromatografi Partisi.......................................................................................8

Teknik-teknik Pemisahan.................................................................................9

Klasifikasi/Jenis-jenis Kromatografi..................................................................12

Kromatografi Serapan/Kolom........................................................................12

Kromatografi Kertas.....................................................................................14

Kromatografi Lapisan Tipis (Thin Layer Chromatography, TlC)..................16

Kromatografi Gas...........................................................................................19

Kromatografi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC).................24

Persiapan Sampel dan Standar...........................................................................25

Kromatografi Kertas......................................................................................25

ii
 Kromatografi Lapis Tipis...............................................................................43

Kromatografi Kolom......................................................................................52

BAB III..................................................................................................................61

Kesimpulan........................................................................................................61

Saran...................................................................................................................62

Daftar Pustaka......................................................................................................63

iii
iv
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Sekarang ini deteksi sifat spesifik suatu senyawa menjadi sangat
penting, terutama dalam bidang farmasi, kimia, dan klinik, serta bidang
lainnya. Suatu analisis kimia seperti pengambilan cuplikan, pemisahan
senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan
terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran banyak dilakukan.
Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau
lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang
cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik
kromatografi dan dengan alasan inilah penulis membahas tentang
kromatografi.

Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa

ini telah banyak digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya
seperti detilasi, kristalisasi, pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain
mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih sederhana,
penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan
yang tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi,
Metode ini digunakan, jika dengan metode lain tidak dapat di lakukan
misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit atau campurannya
kompleks.

Tanpa teknik kromatografi, sintesis senyawa murni (atau hampir

murni) akan sangat sukar, dan dalam banyak kasus, hampir tidak
mungkin. Pada umumnya sebelum suatu senyawa diidentifikasi dan dapat
di ukur kadarnya, perlu di pisahkan dari matriknya. Oleh karna itu,
pemisahan merupakan langkah penting dalam analisi kualitatis. Suatu
analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak
1
 berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur. Analisis meliputi
pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa
yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan
pengukuran. Terdapat banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi
merupakan teknik yang paling banyak di gunakan.

Latar belakang dari makalah ini adalah menghadirkan materi dasar

yang akan memperkenalkan dengan berbagai aspek dari proses
kromatografi, menjelaskan dalam istilah yang sederhana bagaimana
prinsip kerja kromato grafi, dan menunjukan beberapa penerapan yang
telah membuat kromatografi tidak dapat diabaikan dalam berbagai bidang
kehidupan

B. Rumusan Masalah
1. Apa pengertian dari kromatografi?
2. Apa saja jenis-jenis atau klasifikasi kromatografi?
3. Bagaimana cara membedakan fase gerak dan fase diam?
4. Bagaimanakah sifat-sifat adsorben dan pelarut dari masing-masing
kromatografi?
5. Bagaimanakah penggunaan masing-masing kromatografi?
6. Apa saja manfaat dari kromatografi?
7. Bagaimana kelebihan dan kekurangan dari masing-masing kromatografi?

C. Tujuan
1. Mengetahui dan memahami pengertian kromatografi.
2. Mengetahui dan memahami pembagian kromatografi.
3. Mengetahui dan memahami cara membedakan fase gerak dan fase diam.
4. Mengetahui penggunaan kromatografi.
5. Mengetahui manfaat kromatografi dan pengaplikasiannya.
6. Mengetahui kelebihan dan kekurangan dari masing-masing jenis
kromatografi.

2
D. Manfaat
1. Menjadikan makalah ini dapat bermanfaat dalam proses perkuliahan baik
bagi penyusun khususnya dan para pembaca pada umumnya.

3
 BAB II
ISI

A. Sejarah Kromatografi

Kromatografi merupakan suatu nama yang diberikan untuk teknik

pemisahan tertentu. Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yaitu χρῶμα
yang berarti warna dan γράφειν yang berarti menulis. Kromatografi
pertama kali di perkenalkan oleh Michael Tsweet pada tahun 1903 yang
merupakan seorang di ahli botani dari Rusia. Dalam percobaannya
Michael Tsweet berhasil memisahkan klorofil dan pigmen pigmen warna
lain dalam ekstrak tumbuhan dengan menggunakan serbuk kalsium
karbonat yang di isikan ke dalam kolom kaca dan petroleum eter sebagai
pelarut. Proses pemisahan itu di awali dengan menempatkan larutan
cuplikan dengan menempatkan larutan cuplikan pada permukaan atas
kalsium karbonat, kemudian di alirkan pelarut petroleum eter, dan
hasilnya berupa pita pita warna yang terlihat sepanjang kolom sebagai
hasil pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak tumbuhan.

Cara asli telah diketengahkan pada tahun 1903 oleh Tsweet, ia telah
menggunakannya untuk menggunakan pemisahan senyawa-senyawa yang
berwarna, dan nama kromatografi diambil dari senyawa yang berwarna.
Meskipun demikian pembatasan untuk senyawa-senyawa yang berwarna
tak lama dan hampir kebanyakan pemisahan-pemisahan secara
kromatografi sekarang diperuntukkan pada senyawa-senyawa yang tak
berwarna, termasuk gas. lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk
melukiskan daerah-daerah yang berwarna bergerak kebawah kolom. Pada
waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi
untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang
pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses
kromatografi.

4
 Perkembangan tentang kromatografi digunakan suatu teknik dalam
bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Akhir tahun 1930 an sampai
tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi
lapisan tipis (TLC) pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan
kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik
sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941, tidak hanya mengubah
kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan
kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan
James mempublikasikan kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir
tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik
analisis yang canggih.

B. Dasar-Dasar Kromatograf

1. Prinsip Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu.
Istilah kromatografi berasal dari kata “chroma” (warna) dan “graphein”
(menuliskan). Teknik pemisahan analitik yang paling banyak digunakan
ditemukan pada tahun 1903 oleh Tswett, ia telah menggunakan
kromatografi untuk pemisahan senyawa- senyawa yang berwarna dan
nama kromatografi diambil dari senyawa yang berwarna

5
2. Klasifikasi Kromatografi

Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi

komponen-komponen dalam fasa diam dan fasa gerak
berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen yang akan
dipisahkan

Kromatografi dapat digunakan untuk preparatif atau

analisa kualitatif dan kuantitatif. Pada dasarnya semua cara
kromatografi menggunakan dua fasa yaitu fasa tetap
(stationary) dan fasa bergerak (mobile), pemisahan-
pemisahannya tergantung pada gerakan relatif dari dua fasa
tersebut. Persyaratan utama kromatografi adalah :
a. Ada fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam tidak
boleh bereaksi dengan fasa gerak.

b. Komponen sampel (contoh) harus larut dalam fasa

gerak dan berinteraksi dengan fasa tetap (diam).

c. Fasa gerak harus bisa mengalir melewati fasa

diam, sedangkan fasa diam harus terikat kuat di
posisinya.

6
Berdasarkan cara kontak antara fasa diam dan fasa gerak, dikenal
kelompok kromatografi kolom dan kromatografi planar,sebagai berikut
:

a. Kromatografi kolom : fasa diam ditahan dalam

sebuah kolom sempit (terbuka di kedua ujungnya).
Fasa gerak mengalir karena efek gravitasi atau
tekanan. Fasa diam umumnya berupa padatan
atau cairan. Fasa gerak umumnya berupa cairan
atau gas dan dialirkan terus menerus. Hasil
pemisahan adalah spesi yang keluar dari kolom.
b. Kromatografi planar : fasa diam didukung oleh
(dilapiskan pada) plat datar atau lembaran. Fasa
gerak bergerak berdasarkan aksi kapiler atau gaya
gravitasi. Fasa diam umumnya adalah padatan,
sedangkan fasa gerak umumnya adalah cairan.
Fasa gerak dialirkan hanya sampai mendekati
akhir bidang fasa diam. Hasil pemisahan berua
spot-spot pada lintasan (tract) yang dijalani oleh
sampel.

Cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan

sifat-sifat dari fasa tetap, yang dapat berupa zat padat atau zat
cair. Jika fasa tetap berupa zat padat maka cara tersebut dikenal
sebagai kromatografi serapan (absorption chromatography),
dan jika zaf cair dikenal sebagai kromatografi partisi (partition
chromatography). Karena fasa gerak dapat berupa zat cair atau
gas maka semua ada empat macam sistem kromatografi.
Keempat rnacam sistem kromatografi tersebut adalah :

a. Fasa gerak zat cair - fasa tetap padat :

komatografi penukar ion.
7
 b. Fasa gerak gas - fasa tetap padat :

kromatografi gas padat

c. Fasa gerak zat cair – fasa tetap zat cair

dikenal sebagai kromatografi partisi dan
kromatografi kertas.

d. Fasa gerak gas - fasa tetap zat cair :

kromatografi gas-air dan kromatografi
kolom kapiler.

Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung

pada senyawa- senyawa yang dipisahkan, sehingga
terdistribusi sendiri diantara fasa gerak dan fasa tetap dalam
perbandingan yang sangat berbeda-beda dari satu senyawa
terhadap senyawa yang lain.

3. Kromatografi Partisi

Perbedaan yang pokok adalah terletak pada sifat dari

penyerap, dimana dalam kromatografi partisi berupa materi yang
berpori, seperti kieselguhr, yang dilapisi dengan lapisan dari zat
cair sering menggunakan air. Fasa tetap adalah lapisan zat cair dan
zat padat yang berperan sebagai penyangga/penyokong. Jika fasa-
fasa bergerak dan tetap keduanya berupa zat cair maka akan
diperoleh kromatografi zat cair-cair.

Kecepatan bergerak dari suatu komponen dari campuran

tidak tergantung pada kelarutannya dalam fasa tetap, yang berupa
zat cair sehingga senyawa-senyawa yang lebih larut akan bergerak
lebih lambat turunnya dalam kolom daripada yang kurang
kelarutannya. Selama bergerak senyawa-senaywa mengalami partisi

8
 di antara dua fasa, dan pemisahan terjadi karena perbedaan dalam
koefisien partisi.

Kromatografi kertas merupakan partisi yang spesial, dimana

lembaran kertas adalah sebagai pengisi/pengganti dari kolom.
Kromatografi campuran dari senyawa yang dipisahkan membentuk suatu
jalur dalam kolom

4. Teknik-teknik Pemisahan
Untuk memperoleh pemisahan dari jalur-jafur komponen harus
dikerjakan lebih lanjut dengan melakukan satu dari tiga macam cara:
analisa elusi, analisa frontal atau analisa perpindahan gerakan.

a. Analisa elusi

Analisa elusi digunakan secara ekstensif dalam kromatografi

partisi. Dalam elusi aliran dari fasa bergerak (eluting agent) adalah
terus menerus hingga campuran terpisah sempurna menjadi
komponen- komponennya. Harus diperhatikan bahwa fasa bergerak
yang dipilih harus tidak mempunyai efek terhadap fasa tetap atau
hanya sangat lemah diserap olehnya.

Pengaliran pelarut secara terus menerus melalui kolom disebut

elusi. Elusi bisa dilakukan dengan memanfaatkan gaya gravitasi,
gaya kapiler, atau tekanan mekanis. Selama proses elusi berlangsung,
spesi sampel bisa berada didalam fasa gerak (berarti ikut mengalir)
atau berinteraksi dengan fasa diam (berarti tidak bergerak).

Tiap molekul satu jenis spesi akan bergantian masuk dan

keluar fasa diam dengan perbandingan waktu yang sama dan
menghasilkan gerakan kelompok yang sama. Waktu pergerakan spesi

9
 adalah waktu yang dihabiskan oleh spesi ketika molekul spesi berada
dalam fasa gerak. Karena tiap spesi memiliki perbandingan waktu
yang khas untuk berada dalam fasa gerak (ketika tidak berinteraksi
dengan fasa diam), maka terjadi pemisahan kelompok-kelompok spesi.

Elusi pertama-tama telah digunakan oleh TSWETT tahun 1903

untuk pemisahan pigmen-pigmen daun, karena adanya warna maka
cepat terlihat lokasinya dalam kolom. Senyawa-senyawa tak berwarna
dapat juga dilihat lokasinya, karena flouresensi dalam sinar ultra-
violet. Sekali pemisahan terjadi pita komponen dapat diambil dengan
jalan memotong dari bagian-bagian yang mengandung berbagai
komponen, kemudian diekstrak dengan pelarut yang sesuai. Cara lain,
aliran dari zat pengelusi dapat diteruskan hingga tiap-tiap komponen
tercuci sempurna dari kolom. Untuk mengetahui tiap-tiap komponen
dapat dideteksi dengan menggunakan pereaksi kimia yang cocok atau
test fisika.

Ekor (tailing)yaitu kejadian yang selalu terjadi dalam kromatografi

serapan bila teknik elusi yang digunakan tidak sesuai. Ekor menaikkan
kelebaran dari pita-pita hingga ada tendensi untuk menimbulkan
penindihan pita satu dengan pita lainnya (overlap).

b. Analisa Frontal

Di dalam analisa frontal, larutan campuran ditambahkan terus

menerus hingga kolom jenuh. Larutan yang keluar dari kolom sebelah
bawah diukur terus menerus. Sebagai contoh, campuran yang
mengandung tiga komponen A, B, dan C. Anggaplah bahwa
komponen A yang paling lemah diserap oleh penyerap dalam kolom,
sedang komponen C yang paling kuat diserap dan komponen B lebih
kuat daripada A tetapi lebih lemah diserap daripada C. Bila campuran

10
 ditambahkan terus menerus maka A akan mempunyai tendensi keluar
paling dahulu daripada yang lainnya dan pada tingkat pertama akan
diperoleh A yang murni. Komponen B lebih kuat diserap daripada A
dan lebih lemah daripada C, hingga ia akan bergerak yang tak akan
mendahului A. Pada langkah kedua akan diperoleh terutama B tetapi
tercampur dengan A karena pemasukan yang terus nienerus dari
carnpuran. Sedangkan pada langkah ketiga akan terdiri atas campuran
asal A + B + C. Dalam cara ini hanya pada langkah pertama akan
diperoleh kornponen yang murni. Pemisahan secara sempurna tidak
dapat diperoleh.

c. Analisa Perpindahan Gerakan

Analisa perpindahan gerakan mungkin dapat dipandang sebagai

hibrida dari analisa elusi dan frontal, seperti dalam metode elusi,
sejumlah kecil dari campuran diletakan di atas kolom, kemudian
larutan senyawa yang lebih kuat diserap daripada setiap komponen
dari campuran ditambahkan terus menerus dari atas kolom. Senyawa
ini dikenal sebagai pengganti (displacer). Campuran kemudian
bergerak ke bawah pada kecepatan yang sama seperti pengganti yang
ditambahkan dan campuran akan terpisah sendiri menjadi pita-pita dari
komponen- komponen yang murni, urutan dari pita-pita merupakan
urutan dari kekuatan penyerapan pada penyerap. Tiap-tiap pita murni
bekerja sebagai pengganti untuk komponen-komponen yang
mendahuluinya dannpita yang paling akhir merupakan pita yang
paling kuat diserap akan didorong oleh pengganti

11
C. Klasifikasi/Jenis-jenis Kromatografi

1. Kromatografi Serapan/Kolom
a. Serapan Kolom

Untuk memisahkan suatu campuran, kolom seperti gambar

(A) dapat digunakan dan diisi dengan penyerap zat padat seperti
alumina sebagai fasa tetap dan dialiri dengan pelarut seperti
benzena sebagai fasa gerak

Sejumlah kecil cuplikan dari campuran dimasukkan melalui

sebelah atas dari kolom yang kemudian membentuk jalur-jalur serapan
dari senyawa, seperti gambar (B). Bila pelarut dibiarkan mengalir
melalui kolom ia akan mengangkut senyawa-senyawa yang
merupakan komponen-komponen dari campuran.

Kecepatan bergerak dari suatu komponen tergantung pada

berapa besarnya zat terhambat/tertahan oleh penyerap di dalam
kolom. Jadi suatu senyawa yang diserap lemah akan bergerak lebih
cepat daripada yang diserap kuat. Akan terlihat bahwa jika

12
perbedaan-perbedaan dalam serapan cukup besar maka akan terjadi
pemisahan yang sempurna, seperti terlihat pada gambar (B).
Bentuk kolom serapan yang sederhana telah ditunjukkan seperti
dalam garnbar (B). Bentuk ini merupakan jenis yang pertama-tama
digunakan untuk pemisahan-pernisahan kromatografi hingga sampai
sekarang

Kolom krornatografi dapat berupa pipa gelas yang dilengkapi

dengan kran dan gelas penyaring di dalamnya. Meskipun kolom-kolom
dapat dibuat secara sederhana dari tabung gelas, kadang-kadang buret pun
dapat digunakan. Ukuran kolom tergantung pada banyaknya zat yang
akan dipisahkan. Untuk menahan penyerap yang diletakkan di dalam
kolom dapat digunakan gelas wool atau kapas, lihat gambar berikut.

13
 b. Pengisian Kolom
Pengisian kolom adalah tidak mudah untuk mernperoleh pengisian
kolom yang homogen, tetapi perlu dicoba hingga mendapatkan hasil
yang maksimurn. Pengisian yang tidak teratur dari penyerap akan
mengakibatkan merusak batas- batas pita krommatografi. Putusnya
penyerap dalam kolom biasanya disebabkan oleh gelembung-
gelembung udara selama pengisian. Untuk rnencegah hal-hal tersebut
sedapat mungkin zat pengisi/penyerap dibuat menjadi "bubur" dengan
pelarut kemudian dituangkan perlahan-lahan dalam tabung. Jika
penyerap dibiarkan turun perlahan-lahan dapat ditolong dengan
mengguncang perlahan-lahan maka akan diperoleh pengisian yang
homogen. Jika besarnya partikel-partikel penyerap sama, akan lebih
mudah untuk mendapatkan pengisian yang homogen. Tetapi hal ini
sangat jarang. Harus diperhatikan penyerap yang telah dimasukkan
jangan sampai ada bagian yang kering baik selama pengisian atau
selama pemisahan.

2. Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas termasuk dalam kelompok kromatografi
planar, dimana pemisahannya menggunakan medium pemisah dalam
bentuk bidang datar yaitu benuk kertas. Seluruh bentuk kromatografi
memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada
padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui
fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-
sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang
berbeda pula.

Kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat

seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Berbagai jenis pemisahan yang sederhana dengan Kromatografi
14
kertas telah dilakukan dimana proses dikenal sebagai "analisa
Kapiler". Metoda-metoda ini sangat sesuai dengan kromatografi
serapan, dan sekarang kromatografi kertas dipandang sebagai
perkembangan dari sistem partisi. Salah satu zat padat dapat
digunakan untuk menyokong fasa tetap yaitu bubuk selulosa.

Mula-mula telah dilakukan pemisahan asam-asam amino dan

peptida- peptida yang merupakan hasil hidrolisa protein wool
dengan suatu cara di mana kolom yang berisi bubuk diganti dengan
lembaran kertas dan kemudian diletakkan dalam bejana tertutup
yang berisi uap jenuh larutan. Ini adalah merupakan jenis dari
sistem partisi dimana fasa tetap adalah air, disokong oleh molekul-
molekul selulose dari kertas, dan fasa bergerak biasanya merupakan
campuran dari satu atau lebih pelarut- pelarut organik dan air.

Suatu hal yang perlu diperhatikan disini adalah tentang

peralatan. Pada kromatografi Kertas peralatan yang dipakai tidak perlu
alat-alat yang teliti atau mahal. Hasil-hasil yang baik dapat
diperoleh dengan peralatan dan materi-materi yang sangat
sederhana. Senyawa-senyawa yang terpisahkan dapat dideteksi pada
kertas dan dapat segera diidentifikasi. Bahkan komponen-komponen
yang terpisahkan dapat diambil dari kertas dengan jalan
memotong-motongnya yang kemudian dilarutkan secara terpisah.

Meskipun kromatografi kertas sangat mudah pengerjaannya, tetapi

sangat sulit dijelaskan apabila membadingkannya dengan kromatografi
lapis tipis. Penjelasannya tergantung tingkatan pemilihan pelarut yang
anda gunakan, dan beberapa sumber untuk mengatasi masalah secara
tuntas. Jika anda telah pernah melakukannya, ini sangat membantu jika
anda dapat membaca penjelasan bagaimana kromatografi lapis tipis
bekerja. Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari
gula sederhana, yaitu glukoa.
15
 Sangat menarik untuk mencoba untuk menjelaskan kromatografi kertas
dalam kerangka bahwa senyawa-senyawa berbeda diserap pada tingkatan
yang berbeda pada permukaan kertas. Dengan kata lain, akan baik
menggunakan beberapa penjelasan untuk kromatografi lapis tipis dan
kertas. Sayangnya, hal ini lebih kompleks daripada itu! Kompleksitas
timbul karena serat-serat selulosa beratraksi dengan uap air dari atmosfer
sebagaimana halnya air yang timbul pada saat pembuatan kertas. Oleh
karenanya, anda dapat berpikir yakni kertas sebagai serat-serat selulosa
dengan lapisan yang sangat tipis dari molekul- molekul air yang berikatan
pada permukaan. Interaksi ini dengan air merupakan efek yang sangat
penting selama pengerjaan kromatografi kertas.

3. Kromatografi Lapisan Tipis (Thin Layer Chromatography, TlC)

Teknik TLC/KLT fasa diam (terutama silika, alumina, dan
selulosa) dilapiskan di permukaan sebuah plat pendukung (umumnya
dibuat dari bahan kaca atau lembaran logam Al). Bila noda telah kering
plat diletakkan secara vertikal dalam bejana yang sesuai dengan tepi
yang di bawah dicelupkan ke dalam fasa gerak, maka pemisahan
kromatografi penaikan akan diperoleh. Pada akhir perkembangan,
pelarut dibiarkan menguap dari plat dan noda-noda yang terpisah
dilokalisir dan diidentifikasi dengan cara fisika dan kimia seperti yang
digunakan dalam kromatografi kertas.
16
a. Metoda Kromatografi Lapisan Tipis
Kromatografi serapan dalam bentuk lapisan tipis yang
dilekatkan pada suatu penyokong telah diketengahkan dalam
tahun 1938. Pertamakali dicoba untuk memisahkan terpen-terpen.

Pada "Cromatostrip" yang dibuat melapisi ` potongan gelas kecil

dengan penyerap yang dicampur dengan pati atau perekat sebagai
pengikat.

Perkembangan lebih lanjut STHAL telah mernbuat cara-cara

pembuatan potongan gelas dan cara melapiskannya serta
menunjukkan bahwa kromatografi lapisan tipis dapat digunakan untuk
keperluan yang luas dalam pernisahan- pemisahan. Metoda
kromatografi kertas memberikan hasil pemisahan dengan waktu yang
lebih cepat dan lebih baik.

b. Jenis Penyerap

Sifat-sifat umum dari penyerap untuk kromatografi lapisan

tipis adalah mirip dengan sifat-sifat penyerap untuk kromatografi
kolom. Dua sifat yang penting dari penyerap adalah besar partikel
dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat
tergantung pada jenis penyerap.

Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 - 25 mikron.

Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan
hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan
hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya
halus. Sedangkan dalam kolom partikel yang sangat halus akan

17
 mengakibatkan aliran pelarut menjadi lambat, pada lapisan tipis
butiran yang halus memberikan aliran pelarut yang lebih cepat.
Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan dalam
kromatografi lapisan tipis adalah sebagai berikut dalam tabel

Zat Padat Digunakan Untuk Memisahkan

- Silika  Asam-asam amino, alkaloid, gula, asam-asam lemak,

lipida, minyak esensial, anion dan kation organik,
sterol, terpenoid

- Alumina  Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin- vitamin,

karoten, asam-asam amino

- Kieselguhr
 Gula, oligosakarida, asam-asam dibasa, asam- asam
lemak, Irigliscrida, asam-asam amino, steroid
alkaloid, nukleotida

-Bubuk selulosa  Asam-asam amino

- Pati  Asam-asam amino,protein

18
 4. Kromatografi Gas
Kromatografi gas merupakan sekelompok teknik pemisahan
kromatografi yang menggunakan gas sebagai fasa gerak. Karena gas bersifat
menyebar ke ruang disekelilingnya. maka tidak ada kromatografi gas dalam
bentuk planar, semua kromatografi gas berbentuk kolom. Kolom untuk
kromatografi gas biasanya dibuat dari bahan logam nir-karat atau dari bahan
gelas. Di dalam alur pemisahan, fasa sampel juga berupa gas. Karena
umumnya sampel untuk kromatografi gas berfasa cair, maka sistem pemisahan
kromatografi gas memerlukan pemanasan. Disisi lain, stabilitas gas sangat
dipengaruhi temperatur, sehingga walaupun sampel sudah berfasa gas, sistem
pemanasan untuk memungkinkan pengendalian temperatur tetap diperlukan.

Kromatografi gas (Gas chromatography, disingkat GC) termasuk alat-

alat analisa. Analisa dapat dibagi menjadi :
a. Analisa Kualitatif, yaitu penentuan sifat-sifat dari suatu komponen atau
campuran dari komponen.
b.Analisa Kuantitati, yaitu penentuan jumlah dari suatu komponen atau
komponen-komponen dalam suatu campuran.

Kromatografi gas dijajarkan sebagai cara analisa yang dapat

digunakan untuk menganalisa senyawa -senyawa organik. Berdasarkan
fasa diam, dikenal ada dua tipe kromatografi gas yaitu :

a. Kromatografi padat- gas (Gas Solid Cromatography, GSC).

b. Kromatografi cairan- gas (Gas Liquid Cromatography, GLC).

Dalam kedua hal ini sebagai fasa gerak adalah gas (hingga
keduanya disebut kromatografi gas) tetapi fasa diamnya berbeda .
Meskipun demikian kedua cara tersebut mempunyai banyak persamaan
cara kerja. Pada GSC kita mempunyai absorbsi (absorpsi) dan dalam

19
GLC kita mempunyai partisi (larutan). Pengoperasian GSC memerlukan
tingkat keahlian yang lebih tinggi dari GLC, shingga relatif jarang digunakan.
penyebabnya adalah GSC berdasarkan fasa diam padat, sehingga gaya tambat
analit berdasarkan adsorpsi fisik. Gaya tambat ini bersifat semi permanen terhadap
molekul polar atau molekul aktif sehingga proses adsorpsi bersifat tidak linier,
akibatnya pik hasil elusi menjadi sangat berekor (tailing). GLC relatif lebih
mudah dioperasikan sehingga digunakan secara luas disegala bidang sains, dan
nama GLC sering disingkat menjadi Kromatografi Gas (GC).

a. Kromatografi Padat-Gas (Gas Solid Cromatography, GSC).

Kromatografi Gas adalah suatu teknik untuk memisahkan campuran

zat yang mudah menguap dengan cara melewatkan aliran gas pada suatu
fasa diam (stationary phase). Dasar kerja dari GSC adalah adsorbsi
(serapan). Dengan alasan ini maka GSC sangat sukar untuk digunakan
secara berulang dengan hasil yang sama. Hal ini disebabkan oleh
kenyataan- kenyataan bahwa :

1) Aktivitas dari penyerap (adsorbent)

tergantung pada cara pembuatannya.

2) Juga aktivitas tergantung pada bagaimana ia

diperlakukan setelah pembuatannya.

Keadaan 1 dan 2 sangat sukar untuk distandarisasi. Hal-hal inilah

yang menyebabkan "Reproducibility" yang rendah dari GSC. Yang sering
dijumpai adalah :

1) Puncak-puncak berekor disebabkan

permukaan aktif yang tidak
homogen dari penyerap.
2) Waktu retensi relatif panjang.

3) Waktu retensi sangat tergantung pada jumlah dari cuplikan.

20
 4) Kernungkinan penyerap.dapat berperan sebagai katalisator yang
aktif.

Itulah sebabnya pengguanaan dari GSC sangat terbatas, baik

untuk senyawa yang mempunyai titik didih yang rendah maupun tinggi.
Meskipun demikian ada keuntungan dari GSC bila dibandingkan dengan
GLC. Fasa diam tidak dapat diuapkan, karena tekanan uap dari padatan
sangat rendah. Hingga dapat menggunakan detektor-detektor yang sensitif,
karena di sini tidak terjadi "column bleeding".

Dalam tahun akhir-akhir ini GSC menjadi lebih penting yaitu

setelah diketemukannya penyerap-penyerap yang lebih baik. Contoh-
contoh penyerap adalah :

1) "grafite-coal" : dikenal sebagai "spheron", strukturnya sangat homogen

(dibandingkan dengan diamond) : ini digunaaan terhadap senyawa-
senyawa polar yang titik didihnya tinggi.

2) “molecular sieves" : ini merupakan zeolit buatan (= Na- atau CaAI-

silikat), dengan pori-pori yang sangat kecil/halus di dalamnya. Ukuran
dari diameter pori dinyatakan dalam A°. Sebagai contoh "Linde",
mempuyai ukuran dari 3A° hingga 13A°. Zeolit sangat stabil, pada
suhu hingga 600°C. Molecular sieves hanya menyerap molekul-
molekul yang lebih kecil dari pori- porinya. Air sangat cepat diserap
hingga merupakan pengering yang sangat efisien. Molecular
sieves mempunyai sifat katalisator yaitu dapat merupakan zat
dehidrator (dehydrating agents). Sebagai contoh zeofit dapat
mengubah alkohol menjadi hidrokarbon/gasolin : R-OH → R-H.
Sebelum digunakan biasanya molecular sieves diaktifkan dengan
memanaskannya selama 12 jam pada suhu 150°C sambil dialiri gas H2
yang kering.

21
 Kegunaan molecular pemisahan gas-gas seperti Perkembangan
dalam GSC pada saat sekarang yaitu digunakannya polimer- polimer yang
berpori seperti PORAPAK dan POLYPAK (nama perdagangannya) juga
CHROMOSORB. hidrokarbon-hidrokarbon menyerap sangat kuat. CO2
dan prosesnya tidak dapat balik sehingga zeolit tidak digunakan bila CO 2
dipakai sebagai gas pengangkut.

Penyerap-penyerap ini sangat cocok untuk pemisahan :

1) Senyawa-senyawa yang sangat polar seperti H20, NH3, R-NH2,

R-OH dan glikol-glikol, dan asam-asam lemak rendah.

2) Juga untuk seperti CO2, N2O,O2 juga yang lainnya.

Kromatografi gas yang paling tua digunakan adalah GSC.

Dalam tahun 1800 gas-gas telah dimurnikan dengan menyerapkan
pada fasa diam yang berupa : alumina (AI 2 0 3 ), atau pada silica gel
(Si O, pasir yang dimurnikan). Kadang-kadang penyerap ini menjadi
tidak aktif bila terkena oleh air

b. Kromatografi Gas-Cair (GLC) atau Kromatografi Gas (GC)

Prinsip kerja kromatografi gas adalah sampel (cuplikan/analit)
diinjeksikan ke dalam kolom dan diuapkan lalu dielusi oleh aliran gas
inert (sebagai fasa gerak). Pada kromatografi gas, fasa gerak tidak
berinteraksi dengan molekul-molekul analit. Fungsi fasa gerak, hanya
berfungsi sebagai transpor analit atau cuplikan untuk bergerak di
sepanjang kolom. Proses pemisahan terjadi karena perbedaan interaksi
analit dengan fasa diam. Aliran gas dari gas pengangkut akan membawa
cuplikan yang telah teruapkan masuk ke dalam kolom. Kolom akan
memisahkan komponen- komponen dari cuplikan. Kemudian komponen-
komponen dideteksi oleh detektor, dan sinyal dalam bentuk puncak akan
dihasilkan oleh pencatat.
22
 Keuntungan-keuntungan yang ditunjukkan oleh GLC :
1) Kecepatan

Gas yang merupakan fasa bergerak sangat cepat

mengada- kan kesetimbangan antara fasa bergerak dengan
fasa diam.Kecepatan gas yang tinggi dapat juga
digunakan.Hingga waktu pemisahan sangat cepat (diukur
dalam menit).

2) Sederhana

Alat GLC relatif sangat mudah dioperasikan. Interprestasi

langsung dari data yang diperoleh dapat dikerjakan. Harga dari alat
GLC relatif murah.

3) Sensitif

GLC sangat sensitif. Alat yang paling sederhana dapat

mendeteksi konsentrasi dalam ukuran 0,01% (= 100 ppm).
Alat- alat GLC yang lebih rumit dapat mendeteksi senyawa
yang Konsentrasirrya hanya beberapa

Alat yang tertentu sekarang dapat dibuat dengan

kemampuan mendeteksi "parts per billion", hingga dalam
jangkauan pikogram = 10 g.

Disebabkan sensitivitas yang tinggi dari GLC maka

hanya memerlukan sejumlah kecil dari cuplikan, biasanya
dalam ukuran mikroliter.

4) Pemisahan : (resolution = performance).

Dengan GLC memungkinkan untuk memisahkan moleku-

molekul dari suatu campuran, dimana hal ini tidak mungkin
dipisahkan dengan cara-cara yang lain

Misalnya pemisahan metil ester-metil ester dari :

23
 a) Asam stearat dengan ttd 232°C pada tekanan
15 mmHg CH3(CH,)t6COOH.

b) Asam oleat dengan ttd 229°C pada tekanan 15

mm Hg CH3(CH,)7CH = CH(CHZ)7COOH

c) Asam linoleat dengan ttd 237°C pada tekanan I5 mm Hg

CHj(CHZ)4 CH = CH = CHCHZCH = CH (CH,)7COOH.

Senyawa-senyawa tersebut tak mungkin dipisahkan dengan

cara distilasi atau dengan ekstraksi, tetapi sangat mudah
dipisahkan dengan GLC, yang hanya membutuhkan waktu
sekitar 23 menit.

5) Analisa dapat digunakan sebagai :

a) Analisa kualitatif yaitu dengan membandingkan waktu

retensi.

b) Analisa kuantitatif yaitu dengan penghitungan luas puncak.

c) Alat GLC dapat dipakai dalam waktu yang lama dan

berulang- ulang.

5. Kromatografi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) adalah suatu metode
kromatografi yang mampu memisahkan campuran makromolekul,
senyawa ionik, produk alam yang labil, senyawa polimerik dan kelompok
polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyarian
berfraksi, penyerapan atau penukaran ion.

24
 Ditinjau dari sistem peralatannya KCKT termasuk kromatografi
kolom karena fasa diamnya diisikan atau terpacking dalam kolom. Dan
bila ditinjau dari proses pemisahannya KCKT digolongkan dalam
kromatografi adsorpsi atau kromatografi partisi. KCKT/HPLC adalah alat
yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana
pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan
kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.

Pemisahan secara kromatografi dalam KCKT adalah hasil interaksi

spesifik anatara molekul sampel dengan fasa diam atau fasa gerak.KTKC
juga merupakan teknik kromatofrafi yang paling banyak digunakan,
dengan keunggulan-keunggulan:

a. Sensitif dan mudah disesuaikan untuk analisis

kuantitatif.

b. Cocok untuk pemisahan spesi yang mudah menguap

dan spesi yang mudah rusak oleh panas,

D. Persiapan Sampel dan Standar

1. Kromatografi Kertas
a. Persiapan Sampel dan Standar
Sampel dalam bentuk cair biasanya langsung di totolkan diatas
kertas, seanndainya sampel tersebut terlalu encer dilakukan penguapan
sampai agak kental.

Sampel dalam bentuk padat sebelum dilakukan pemisahan dengan

kromatografi kertas harus dilakukan preparasi terlebih dahulu dengan
cara dihaluskan dan dilarutkan dengan pelarut organik misal
khloroform/heksan/dietil eter/alkohol dan lain-lain sampai diperoleh

25
sampel yang siap untuk ditotolkan diatas kertas.

b. Langkah Kerja Kromatografi Kertas

Setetes dari larutan cuplikan yang mengandung
campuran yang akan dipisahkan diteteskan/diletakkan pada
daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana
ia akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah
kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai
dengan satu ujung dimana tetesan cuplikan ditempatkan dan
tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan
sampai noda tercelup karena senyawa yang akan dipisahkan akan
terlarut dari kertas), lihat gambar :

Pelarut bergerak melalui serat-serat dari kertas oleh gaya

kapiler dan menggerakkan komponen-komponen dari campuran
cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Perlu
diperhatikan bahwa per- mukaan dari kertas jangan sampai terlalu
basah dengan pelarut karena hal ini tak akan memisahkan sama
sekali atau daerah-daerah noda akan menjadi kabur. Bila
permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup
jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, maka kertas
diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi
tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering.

Jika senyawa-senyawa tak berwarna maka mereka

dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Cara yang biasa adalah
26
menggunakan suatu pereaksi atau pereaksi-pereaksi yang
memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari
senyawa-senyawa. Sering juga menggunakan cara deteksi dengan
sinar ultra ungu atau teknik radio kimia. Bila daerah- daerah dari
noda yang terpisah telah dideteksi, adalah perlu untuk
mengidentifikasi tiap-tiap individu dari senyawa.

Metoda identifikasi yang paling mudah adalah

berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan
pelarut, menggunakan harga Rf. Terutama pada gugus-gugus yang
besar dari senyawa-senyawa yang susunan kimianya mirip, seperti
asam-asam amino, harga Rf sangat berdekatan satu sama lain.
Dalam hal ini perlu melakukan teknik dua jalan. Kertas yang
berbentuk persegi digunakan dan cuplikan ditempatkan pada satu
sudut. Pengembangan dengan campuran pelarut 1, dengan ujung
kertas AB dicelupkan, memberikan pemisahan sebagian seperti
ditunjukkan dalam gambar 5a. Lembaran kertas diambil dan
dikeringkan dan kemudian dimasukkan dalam bejana kedua
dengan ujung AC dicelupkan dalam pelarut 2. Pengembangan
dengan pelarut ini, diikuti dengan pengeringan dan pemberian
pereaksi tertentu akan memberikan noda-noda seperti gambar 5b.

27
 Kertas saring dapat digantungkan/diletakkan sehingga
pelarut bergerak ke atas, ke bawah atau mendatar. Hasil-hasil dari
metoda pertama dan kedua adalah mirip tetapi berbeda dari metoda
ketiga.

Dalam metoda penaikkan (ascending) kertas dicelupkan

hingga ujung di mana aliran mulai bergerak terletak sedikit di atas
permukaan dari pelarut dan pelarut naik melalui serat-serat dari
kertas oleh gaya kapiler. Di dalam metoda penurunan (descending)
ujung alas dari kertas dicelupkan dalam pelarut dan mengalir,
meskipun diawali oleh gaya kapiler diteruskan oleh gravitasi.
Metoda mendatar (horizontal) sangat berbeda dari kedua metoda di
atas. Noda cuplikan ditempatkan pada pusat dari kertas (biasanya
kertas saring berbentuk bulat) dan pelarut diteteskan juga di pusat
kertas. Aliran juga oleh gaya kapiler, senyawa-senyawa dalam
campuran segera berkembang dengan pelarut.

Bila akan melakukan pemisahan dengan kromatografi

kertas, maka hal- hal yang perlu diperhatikan adalah :
1) Metoda (penaikan, penurunan atau mendatar)
2) Macam dari kertas
3) Pemilihan dan pembuatan pelarut (fasa bergerak)
4) Kesetimbangan dalam bejana yang dipil
5) Pembuatan cuplikan
6) Waktu pengembangan
7) Metoda deteksi dan identifikasi

Di samping sifat-sifat dari kertas dan pelarut, ada faktor-

faktor penting yang mempengaruhi pemisahan yaitu : suhu, besarnya
bejana, waktu pengembangan dan arah dari aliran pelarut.

28
c. Alat dan Teknik
Kertas digantungkan pada wadah yang berisi lapisan tipis
pelarut atau campuran pelarut yang sesuai didalamnya. Perlu
diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis pada bercak
diatasnya. Gambar berikutnya tidak menunjukkan terperinci
bagaimana kertas di gantungkan karena terlalu banyak
kemungkinan untuk mengerjakannnya dan dapat mengacaukan
gambar. Kadang-kadang kertas hanya digulungkan secara bebas
pada silinder dan diikatkan dengan klip kertas pada bagian atas dan
bawah. Silinder kemudian ditempatkan dengan posisi berdiri pada
bawah wadah.

Alasan penutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa

astmosfer dalam gelas kimia terjenuhkan denga uap pelarut.
Penjenuhan udara dalam gelas kimia dengan uap menghentikan
penguapan pelarut sama halnyadengan pergerakan pelarut pada
kertas.

Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-

komponen yang berbeda dari campuran tinta akan bergerak pada laju
yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan

29
bercak warna. Gambar menunjukkan apa yang tampak setelah
pelarut telah bergerak hampir seluruhnya ke atas

Dengan sangat mudah dijelaskan melihat dari kromatogram

akhir dari pena yang ditulis pada pesan yang mengandung pewarna
yang sama dengan pena 2. Anda juga dapat melihat bahwa pena 1
mengandung dua campuran berwarna biru yang kemungkinan salah
satunya mengandung pewarna tunggal terdapat dalam pena 3. Nilai
Rf.

Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan

jarak yang ditempuh pelarut; beberapa lainnya tetap lebih dekat pada
garis dasar. Jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk
senyawa tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap
sama, misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat. Jarak
relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa
berlaku rumus sebagai berikut: :

Misalnya, jika salah satu komponen dari campuran bergerak

30
 9.6 cm dari garis dasar, sedangkan pelarut bergerak sejauh 12.0 cm,
jadi Rf untuk komponen itu :

Dalam contoh kita melihat ada beberapa pena, tidak perlu

menghitung nilai Rf karena anda akan membuat perbandingan
langsung dengan hanya melihat kromatogram. Anda membuat
asumsi bahwa jika anda memiliki dua bercak pada kromatogram
akhir dengan warna yang sama dan telah bergerak pada jarak yang
sama pada kertas, dua bercak tersebut merupakan senyawa yang
hampir sama. Hal ini tidak selalu benar. Anda dapat saja mempunyai
senyawa-senyawa berwarna yang sangat mirip dengan nilai Rf yang
juga sangat mirip.

d. Jika Substansi Tidak Berwarna

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan membuat bercak

menjadi tampak dengan mereaksikannya dari beberapa pereaksi
yang menghasilkan produk yang berwarna. Contoh yang baik yaitu
kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.

Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan

ingin memisahkan asam amino tertentu yang terdapat dalam
campuran. Untuk menyederhanakan, mari berasumsi bahwa anda
telah mengetahui kemungkinan campuran hanya mengandung lima
asam amino yang umum.

Setetes larutan campuran ditempatkan pada garis dasar

kertas, dan dengan cara yang sama ditempatkan asam amino yang

31
telah diketahui diteteskan disampingnya. Kertas lalu ditempatkan
dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya.
Dalam gambar, campuran adalah M, dan asam amino yang telah
diketahui ditandai 1 sampai 5.

Posisi pelarut depan ditandai dengan pinsil dan

kromatogram lalu dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan
ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan
senyawa berwarna, utamanya coklat atau unguu.

Gambar di sebelah kiri menunjukkan kertas setelah dilalui

pelarut hampir pada bagian atas kertas. Bercak masih belum
tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang mungkin tampak
setelah penyemprotan ninhidrin. Tidak diperlukan untuk
menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat
membandingkan bercak dalam campuran dengan asam amino-
asam amino yang telah diketahui berdasarkan posisi dan warnanya.

Dalam contoh ini, campuran mengandung asam amino yang

diberi tanda 1,4 dan 5. Bagaimana jika campuran mengandung
asam amino lain selain dari asam amino yang anda gunakan untuk
perbandingan? Akan terdapat bercak dalam campuran yang tidak
sesuai dari asam amino yang telah diketahui. Anda harus

32
 mengulangi percobaan menggunakan asam amino-asam amino
sebagai bahan perbandingan.

e. Kromatografi Kertas dua Arah

Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam

menyelesaikan masalah pemisahan substansi yang memiliki nilai Rf
yang sangat serupa.

Pada senyawa-senyawa berwarna lebih mudah melihat apa

yang terjadi. Anda dapat mengerjakannya secara sempurna hal ini
dengan senyawa-senyawa yang tidak berwarna, tetapi anda harus
menggunakan banyak imajinasi dalam menjelaskan apa yang terjadi.

Kromatogram dibuat dari bercak tunggal dari campuran yang

ditempatkan kedepan dari garis dasar. Kromatogram ditempatkan
dalam sebuah pelarut sebelum dan sesudah sampai pelarut mendekati
bagian atas kertas. Dalam gambar, posisi pelarut ditandai dengan
pinsil sebelum kertas kering. Posisi ini ditandai sebagai SF1 yaitu
pelarut depan untuk pelarut pertama. Kita akan menggunakan dua
pelarut yang berbeda.

Jika anda melihatnya lebih dekat, anda dapat melihat bahwa

bercak pusat besar dalam kromatogram sebagian biru dan sebagian
hijau. Dua pewarna dalam campuran memiliki nilai Rf yang hampir
sama. Tentunya, nilai-nilai ini bisa saja sama, keduanya memiliki
warna yang sama; dalam hal ini anda tidak dapat mengatakan bahwa

33
ada satu atau lebih pewarna dalam dalam bercak itu. Apa yang anda
kerjakan sekarang adalah menunggu kertas kering seluruhnya, dan

putar 90o C dan perlakukan kromatogram kembali dengan pelarut

yang berbeda.

Gambar berikutnya menunjukkan apa yang mungkin terjadi

pada berbagai bercak pada kromatogram awal. Posisi pelarut kedua
juga ditandai.Tentunya anda tidak dapat melihat bercak-bercak
dalam posisi awal dan akhir; Bercak-bercak telah bergerak!
Kromatogram akhir akan tampak seperti ini.

Kromatografi dua arah secara seluruhnya terpisah dari

campuran menjadi empat bercak yang berbeda. Jika anda akan
mengidentifikasi bercak-bercak dalam campuran, secara jelas anda
tidak dapat melaksanakannya dengan perbandingan substansi pada
kromatogram yang sama seperti pada contoh sebelumnya
menggunakan pena atau asam amino-asam amino. Anda dapat
berakhir dengan kekacauan pada bercak-bercak yang tanpa arti.

34
Meskipun demikian, anda dapat bekerja dengan nilai Rf untuk setiap
bercak-bercak dalam pelarut-pelarut, dan kemudian membandingkan
nilai-nilai yang anda telah ukur dari senyawa yang telah diketahui
pada kondisi yang tepat sama.

f. Jenis Kertas

Untuk mendapatkan hasil campuran pelarut yang tak dapat

diulang lagi maka harus dibuat hati-hati meskipun hanya dengan
gelas ukur. Pelarut jangan dipakai setelah selang beberapa lama.
Untuk pengembangan selama satu malam pelarut hanya digunakan
satu kali pakai. Untuk penggunaan pelarut-pelarut yang mudah
menguap maka pemakaiannya dalam keadaan yang baru saja dibuat.

Pekerjaan mula-mula dalam kromatografi kertas dilakukan

dengan menggunakan kertas saring Whatmann No, 1. Jenis kertas
whatman dengan berbagai nomer banyak digunakan dengan
kemurnian yang tinggi dan tebal merata. Kertas dalam pemisahan
terutama mempunyai pengaruh pada kecepatan aliran pelarut.
Sedangkan fungsi dari kertas sendiri sangat kompleks. Efek-efek
serapan disebabkan oleh sifat polar dari gugus-gugus hidroksil.
Kecepatan aliran naik dengan penurunan kekentalan dari pelarut
(dengan kenaikan dalam suhu), tetapi aliran pelarut pada suhu yang
tertentu ditentukan oleh kerapatan dan tebal dari kertas. Penurunan
kerapatan atau kenaikan tebal memberikan kecepatan aliran yang
lebih tinggi. Kertas disediakan dalam bermacam-macam standar
lembaran, bulatan, gulungan dan dalam bentuk tertentu. kertas harus
disimpan ditempat jauh dari setiap sumber dari uap (terutama
ammunia yang mempunyai afinitas yang tinggi terhadap selulosa).

g. Jenis Pelarut

35
 Fasa gerak merupakan campuran yang terdiri dari stu
komponen organik utama, air, dan berbagai tambahan misalnya
asam-asam, basa atau pereaksi komplek. Pelarut harus sangat mudah
menguap, karena terlampau cepat mengadakan kesetimbangan,
keadaan lain volatilitas yang tinggi mengakibatkan lebih cepat
hilang meninggalkan lembaran kertas setelah bergerak. Ion-ion
anorganik dipisahkan sebagai ion-ion komplek dengan beberapa
kelarutan dalam pelarut-pelarut organik, misal besi membentuk ion
klorida kompleks yang larut dalam aseton berair, sedang nikel tidak
segera membentuk ion seperti besi sehingga besi dan nikel dapat
dipisahkan dengan pelarut ini, sejauh asam klorida berada untuk
menstabilkan ion kompleks. Beberapa contoh dari macam-macam
campuran pelarut dapat dilihat pada tabel di baha ini

Pemisahan Pelarut Perbandingan

Asam- asam atnino fenol/ air larutan jenuh
n-butanol/as.cuka/ air 4: 1:5
n-butanol/as.cuka/ air 12:3: 5
n-bu OH/piridin/air 1: 1:1
Karbihidrat (gula) etil asetat/piridin/air 2: 1:2
etil asetat/n- PrOH/air 6: 1:3
Etil asetat/ as. cuka/air 3: 1:3
Asam- asam lemak n-butanol/1, 5 M NH3 Larutan jenuh
Fe, CI, Hr, J
(garam-garam Na)
piridin/air 90: 10
Hg, Pb, Cd, Cu. Bi
(klorida-klorida)
n-butanol/3M HCl larutan jenuh

h. Cara Penempatan Cuplikan pada Kertas

Larutan carnpuran yang akan dipisahkan ditempatkan pada
kertas yang berupa noda. la biasanya dibiarkan untuk berkembang
membentuk suatu bulatan. Bagian dari kertas yang ditetesi

36
dibiarkan dalam keadaan mendatar, sehingga larutan tetap dalam
keadaan kompak dalam bentuk bulatan.

Kertas jangan sampai tersentuh oleh zat-zat yang tak

dikehendaki. Besarnya noda tergantung pada percobaan, tetapi
diameter harus tak lebih dari kira-kira 0,5 cm. Diameter ini
dihubungkan dengan tebal dan karakteristik serapan dari kertas,
tetapi biasanya noda yang lebih kecil akan menghasilkan
pemisahan yang lebih baik.

Dalam penempatan cuplikan dalam kertas yang penting

bukan jumlah volume, tetapi banyaknya campuran yang tertinggal
bila pelarut telah teruapkan. Jika larutan terlalu encer untuk
ditempatkan sekali, maka [arutan dapat "dipekatkan" di atas
kertas dengan cara meneteskan berkali- kali pada tempat yang
sama, dengan jarak waktu setelah tetes yang per- tama kering baru
tetes yang kedua dan seterusnya. Noda sebaiknya dibiarkan kering
dalam udara, tetapi bila mungkin dapat dikeringkan dengan
menggunakan kipas angin. Dalam pengeringan jangan
menggunakan udara panas, terutama jika larutan bersifat asam,
karena ia dapat menyebabkan kertas menjadi hitam.

Harus dicegah penempatan larutan terlalu banyak. Karena

kelebihan setiap komponen akan menyebabkan tidak akan
tercapainya kesetimbangan partisi selama ia bergerak, hingga ia
akan mengakibatkan terjadinya kedudukan/lokasi yang kabur. Ada
beberapa cara pembuatan noda. Salah satu caranya adalah dengan
menggunakan gelas kapiler dengan diameter yang sama, di mana
cara ini yang sering digunakan.

37
 Kedudukan dari permukaan pelarut yang terdapat pada kertas
harus selalu diberi tanda segera setelah lembaran kertas diambil
dan kemudian dikeringkan, dengan cara digantungkan. Penandaan
dapat menggunakan pensil pada sisi samping kertas. Pengeringan
sebaiknya dibiarkan dalam udara, bila dikehendaki dapat
menggunakan kipas angin, jangan mengeringkan dengan
menggunakan udara panas, karena dapat merusak beberapa
konstituen dari campuran. Aliran udara harus paralel terhadap
permukaan dari kertas.

Kebanyakan dari pelarut-pelarut kromatografi cepat menguap

tanpa meninggalkan residu. Hanya untuk fenol, di mana untuk
menguapkan sempurna membutuhkan waktu kira-kira empat jam.
Harus diusahakan penghilangan pelarut secara sempurna, hal ini
untuk mencegah pengaruh pada penambahan pereaksi. Yang
penting lagi terutama dalam kromatografi dua jalan di mana jejak
pelarut yang pertama harus hilang sebelum penjalanan yang kedua.
Untuk alasan ini adalah paling baik menggunakan pertama-tama
pelarut yang lebih mudah menguap (jadi, n- butanol/asam
cuka/air). Untuk mendapatkan hasil yang dapat diulang kembali
maka urutan pekerjaan harus dilakukan sama.

i. Deteksi Daerah-daerah Noda

Keberhasilan dari pemisahan kromatografi tergantung juga

pada proses deteksi. Senyawa-senyawa yang berwarna tentu saja
terlihat sebagai noda- noda berwarna yang terpisah pada akhir
pengembangan. Un[uk senyawa- senyawa tak berwarna memerlukan
38
deteksi secara kimia clan fisika. Sering menjadi pekerjaan rutin
bahwa kromatogram-kromatogram diuji di bawah sinar ultra violet
sebelum dan sesudah setiap metoda dikerjakan.

Panjang gelombang yang digunakan biasanya 370

millimikron dan 254 millimikron. Beberapa senyawa terlihat sebagai
bintik fluoresence. Metoda fisika lainnya, terutama hanya dapat
dipakai terhadap senyawa-senyawa radioaktif, yaitu berdasarkan
autoradiografi dan pencacahan. Metode- metode kimia adalah
merupakan deteksi yang paling penting. Pereaksi- pereaksi yang
digunakan biasanya dinyatakan sebagai "pereaksi-pereaksi lokasi".
Pereaksi lokasi menggunakan pelarut yang baik, yang diikuti
dengan penguapan. Pelarut yang ideal adalah semua senyawa-
senyawa yang terpisah tidak larut tetapi hal ini tidak mungkin. Cara
menggunakan untuk mendeteksi noda yaitu dengan jalan
penyemprotan.

Penyemprotan dilakukan perlahan-lahan dari samping ke

samping dan dari atas ke bawah. Pelarut yang digunakan untuk
penyemprotan harus tidak menguap. Tetapi di lain fihak, penguapan
yang cepat dari kertas diperlukan untuk mencegah difusi dari noda-
noda yang terpisah. Pelarut-pelarut yang digunakan adalah etanol,
propanol, n-butanol atau kloroform atau campuran daripadanya.
Campuran berair dapat digunakan, tetapi terlalu banyak air harus
dicegah jika mungkin, karena dapat memberikan efek melemahkan
kertas. Penyemprotan kertas harus dilakukan dalam lemari asam.
Selesai penyemprotan alat harus dibersihkan untuk mencegah
lobang penyemprot menjadi buntu.

Pereaksi yang digunakan untuk mendeteksi asam-asam

39
amino biasanya ninhidrin (indanatrion hidrat). Pada suhu kamar
pereaksi baru mernberikan warna pada asam-asam amino kira-kira

setelah dua puluh empat jam. Tetapi pada pernanasan pada 100°C
warna akan timbul setelah kira-kira empat menit.

Di dalam teknik pencelupan, larutan pereaksi dimasukkan

dalam tempat bejana yang dangkal, dan lembaran atau potongan
kertas dicelupkan di dalamnya. Ada beberapa keuntungan dalam
pencelupan hanya membutuhkan bejana yang murah. Pelarut yang
lebih mudah menguap dapat digunakan, hingga dapat mengurangi
waktu yang dibutuhkan untuk pengeringan hingga mengurangi
bahaya difusi dari noda-noda selama pengeringan. Aseton dapat
digunakan sebagai pelarut. Tetapi yang sering terjadi adalah bahwa
senyawa-senyawa yang terpisah sangat larut dalam pelarut yang
terbaik untuk pereaksi lokasi. Hingga metoda pencelupan sering
menyebabkan hilangnya materi maka dalam hal ini metoda penyem-
protan sangat penting

j. Identifikasi dari Senyawa-senyawa

Mengidentifikasi noda-noda dalam kertas menggunakan

harga Rf (retordation factor) yang didefinisikan sebagai :

Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu :

1) Pelarut disebabkan pentingnya koefisien partisi, rnaka
perubahan- perubahan yang sangat kecil dalam komposisi
pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.
2) Suhu.Perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga
40
 kecepatan aliran.
3) Ukuran dari bejana. Volume dari bejana mempenyaruhi
homogenitas dari atmosfer jadi mernpengaruhi kecepatan
penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika
bejana besar digunakan, ada tendensi perambat lebih lama,
seperti perubahan-perubahan komposisi pelarut sepanjang
kertas, maka koefisien partisi akan berttbah juga. Dua
faktor yaitu penguapan clan kornposisi mempe-ngaruhi
harga Rf.
4) Kertas. Pengaruh utama kertas pada harga-harga Rf timbul
dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk
macam-macam kertas. Kertas-kertas mempengaruhi
kecepatan aliran dan akan mempengaruhi pada
kesetimbangan partisi.
5) Sifat dari rantpuran. Berbagai senyawa mengalami partisi
di an- tara volume-volume yang sama dari fasa tetap dan
bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi
karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga
terhadap harga-harga Rf.

Untuk mengukur Rf perlu melokalisir permukaan pelarut.

Harga-harga Rf biasanya dinyatakan sebagai fraksi/bagian.
Perbedaan dalam harga-harga Rf untuk dua senyawa yang
dipisahkan tergantung pada besarnya noda-noda dan
panjangnya aliran terlarut. Cara yang paling mudah dalam
pengukuran Rf adalah dengan menggunakan mistar. Ujung nol
ditempatkan pada titik mula-mula dan ujung yang lain
direntangkan ke arah permukaan pelarut dan harga Rf langsung
dapat dibaca pada titik di mana angka mistar tepat pada noda.
Dalam penentuan Rf perlu mengukur dari pusat pita atau noda.

Biasanya identifikasi dari senyawa yang tak diketahui

41
 dilakukan pemisahan berulang. Daerah yang mengandung
senyawa yang tak diketahui dipotong dan senyawa dielusi
dengan pelarut yang sesuai. Bila hanya diperoleh satu noda
dengan menggunakan lebih dari satu pelarut dengan menunjuk
senyawa yang sama maka dapat diambil kesimpulan bahwa
kemungkinan keduanya adalah identik

Cara lain untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa yaitu

dengan reaksi-reaksi warna yang karakteristik. Reaksi kebanyakan
sangat berguna dalam pemisahan senyawa-senyawa anorganik, tetapi
untuk senyawa organik sangat kecil kejadiannya, karena kebanyakan
konstituen-konstituen dari campuran mempunyai sifat-sifat kimia
yang mirip.

2. Kromatografi Lapis Tipis

Sampel dipersiapkan sama seperti preparasi sampel untuk
kromatografi kertas, yaitu sampel padat dilarutkan dengan pelarut
organik atau diekstraksi.

Perlu membuat plat kromatografi, yaitu untuk

membentangkan penyerap dalam palisan tipis yang berguna sebagai
penyokong yang inert. Penyerap padat berbentuk bubuk halus
dibuat menjadi bubur (slury) dengan air (kurang umum dengan zat
cair organik yang mudah menguap) dan dibentangkan di atas plat
gelas. Pembuatan lapisan tipis di atas kaca ada beberapa cara yaitu
dengan jalan menyemprotkan atau pencelupan, di samping dikerjakan
dengan tangan dapat juga dengan mesin. Plat yang telah dilapisi
dipanaskan atau di-"aktif'"-kan dengan jalan memanaskan pada suhu

kira-kira 100 ° C selama beberapa waktu lamanya. Larutan cuplikan

dalam pelarut yang mudah menguap diletakkan di atas lapisan dengan

42
menggunakan pipet atau alat penyuntik.

Waktu rata-rata untuk kromatografi lapisan tipis dengan

panjang 10 cm pada silika gel adalah sekitar 20 - 30 menit
(tergantung dari sifat fasa bergerak), sedangkan pemisahan yang
sama dengan memerlukan waktu dua jam. Untuk pemisahan-
pemisahan secara kualitatif pada plat yang kecil memerlukan waktu
sekitar 5 menit.

Hasil pemisahan yang baik ternyata bahwa penyerap dalam

kromatografi lapisan tipis mempunyai kapasitas yang lebih besar
bila dibandingkan dengan kertas. Keuntungan dari sistem serapan
ialah dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya
hidrofobi, seperti lipida-lipida dan hidrokarbon. Pemisahan dengan lapisan
tipis banyak digunakan dalam kimia organik dan beberapa dalam kimia
anorganik.

a. Pembuatan Lapis Tipis

Penyerap dibentangkan di atas permukaan plat kaca.

Untuk pemisahan secara kualitatif yang cepat sering digunakan
gelas mikroskop (microscope slide). Kebanyakan alat-alat
digunakan dalam bentuk plat kaca dengan ukuran 20 x 5 cm
atau 20 x 20 cm, dua ukuran ini dianggap sebagai "standard"
dan permukaan dari plat harus rata.

Flat-plat kaca sebelum dipakai dicuci dulu menggunakan

detergent kemudian dikeringkan. Pencucian terakhir dapat
memakai aseton (jika perlu). Suatu hal yang perlu diperhatikan
jangan menyentuh permukaan dari plat yang bersih dengan jari-jari.

43
 Pada dasarnya ada empat cara yang digunakan dalam
pembuatan lapisan tipis, yaitu pembentangan, penuangan,

penyemprotan dan pencelupan. Metoda-pembentangan dan

penyernprotan dapat dikerjakan dengan tangan atau dengan alat.
Banyak pemakai yang tak menggunakan metoda penuangan secara
mekanik. Jika penyerap sangat halus dan partikel-partikelnya
homogen, dan jika tak menggunakan pengikat, maka bubur dapat
dituangkan di atas plat dan dibiarkan hingga melapisinya.
Pembuatan dengan penuangan biasanya mudah dengan
menggunakan jenis alumina, dan pembuatan buburnya tidak
menggunakan air, melainkan menggunakan cairan yang mudah
menguap seperti etanol (atau campuran etanol-air) atau etil asetat.

b. Pencelupan

Plat-plat yang kecil, seperti gelas mikroskop, dapat dilapisi

dengan pencelupan dalam bubur dari penyerap dalam kloroform
atau zat cair mudah menguap yang lain. Sekali lagi lebal lapisan
yang pasti tidak diketahui dan kemungkinan lapisan tak dapat
dibuat dengan baik, meskipun demikian metoda ini cukup
memuaskan untuk membuat sejumlah dari plat-plat untuk
pemisahan secara kualitatif dengan cepat. Setelah pembentangan
plat dibiarkan kering selama kira-kira 5 -10 menit, ini bila dibuat
dengan bubur yang berair, selanjutnya dipanaskan dan di"aktif"kan

dengan pemanasan pada suhu kira-kira 100°C selama 30 menit.

Plat-plat yang dibuat dengan zat-zat cair organik yang mudah
menguap tak perlu pemanasan lebih lanjut. Penyentuhan dengan
jari-jari akan merusak lapisan dan melepaskan partikel-partikel
dari permukaan.

c. Fasa Bergerak dan Penempatan Cuplikan

44
 Pemilihan fasa bergerak tergantung pada faktor-faktor
seperti dalarn pemisahan dalam kromatografi kolom serapan.
Sebaiknya menggunakan campuran pelarut organik yang
mempunyai polaritas serendah mungkin, karena dapat mengurangi
serapan dari setiap komponen dari campuran pelarut. Jika
komponen-kornponen yang mempunyai sifat polar tinggi (terutama
air) dalam campuran akan merubah sistem menjadi sistem partisi.
Campuran yang baik memberikan fasa-fasa bergerak yang
mernpunyai kekuatan bergerak sedang, tetapi sebaiknya tidak
mencampur lebih dari dua komponen, karena campuran yang lebih
kompleks cepat mengalami perubahan-perubahan fasa terhadap
perubahan suhu. Kemurnian dari pelarut adalah lebih penting
dalarn lapisan tipis daripada bentuk-bentuk kromatografi lain,
karena digunakan sejumlah materi yang sedikit.

Cara menempatkan cuplikan pada lapisan tipis seperti cara-

cara yang digunakan pada kromatografi kertas, yaitu dengan pipa
kapiler atau mikro pipet. Pada penempatan cuplikan ujung penetes
dapat mengenai permukaan lapisan, meskipun demikian harus
diusahakan sedekat mungkin. Pelarut cuplikan merupakan pelarut
yang mudah menguap dan mempunyai polaritas yang rendah.

Kedudukan noda tak dapat diberi tanda dengan pensil,

seperti dikerjakan pada kertas, penunjuk noda dapat digunakan
misal dengan penggaris yang diletakkan di samping plat kaca.
Penempatan noda di atas plat kira-kira 1 cm dari salah satu
ujungnya di mana ujung ini nanti dicelupkan dalam pelarut. Untuk
plat kaca yang mempunyai ukuran 20 x 20 cm, penempatan noda-
noda kira-kira 1,5 cm dari ujung bawah dan dimulai clan diakhiri
kira-kira 0,5 cm dari samping kaca dan noda-noda diteteskan

45
masing-masing pada jarak kira-kira 1 cm dari masing-masing pusat
noda. Untuk pekerjaan pemisahan yang besar penempatan noda
dapat diteteskan hingga membentuk garis, lihat gambar 6

Garis awal diberi tanda pada ujung dari plat dengan pensil
dan garis akhir dapat dibuat di bagian atas dengan menggoreskan
pensil, yang menyebabkan goresan dari aliran pelarut akan ditahan
bila permukaan pelarut sampai pada garis. Jangan terlalu lama
mencelupkan plat dalam bejana bila permukaan pelarut telah
mencapai garis akhir, karena oleh pengaruh difusi dan penguapan
dapat menyebabkan pemancaran dari noda-noda yang terpisah.
Ujung plat yang dicelupkan dalam fasa bergerak jangan dibiarkan
hingga rusak. Bila akan dilakukan pemisahan dua jalan, maka
lapisan dari dua sisi yang berdekatan tidak perlu dihilangkan.

d. Pengembangan Kromatografi dan Lokasi

Bila plat kromatografi telah disiapkan dan cuplikan telah

ditempatkan di atasnya, kemudian dimasukkan dalarn bejana yang
cocok dengan ujung yang paling bawah, di mana cuplikan

46
ditempatkan, dicelupkan dalam fasa bergerak yang telah dipilih
sedalam kira-kira 0,5 - 1,0 cm. Biasanya dua plat dapat
dimasukkan dalam bejana, dalam hal ini akan diperoleh
kromatografi penaikkan. Bejana diusahakan jangan sampai bocor

Sering tidak rnemerlukan waktu kesetimbangan, tetapi

untuk meyakinkan homogenitas dari atmosfer dalam bejana, maka
dinding dalam bejana dapat dilapisi dengan lembaran kertas
saring yang ujungnya direndam dalam fasa bergerak. Sedapat
mungkin menggunakan bejana yang kecil sehingga atmosfer di
dalam bejana mempunyai volume sekecil mungkin. Untuk plat
kaca yang kecil, microscope slide, sebagai bejana dapat dipakai
gelas piala yang mempunyai kapasitas sekitar 500 ml, juga dinding
sebelah dalamnya dapat dilapisi dengan kertas saring yang
ujungnya dicelupkan dalam fasa bergerak.

Permukaan pelarut yang terdapat di dalam jangan sampai

berhubungan dengan atmosfer luar, karena dapat mengakibatkan
komponen-komponen yang mudah menguap. Kalau dikehendaki
perkembangan dengan jenis penurunan atau mendatar, maka alat
yang digunakan menjadi agak sukar. Misal menghendaki
perkembangan jenis penurunan, maka tempat fasa bergerak
ditempatkan di bagian atas dari bejana. Dan untuk mengalirkan
pelarut ke tempat plat diperlukan perantara yang dapat berupa
kapas atau gulungan kertas lihat gambar

47
 Setelah pengembangan, plat diambil dari bejana dan
dibiarkan kering tanpa pemanasan. Bila diperlukan, aliran udara
dapat digunakan dan diarahkan pada permukaan yang mendatar.
Seperti dalam kromatografi kertas, dalam pemisahan dua jalan,
maka pelarut yang pertama harus hilang sebelum
pemisahan/pengembangan berikutnya.

Pada umumnya metoda lokasi dari senyawa tak berwarna

pada lapisan tipis adalah mirip seperti dikerjakan dalam
kromatografi kertas. Metoda- metoda fisika yang sering digunakan
meliputi fluoresensi sinar ultra ungu dan pencacahan radioaktif.
Jika pereaksi kimia digunakan untuk lokasi, maka dapat dilakukan
dengan penyemprotan dan tidak dengan pencelupan seperti
diutarakan pada kromatografi kertas. Senyawa-senyawa organik
dapat dilokasi dengan penyemprotan menggunakan asam sulfat

pekat kemudian dipanaskan pada suhu sekitar 200°C selama lebih

kurang sepuluh menit. Noda dari senyawa akan menjadi hitam. Ini
merupakan cara lokasi yang efektif, tetapi sedikit meinberikan
pertolongan dalam identifikasi. Pereaksi lokasi yang lain untuk
senyawa organik adalah Iod. Plat kaca yang mengandung noda-
noda dibiarkan terkena uap Yod, yaitu dengan jalan meletakkan
plat dalam bejana atau gelas piala yang tertutup yang berisi kristal
Iod untuk beberapa saat lamanya. Warna dari bejana akan menjadi
ungu, untuk senyawa-senyawa tak jenuh akan memberikan noda-
noda yang tak berwarna, tetapi banyak senyawa organik yang
jenuh akan menimbulkan noda-noda yang berwarna coklat. Semua
warna ini akan cepat hilang dibiarkan diatmosfer.

48
e. Identifikasi Harga Rr

Identifikasi dari snyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan

tipis lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi-
reaksi warna.

Untuk identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-

harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada
kertas. Seperti halnya pada kertas harga Rf didefinisikan sebagai
berikut:

Senyawa standard biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang

mirip dengan senyawa yang dipisahkan pada kromatogram. Misal
perbandingan suatu hidrolisa protein dengan glisin atau alanin.

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam

kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rf
adalah :

1) Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

2) Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.(Biasanya aktifitas
dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan
mengeringkan molekul- molekul air yang menempati pusat-
pusat serapan dari penyerap). Perbedaan penyerap akan
memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf
meskipun menggunakan fasa bergerak dan solute yang sama
tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama, jika
menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap

49
 dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.
3) Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap, dalam prakteknya
tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu
diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan
menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam
daerah yang kecil dari plat.
4) Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa bergerak. Kemurnian
dari pelarut yang digunakan sebagai fasa bergerak dalam
kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila
campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang
dipakai harus betul-betul diperhatikan.
5) Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang
digunakan.
6) Teknik percobaan. Arah pelarut bergerak di atas plat.
(Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena
cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran
penurunan dan mendatar juga digunakan).
7) Jumlah cuplikan yang digunakan. Penetesan cuplikan dalam
jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-
noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak
kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan
kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
8) S u h u. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada
suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-
perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh
penguapan atau perubahan- perubahan fasa.
9) Kesetimbangan. Ternyata bahwa kesetimbangan dalam
lapisan tipis lebih penting dalarn kromatografi kertas, hingga
perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan
uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak
jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran,
akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang

50
 berbentuk cekung dan fasa bergerak lebih cepat pada bagian
tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.

3. Kromatografi Kolom
Sampel dipersiapkan sama dengan preparasi sampel untuk
kromatografi kertas, yaitu bila sampel padat diekstaksi terlebih dahulu.
Penyiapan pelarut atau pemilihan dari pelarut tergantung dari sifat
kelarutannya. Tetapi lebih baik untuk memilih suatu pelarut yang tak
tergantung pada kekuatan elusi, sehingga zat-zat elusi yang lebih kuat
dapat dicoba. "Kekuatan" dari zat elusi adalah daya penyerapan pada
penyerap dalam kolom. Biasanya untuk penyerap-penyerap yang polar
seperti alumina dan silika gel, maka kekuatan penyerapan naik dengan
kenaikan polaritas dari zat yang diserap.

Menurut TRAPPE, kekuatan elusi dari deret-deret pelarut untuk

senyawwa-senyawa dengan menggunakan silika gel akan diturunkan
dalam urutan sebagai berikut
air murni < metanol < etsnol < propanol < aseton < etil-asetat < dietileter
< kloroform < rnetilena klorida < benzena < toluena < trikloroetilena <
karbon tetraklorida < sikloheksana < heksana.

Kekuatan dari pelarut-pelarut yang berbeda menurut WILLIAMS,

pada karbon aktif dalam kolom untuk asam-asam amino dan sakarid
diturunkan dalam urutan :
etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol < air murni.

Urutan ini adalah dari kenaikan polaritas atau penurunan panjang

rantai dari homolog. Sedangkan untuk alumina dan silika gel urutannya
adalah sebaliknya. Kemurnian dari pelarut-pelarut harus setinggi mungkin

a. Persiapan Penyerap dan Sifat Absorban-Pelarut

51
 Penyerap yang sering digunakan adalah alumina. Suatu pengertian
yang digunakan dalam hubungannya dengan penyerap-penyerap adalah
"aktifasi". Kadang-kadang dihubungkan dengan luas permukaan spesifik
dari zat padat, yaitu luas permukaan yang diukur dalam meter persegi
tiap gram, dalam hal karbon, silika gel dan alumina dapat dibuat menjadi
aktif dengan memiliki permukaan spesifik beratus-ratus meter persegi.
Sedangkan seperti kalsium, karbonat dan kalsium hidroksida, mempunyai
permukaan spesifik yang mempunyai ukuran dalam puluhan meter
persegi atau kurang sampai dikategorikan relatif tak aktif.

Zat padat Digunakan untuk memisahkan

Alumina/magnesia  Sterol-sterol, zat warna, vitamin-vitamin, ester-ester,
Silika gel alkaloid-alkaloid, senyawa-senyawa anorganik.
Karbon  sterol-sterol, asam-asam amino.

 Peptida-peptida, karbohidrat-karbohidrat, asam-asam

Magnesium silikat
amino

Magnesium
 Sterol-sterol, ester-ester, gliserida-gliserida, alkaloida-
karbonat
alkaloida
 Porphirin,Karotenoida-karotenoida

Karotenoida-karotenoida, xantofil
Banyak zat-zat padat yang telah digunakan sebagai penyerap,
diantaranya adalah sebagai berikut :

52
 Banyak penyerap seperti alumina, silika gel, karbon aktif dan
magnesium silikat dapat diperoleh diperdagangan. Penyerap tersebut
sering memerlukan aktivasi sebelum dipakai, hal ini dapat dilakukan
dengan pemanasan dan mungkin dengan pengurangan tekanan. Suhu

optimum untuk aktivasi aluminium biasanya sekitar 400°C dan waktu

pemanasan cukup selama 4 jam. Untuk kebanyakan zat-zat padat,

pemanasan pada suhu 200°C selama 2 jam.

Zat-zat aktif yang digunakan sebagai penyerap dalam kromatografi

kolom sering merupakan katalisator yang baik; ini rnerupakan bahaya
yang perlu mendapat perhatian. Alumina sering menimbulkan perubahan-
perubahan kimia dan menimbulkan reaksi-reaksi misal dapat
menyebabkan kondensasi dari aldehida-aldehida dan keton- keton,
sehingga bila hal ini terjadi, maka harus menggunakan alumina yang
bersifat netral. Silika gel dapat menyebabkan isomerisasi dari berbagai
senyawa-senyawa seperti terpen dan sterol.

Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di
sembarang tempat suddah tentu sedapat mungkin harus sama.
Keseragaman ini dapat dicapai dengan memilih adsorben yang ukuran
butir – butirnya sama ( diayak ) dan dengan cara penyaratan yang baik.
Makin kecil ukuran butir adsorben, makin cepat keseimbangan adsorpsi
akan tercapai, dan makin besar pula kecepatan elusi yang boleh
dipergunakan. Tetapi dilain pihak, makin kecil butir adsorben, makin
besar hambatan bagi cairan yang harus mengalir melalui kolom. Apabila
kecepatan lintas bagi cairan elutor terlalu kecil, dapat dipergunakan
pompa vakum yang menimbulkan tekanan rendah dalam ruang di bawah
kolom sehingga cairan dapat mengalir lebih cepat melalui kolom. Cara
yang lain ialah menambahkan tekanan dalam ruang di atas kolom dengan
menggunakan pompa pneumatic.
53
 Harus memiliki luas permukaan besar internal. Kecepatan adsorbsi
akan semakin bertambah dengan semakin kecilnya ukuran diameter
adsorben. Daerah tersebut harus dapat diakses melalui pori-pori cukup
besar untuk mengakui molekul untuk teradsorpsi. Ini adalah bonus jika
pori-pori juga cukup kecil untuk mengecualikan molekulyang tidak
diinginkan untuk menyerap adsorben harus mampu menjadi mudah
diregenerasi adsorben seharusnya tidak mengalami penuaan yang cepat,
yang kehilangan kapasitas serap melalui daur ulang terus-menerus harus
adbsorbent mekanik cukup kuat untuk menahan penanganan massal dan
getaran yang merupakan fitur dari setiap unit industri.Pemilihan pelarut
tergantung dari sifat kelarutannya, akan tetapi lebih baik untuk memilih
suatu pelarut yang tidak tergantung pada kekuatan elusi sehingga zat-zat
elusi yang lebih kuat dapat dicoba. “kekuatan” dari zat elusi adalah daya
penyerapan pada penyerap dalam kolom.

Adsorbsi terjadi karena adanya perbedaan potensial antara

molekul-molekul adsorbat dengan permukaan aktif pada pori-pori
adsorbent. Gaya tersebut yang menyebabkan molekul-molekul adsorbate
secara difusional terjerap ke dalam pori-pori adsorbent, dan terikat untuk
waktu tertentu. Faktor-faktor yang mempengaruhi adsorpsi adalah jenis
adsorbent, jenis adsorbate, konsentrasi adsorbate, luas permukaan aktif
adsorbent, daya larut adsorbent, dan kemungkinan terjadinya koadsorbsi
pabila terdapat lebih dari satu jenis adsorbat (Sawitri, 2008).

Ditambahkan lebih lanjut oleh Hassler; Weber; Sawyer dalam

Zahroh. (2010), proses adsorpsi dipengaruhi oleh beberapa faktor antara
lain:

b. Bentuk, Kecepatan Arus dan Perolehan Data

54
 Penempatan adsorben dalam kolom secara uniform betul sangat
sukar dilaksanakan. Sebagai akibatnya, zona – zona komponen yang
dipisahkan menjadi kurang teratur bentuknya. Bagi kolom yang lebar hal
ini dapat menyebabkan pembauran. Tetapi bagi kolom kecil bahaya ini
seberapa besar. Namun di lain pihak, kolom yang lebar dan pendek itu
lebih memudahkan dalam pemakaiannya. Oleh karena itu, tinggi
kebanyakan kolom ialah ± 20 kali diameternya. Di bawah tabung yang
umumnya terbuat dari gelas terdapat lempengan meduk yang terbuat dari
porselen atau dari serbuk gelas yang dipanaskan hingga melengket jadi
satu. Lempengan yang berbentuk cakram ini bergawai sebagai penahan
fasa yang stasioner. Di bagian tabung yang paling bawah terdapat kapiler
penyulur dilengkapi dengan pancur. Kapiler beserta pancur dirakitkan
dengan kolom memakai suku asah sehingga mudah dilepaskan guna
membersihkan kolom dan untuk meniup kolom sehingga menjadi bersih
dari cairan. Ruang antara pancur dan cakram penyaring harus sekecil
mungkin supaya tidak terjadi pembauran antara cairan – cairan yang
keluar dari kolom.

Semakin rendah kecepatan arus cairan, semakin baik akibatnya

bagi tercapainya keseimbangan adsorpsi dan akan semakin baik pula
pemisahannya. Bentuk zona pun menjadi lebih teratur. Tetapi kecepatan
arus yang terlalu rendah dapat menimbulkan efek difusi axial dalam fasa
mobil yang harus dihindarkan sejauh mungkin. Jadi dapat dikatakan
bahwa pemisahan yang terbaik dapat dicapai dengan mempergunakan
kolom yang panjang dan sempit, diisi dengan adsorben yang berbutir
halus, dan arus yang lambat. Elusi dapat dimulai apabila campuran yang
harus dipisahkan sudah dimasukan dalam kolom. Elusi ini dilakukan
dengan memasukan cairan elutor berenyai – renyai melalui kolom dan
harus dijaga supaya arusnya tidak berhenti. Komponen – komponen yang
telah diadsorpsikan oleh adsorben akan bergerak dalam bentuk gelang –
gelang atau zona dengan kecepatan yang berbeda – beda melalui kolom

55
 dan ditampung di bawah kolom secara terpisah memakai beberapa
tabung yang dibubuhi tanda – tanda. Tabung – tabung ini ditempatkan
dalam sebuah fraksikolektor. Setelah itu fraksi – fraksi yang diperoleh
mulai dapat diselidiki.

Suatu integrator, jika berdasarkan mikroprosesor atau perakat lunak

pc, hanya mengukur jumlah total arus yang mengalir melewati lebar
puncak suatu kromatografi. Untuk melakukan hal ini , integrator
mengukur laju peningkatan tegangan lebih kurang 30 kali melintasi lebar
puncak tersebut. Parameter yang menunjukan waktu pengukuran harus
di mulai adalah ambang batas puncak tersebut, yang menentukan tingkat
ketika tegangan sinyal tersebut harus di naikkan sebelum akumulasi
sinyal terjadi. Untuk mencegah penyimpanan aliran garis dasar,
kemiringan kenaikan harus memiliki ketajaman tertentu sebelum di
anggap suatu puncak.

c. Perhitungan Efiisiensi Kolom

Persamaan 1

Dengan n adalah jumlah pelat teoretis. Efesiensi kolom biasanya

dinyatakan dalam pelat teoretis per meter:

n x 100/L

Pengukuran efesiensi kolom yang lebih ketat, terutama jika waktu

retensi analit tersebut singkat, di nyatakan dengan persamaan 2.

Persamaan 2

Dengan N eff adalah jumlah pelat yang efektif dan mencerminkan

berapa kali analit berpartisi antara fase gerak dan fase diam selama
pergerakannya melalui kolom dan t’r =tr – t0.

N eff = 5, 54 (t’r : W1/2)²

56
 Persamaan lain yang di gunakan sebagai pengukuran adalah H,
“tinggi pelat teoretis”.

H=L/N eff

Dengan h adalah panjang kolom yang di butuhkan untuk

berlangsungnya satu tahap partisi. (Watson, 2005)

d. Pemisahan Pada Kolom

Pada pemisahan campuran-campuran pada kolom, solut di cirikan

dengan waktu retensi (tR) dan faktor retensi (k’) yang berbanding lurus
dengan D. Waktu retensi merupakan lamanya waktu yang di butuhkan
solut untuk melewati kolom. Waktu retensi dan faktor retensi di
hubungkan oleh persamaan berikut:

tR=tM(1+k’)

tM terkadang di tulis t0 dan di kenal sebagai waktu mati

merupakan waktu yang di butuhkan oleh solut yang tidak tertahan
untuk melewati kolom. Solut yang tidak tertahan akan bermigrasi
dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak, karenanya
perbandingan distribusi (D) dan faktor retensinya adalah 0 akan
tertahan secara profosional dan akan mempunyai waktu retensi yang
lebih besar dari pada tM, misal:

jika k’ = 1 maka tR= 2tM

jika k’ = 2 maka tR = 3tM

Kondisi kromatografi umumnya di atur sedemikian rupa

sehingga nilai k’ lebih kecil dari pada 20 untuk menghindari waktu
retensi yang terlalu panjang. Nilai k’ dapat di hitung dengan menyusun
ulang persamaan di atas

tR=tM (1=k’) maka k’ = (tR-tM) / tM

57
 Dalam kromatografi ukuran eksklusi, solut di karakterisasi
dengan volume retensi (Vr) yang merupakan volume fase gerak yang di
butuhkan untuk mengelusi solut dari kolom. Waktu retensi berbanding
langsung dengan volume retensi pada kecepatan alir yang konstan
sehingga persamaan di atas dapat di tulis kembali:

Vr=Vm (1+k’)

Sementara nilai k dapat di ganti dengan:

k’=D(Vs / Vm)

Dengan menggabungkan kedua persamaan ini maka akan di

peroleh:

Vr=Vm(1+D Vs / Vm)

Atau

Vr=Vm+DVs

Vs dan Vm masing-masing merupakann volume fase diam dan

volume vase gerak dalam kolom.

Persamaan tersebut merupakan persamaan pundamental pada

kromatografi kolom karena berhubungan dengan volume retensi solut
terhadap perbandingan distribusinya Semakin lebar suatu puncak
kromatografi yang sebanding dengan waktu retensinya, semakin kurang
efesien kolom pengelusinya.

e. Kolom Partisi

Didalam kromatografi partisi, penyerap zat padat diganti dengan

fasa tetap zat cair, yang biasanya hanya sebagian dapat bercampur
dengan zat cair yang mengalir sebagai fasa bergerak. Zat yang dilarutkan

58
 (solute) akan didistribusikan dengan sendirinya diantara dua fasa zat
cair (tetap dan bergerak) sesuai dengan koefisien partisinya. Disebabkan
perbedaan-perbedaan dalam koeffisien partisi dari berbagai komponen,
maka campuran akan terpisah dengan cara yang sama seperti pada
sistem-sistem penyerap

Fasa tetap harus disokong dalarn beberapa cara, yaitu fasa tetap zat
cair disokong pada zat padat yang bersifat inert terhadap senyawa-
senyawa yang akan dipisahkan. Zat padat yang menyokong ini
ditempatkan dalam kolom seperti pada kromatografi serapan. Kenyataan
sangat kecil sekali perbedaan antara dua macam jenis kromatografi ini.
Zat yang menyokong harus penyerap dan menahan fasa tetap dan harus
membuat luas permukaannya menjadi seluas mungkin untuk fasa yang
mengalir. la harus stabil, mudah diisikan dalam kolom bila menyerap fasa
tetap zat cair dan harus tidak merintangi aliran pelarut. Fasa bergerak
dalam kromatografi partisi dapat berupa zat cair atau gas. Hal hal yang
perlu diperhatikan dalam kolom partisi adalah

1) Zat-zat padat penyokong

Zat-zat penyokong yang digunakan kebanyakan ialah silika gel,

bubuk selulosa dan tanah diatome (kieselguhr, celit dan sebagainya)
zat padat lainnya seperti pati hanya digunakan secara terbatas. Silika
gel hampir selalu digunakan dengan air atau larutan berair sebagai
bufer sebagai fasa tetap. Jumlah zat cair yang digunakan kira-kira 0,6
ml untuk setiap gram silika gel.

2) Peralatan

Kolom dan alat-alat lain yang digunakan untuk kromatografi partisi

adalah sama seperti yang digunakan dalam kromatografi serapan.
Tabung-tabung yang digunakan di laboratorium panjangnya antara 25-
50 cm dengan diameter hingga 4 cm. Aliran pelarut yang melalui

59
 kolom partisi mempunyai tendensi agak lambat tetapi dapat
dipercepat dengan menggunakan tekanan udara di atas kolom seperti
halnya pada kolom serapan.

3) Cara memasukkan penyerap

Pengisian penyerap dalam kolom adalah sangat penting seperti

dalam kromatografi serapan. Pertama mencampur penyokong dengan
fasa tetap diaduk dengan sejumlah fasa bergerak yang digunakan.
Bubur ini kemudian dituangkan sedikit demi sedikit dalam
tabung yang mengandung sedikit zat cair yang sama. Setiap
pemasukan bubur ke dalam tabung disertai dengan penekanan
dengan batang gelas yang ujungnya datar sedikit lebih kecil daripada
diameter tabung. Kelebihan dari pelarut dapat dibiarkan hingga lepas
melalui kolom atau diambil dengan pipet. Berhasilnya pemisahan
tergantung pada kekompakan pengisian dan keteraturan pita-pita
kromatografi.

4) Pemasukan Cuplikan

Pemasukan cuplikan adalah menggunakan pipet seperti

dilakukan pada kolom serapan. Mula-mula melarutkan cuplikan
dalam sejumlah fasa bergerak dan mencampurkan dengan
sejumlah zat padat penyokong hingga diperoleh bubuk yang
kering. Bubuk ini kemudian diletakkan di atas kolom dan sedikit
fasa bergerak ditambahkan.

5) Elusi

Teknik elusi yang digunakan dalam kolom partisi adalah sama

seperti yang di gunakan dalam kolom serapan. Jika fasa tetap
adalah berair, maka fasa bergerak yang digunakan zat cair
organik atau campuran. Jika penyokong yang digunakan tak
60
suka air, maka fasa tetap berupa zat organik dan fasa bergerak
berair adalah menjadi mungkin. Ini dikenal sebagai kromatografi
“fasa berbalik” dan telah digunakan untuk memisahkan senyawa-
senyawa yang sangat larut dalam pelarut-pelarut organik. Bisa
dugunakan untuk indrsti, bebagai bidang sains dan keperluan publik
seperti untuk analisis asam-asam amino, protein, asam-asam nukleat,
hidrokarbon, karbohidrat, obat-obatan, terpenoid, pestisida, antibiotik,
steroid, spesi metal organik, dan berbagai senyawaan norganik.

61
 BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan

Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa ini

telah banyak digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya
seperti detilasi, kristalisasi, pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain
mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih sederhana,
penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan
yang tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi,
Metode ini digunakan, jika dengan metode lain tidak dapat di lakukan
misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit atau campurannya
kompleks.

Penggolongan Kromatografi

1. Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan

2. Berdasarkan fase yang digunakan

3. Berdasarkan alat yang digunakan

Cara membedakan fase gerak dan fase diam. Fase diam (Stationary
phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses
pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan
fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya
komponen suatu senyawa analit termasuk asam amino. Fase diam dapat
berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau
cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung

61
 Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam
amino), dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut.
Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat juga berupa gas inert yang
umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap
(volatil).

B. Saran

Penulis menyadari di dalam penyusunan dan pembuatan makalah

ini masih banyak kekurangan dan maka dari pada itu kritik dan saran
sangat kami harapkan untuk mencapai kesempurnaan makalah ini agar
lebih baik lagi.

62
 Daftar Pustaka

Arsyad, M. Natsir. 2001. Kamus Kimia Arti dan Penjelasan Istilah. Jakarta:
Gramedia

Aswad.2001.Kimia Untuk Universitas. Jakarta: Erlangga

Bernaseoni,G. 2005. Teknologi Kimia. Jakarta: PT Padya Pranita

Keenan, Charles W, dkk. 2002. Kimia Untuk Universitas Jilid 2. Jakarta: Erlangga

McNair & E.J.Bonelli, 1988, Dasar Kromatografi Gas, Penerbit ITB

Bandung

Mulya Suryadarma, dkk. 2004, Pengembangan Metode Analisis,

Airlangga Press, Surabaya.

Mulyadi. 2006. Pengenalan Ilmu Kimia. Jakarta: Bumi aksara

Skoog, Doughlas, A and James J Leary, 1992, Principles of

Instrumental Analysis, Saunders College Publishing, New York.
Sudjadi.1988.Metode Pemisahan.: Yogyakarta: Konsius

Synder, L.R,J.J. Kirkland, dan J.L.Glajch. 1997. HPLC Method Development.

New York: John Willey dan Sons

Syukri. 2000. Kimia Dasar 3. Bandung: ITB Press

Watson, G David. 2005. Analisis Farmasi edisi 2. Jakarta: Buku Kedokteran

63